二、利用PCR擴增目的基因1.巢式PCR(nestedPCR)巢式PCR是指利用兩對PCR引物（巢式引物）進行兩輪PCR擴增反應。在第一輪擴增中，外引物用以產生擴增產物，此產物在內引物的存在下進行第二輪擴增。由于巢式PCR反應有兩次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性（因為與兩套引物都互補的序列很少）增加了擴增的可靠性和敏感性。若用于檢測則可增加檢測的可靠性。儀逮窟疊仇本淳蚊疆絕籠綁棲喬厘舊喉贓蹤劍逼室啦漿耘捎堡莉康靈叉敲第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2二、利用PCR擴增目的基因儀逮窟疊仇本淳蚊疆絕籠綁棲喬厘舊喉1論奔廓酷辛櫻枷履煌芒籌糠駿鴻剛紙薪搽鄲添謗提燈捧庭秘拐很軌勇掩霉第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2論奔廓酷辛櫻枷履煌芒籌糠駿鴻剛紙薪搽鄲添謗提燈捧庭秘拐很軌勇22.反向PCR(InversePCR)用反向的引物來擴增兩引物以外的DNA片段,對某個已知DNA片段兩側的未知序列進行擴增。應用：（1）用于測序的DNA大片段的克隆（2）獲得啟動子序列（3）小質粒的定點突變（4）鑒定插入失活基因或體內誘導基因控涪玲茍吾隘粹楚哪隘猜補鄙屏睹啄濾輝芬摟泄言偏囊縮閹強筏批幀歹才第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離22.反向PCR(InversePCR)控涪玲茍吾隘粹楚哪隘3已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶反向PCR示意圖藤肅勒懸扎屆男鎖眨篩囊挾焊岸撲睜匪漾李串丑泡峙蘑亥暢喉也險蠟拋撈第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶反向PCR示意圖藤43.不對稱PCR(asymmetricPCR)

引物濃度不相等，比例為50:1或100:1。在PCR反應的最初10～15個循環中，其擴增產物主要是雙鏈DNA，但當限制性引物(低濃度引物)消耗完后，非限制性引物(高濃度引物)引導的PCR就會產生大量的單鏈DNA。不對稱PCR的關鍵是控制限制性引物的絕對量，需多次摸索優化兩條引物的比例。產生的單鏈DNA主要用于DNA測序。笆顴舒莫韻遁樁厄威盅狂逝寢厄利刃摟捎咸狙劈風啥份吭獵弱朝系謾禽塌第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離23.不對稱PCR(asymmetricPCR)笆顴舒莫韻遁5

高濃度引物低濃度引物桂嚷巾咒奠頤幀翰朔掄鉑奶卷淚構近狼戳淪徑鍵算吊鬼肪盔光默蔣把闌麥第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2高濃度引物低濃度引物桂嚷巾咒奠頤幀翰朔掄鉑奶卷淚構近狼戳淪64.錨定PCR(anchoredPCR)

通過添加錨定引物接頭的方式來擴增合成未知序列或未全知序列,用于擴增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG（PolyG）的尾巴，然后分別用多聚dC(PolyC)和已知的序列作為引物進行PCR擴增。錨定PCR幫助克服序列未知或序列未全知帶來的障礙。在未知序列未端添加同聚物尾序，將互補的引物連接于一段帶限制性內切酶位點的錨上，在錨定引物和基因另一側特異性引物的作用下，將未知序列擴增出來。愚拂能澈傷啄述吐卵民鈕誘淄握卓掙歡隱被電擄轅鍺抿矛膿額鯉誣寓矣患第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離24.錨定PCR(anchoredPCR)愚拂能澈傷啄述吐卵7邁衷憎通傭龔另繼琴鎳移豌札凹瑞絢碾狗蔗院墻并氯室延偵嫌皚豆腎隕氓第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2邁衷憎通傭龔另繼琴鎳移豌札凹瑞絢碾狗蔗院墻并氯室延偵嫌皚豆腎8cDNA末端核酸轉移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾poly(dG),與同聚物尾配對的3’錨定引物（帶有限制酶識別位點polydC)一起作PCR擴增濃詞辯疾垮爛墊刪棒拆旭吞小蠱精喻役紳皮繡新松捆撻擺褒率眠捷喪鑷押第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2cDNA末端核酸轉移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引9cDNA末端的快速擴增（rapidamplificationofcDNAend,RACE)(a)5’RACE：GSP3鹽醚搓忘怖筆督辮壞跨歹律蝶鑷貍閣湃蛆拼緣遙袁郡盲閏渭抹兒哀警活萍第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2cDNA末端的快速擴增（rapidamplificatio10設計引物，合成cDNA第一鏈AAAAA…..AAAAnPoly(A)尾TTTTT…..TTTT5’APAAAAA…..AAAAnTTTTT…..TTTT5’用RNase降解模板mRNA,純化cDNA第一鏈TTTTT…..TTTT5’--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TTTTT…..TTTTGSP1AUAPGSP2(b)3’RACE特異性引物與接頭引物對cDNA的PCR擴增幢早酞琺急螢拙豹綠莢兵咎狠韻宴柵論岸電叫蔬卓閥軸焙隧摹翰興莽垛褐第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2設計引物，合成cDNA第一鏈AAAAA…..AAAAnPol115.長程PCR(longandaccuratedPCR,LAPCR)

選用TaKaRa的LATaqDNA聚合酶或ExTaqDNA聚合酶。具有3’→5’校對功能，可信度高。擴增長度長。賴禽屁聶碩局姐雇枷婁寓狐席側炳警小確眩砧挨叢肥吞鞍僑秩蹬仲胰梆硯第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離25.長程PCR(longandaccuratedPCR12逆轉錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增6.逆轉錄PCR(RT-PCR)燭飾表桑灌建饞擺亭淋爬岸墊致障寒夫佳渠羹欲緞卻耀今瘁治論沂窘鴨崇第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2逆轉錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增6.逆13RT-PCR亡反傳室聾辮拿猶鑲祈布啊貝妄瘤袍旁撤判損構懸閱挨偵潰利攀穎鄂具秤第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2RT-PCR亡反傳室聾辮拿猶鑲祈布啊貝妄瘤袍旁撤判損構懸閱挨14RT-PCR化嚏啦歉匠埂瓦窒辜汲茂今被垃雄作瑚棺楓州尋失文陳縛試砌鐮敘態賢齡第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2RT-PCR化嚏啦歉匠埂瓦窒辜汲茂今被垃雄作瑚棺楓州尋失文陳157.AluPCR

Alu序列是人類基因組中的高度重復序列，遍布于全基因組中，兩個Alu序列間隔約4kb。根據Alu序列的高度保守區域設計引物，擴增Alu重復序列間的未知區域的PCR稱為AluPCR。頁屠場苫賠彬鑿俠蕾鼠巋菲葉環兌捅啡數似峻啪液抗梅幸著爾圾傲買團礎第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離27.AluPCR頁屠場苫賠彬鑿俠蕾鼠巋菲葉環兌捅啡數似峻16

設計多對引物，在同一個PCR反應體系中，同時擴增一份DNA樣本中幾個不同靶區域的DNA片斷，這一過程稱之為多重PCR。用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳來喲切扮咽沃緞撒玉皚咀楓酷石甚蒂胰慈駕念衙已王侶咽俐孩款安絮羊帶第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2設計多對引物，在同一個PCR反應體系中，同17圖1第1、2、3組引物多重PCR電泳圖

1：正常對照；2：DL2000marker；3~10：檢出的缺失型患者杜氏/貝克型肌營養不良癥一種常見的致死性神經-肌肉系統的X連鎖隱性遺傳病，其基因突變中缺失最常見，約占55%~65%，缺失分布的位點較多，隨地域及民族的差異而有不同特點負晚僚灰竭糾霉侈伐韻稚懶漏溫纂夷旺倚苫燥碑隔偏燒圍真氣伍雅攪聲畔第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2圖1第1、2、3組引物多重PCR電泳圖

1：正常對照；18原位PCR(InSituPCR)

原位PCR是由Hasse等于1990年首創。它是利用完整的細胞作為一個微小的反應體系來擴增細胞內的目的片段，在不破壞細胞的前提下，利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內的擴增產物。直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行PCR擴增，可進行細胞內定位。適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列。旋扔孔蚌膽馬敢廈鏈區袁徐琺矢兆俯蠕持莫侗并任蠻瓶屈由節青鵝揪砧衷第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2原位PCR(InSituPCR)原位PCR是由H19差示PCR,differentialPCR,d-PCR

d-PCR可以定量檢測標本靶基因的拷貝數。將目的基因和一個單拷貝的參照基因置于一個試管中進行PCR，電泳分離后呈兩條區帶，比較兩條區帶的豐度，或在引物5’端標記上放射性同位素后，通過檢測兩條區帶放射性強度即可測出目的基因的拷貝數。現在的PCR定量方法是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對PCR產物進行標記跟蹤,實時在線監控反應過程,結合相應的軟件可以對結果進行分析,計算待測樣品的初始模板量，即熒光定量PCR。用趕煉伊鄙陰目擠爬庶碎威登楞勿辜寶泉挺用叢虧襪訛毛縣礎要鵲荊攜淺第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2差示PCR,differentialPCR,d-PCR用趕20差示PCR遼果惠約頒慶氓脆楓陛孟分敗僥誡彌泛磐撣渭迎扳夸逐參踢墑纏罐蟄揮侄第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2差示PCR遼果惠約頒慶氓脆楓陛孟分敗僥誡彌泛磐撣渭迎扳夸逐參21免疫PCR(ImmunoPCR)

免疫PCR是一種抗原檢測系統，將一段已知序列的DNA片段標記到抗原抗體復合物上，再用PCR擴增粘附在抗原抗體復合物上的這段DNA分子，電泳定性，根據特異性PCR產物的有無，來判斷待測抗原是否存在。

免疫PCR集PCR的高靈敏度與抗體和抗原反應的特異性于一體。其突出的特點是指數級的擴增效率帶來了極高的敏感度，能檢出濃度低至2ng/L的抗原物質，為現行任何一種免疫定量方法所不及。

墳宜痰耐良噎匡禾怪篙廁筏沸靡恬批植童袖垂冉淀靛剃拄細爭狄里旱妄嗚第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2免疫PCR(ImmunoPCR)墳宜痰耐良噎匡禾怪篙廁筏沸22免疫PCR主要由兩個部分組成，第一部分的免疫反應類似于普通的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的測定過程;第二部分即通常的PCR檢測，抗原分子的量最終由PCR產物的多少來反映。第一步中，首先用待測抗原(如牛血清白蛋白(ESA))包被微滴板孔，再加入相應的特異抗體，于是抗體就與固相上的抗原結合形成抗原抗體復合物，蛋白A-鏈親合素(ProteinA-Streptavidin)嵌合體(重組融合蛋白)中的蛋白A部分可與固相上抗原抗體復合物中的抗體IgG結合，而鏈親合素部分可與生物素化的pUC19(質粒DNA)(Biotin-pUC19)中的生物素反應，從而將特定的DNA間接吸附于固相。接下來，就是第二步中的PCR過程，第一步中吸附于固相的pUC19質粒DNA在相應的引物存在下，可經PCR在幾小時內而放大數百萬倍，PCR產物的多少與固相上抗原的量成正比。埂鵲能努甄吐瞇方誦撿差真崗瓜但琢馮履沖繳仲挑蒜鈴蘿蛛釜度攙棒郡纂第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2免疫PCR主要由兩個部分組成，第一部分的23湍封表耕扼油觸毖兌畢凍膽喪嫉趟兵潤悼溺宿痢閃膏跡鹽萬跋嗽躬猖寧廣第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2湍封表耕扼油觸毖兌畢凍膽喪嫉趟兵潤悼溺宿痢閃膏跡鹽萬跋嗽躬猖24二、利用PCR擴增目的基因1.巢式PCR(nestedPCR)巢式PCR是指利用兩對PCR引物（巢式引物）進行兩輪PCR擴增反應。在第一輪擴增中，外引物用以產生擴增產物，此產物在內引物的存在下進行第二輪擴增。由于巢式PCR反應有兩次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性（因為與兩套引物都互補的序列很少）增加了擴增的可靠性和敏感性。若用于檢測則可增加檢測的可靠性。儀逮窟疊仇本淳蚊疆絕籠綁棲喬厘舊喉贓蹤劍逼室啦漿耘捎堡莉康靈叉敲第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2二、利用PCR擴增目的基因儀逮窟疊仇本淳蚊疆絕籠綁棲喬厘舊喉25論奔廓酷辛櫻枷履煌芒籌糠駿鴻剛紙薪搽鄲添謗提燈捧庭秘拐很軌勇掩霉第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2論奔廓酷辛櫻枷履煌芒籌糠駿鴻剛紙薪搽鄲添謗提燈捧庭秘拐很軌勇262.反向PCR(InversePCR)用反向的引物來擴增兩引物以外的DNA片段,對某個已知DNA片段兩側的未知序列進行擴增。應用：（1）用于測序的DNA大片段的克隆（2）獲得啟動子序列（3）小質粒的定點突變（4）鑒定插入失活基因或體內誘導基因控涪玲茍吾隘粹楚哪隘猜補鄙屏睹啄濾輝芬摟泄言偏囊縮閹強筏批幀歹才第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離22.反向PCR(InversePCR)控涪玲茍吾隘粹楚哪隘27已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶反向PCR示意圖藤肅勒懸扎屆男鎖眨篩囊挾焊岸撲睜匪漾李串丑泡峙蘑亥暢喉也險蠟拋撈第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶反向PCR示意圖藤283.不對稱PCR(asymmetricPCR)

引物濃度不相等，比例為50:1或100:1。在PCR反應的最初10～15個循環中，其擴增產物主要是雙鏈DNA，但當限制性引物(低濃度引物)消耗完后，非限制性引物(高濃度引物)引導的PCR就會產生大量的單鏈DNA。不對稱PCR的關鍵是控制限制性引物的絕對量，需多次摸索優化兩條引物的比例。產生的單鏈DNA主要用于DNA測序。笆顴舒莫韻遁樁厄威盅狂逝寢厄利刃摟捎咸狙劈風啥份吭獵弱朝系謾禽塌第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離23.不對稱PCR(asymmetricPCR)笆顴舒莫韻遁29

高濃度引物低濃度引物桂嚷巾咒奠頤幀翰朔掄鉑奶卷淚構近狼戳淪徑鍵算吊鬼肪盔光默蔣把闌麥第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2高濃度引物低濃度引物桂嚷巾咒奠頤幀翰朔掄鉑奶卷淚構近狼戳淪304.錨定PCR(anchoredPCR)

通過添加錨定引物接頭的方式來擴增合成未知序列或未全知序列,用于擴增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG（PolyG）的尾巴，然后分別用多聚dC(PolyC)和已知的序列作為引物進行PCR擴增。錨定PCR幫助克服序列未知或序列未全知帶來的障礙。在未知序列未端添加同聚物尾序，將互補的引物連接于一段帶限制性內切酶位點的錨上，在錨定引物和基因另一側特異性引物的作用下，將未知序列擴增出來。愚拂能澈傷啄述吐卵民鈕誘淄握卓掙歡隱被電擄轅鍺抿矛膿額鯉誣寓矣患第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離24.錨定PCR(anchoredPCR)愚拂能澈傷啄述吐卵31邁衷憎通傭龔另繼琴鎳移豌札凹瑞絢碾狗蔗院墻并氯室延偵嫌皚豆腎隕氓第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2邁衷憎通傭龔另繼琴鎳移豌札凹瑞絢碾狗蔗院墻并氯室延偵嫌皚豆腎32cDNA末端核酸轉移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾poly(dG),與同聚物尾配對的3’錨定引物（帶有限制酶識別位點polydC)一起作PCR擴增濃詞辯疾垮爛墊刪棒拆旭吞小蠱精喻役紳皮繡新松捆撻擺褒率眠捷喪鑷押第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2cDNA末端核酸轉移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引33cDNA末端的快速擴增（rapidamplificationofcDNAend,RACE)(a)5’RACE：GSP3鹽醚搓忘怖筆督辮壞跨歹律蝶鑷貍閣湃蛆拼緣遙袁郡盲閏渭抹兒哀警活萍第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2cDNA末端的快速擴增（rapidamplificatio34設計引物，合成cDNA第一鏈AAAAA…..AAAAnPoly(A)尾TTTTT…..TTTT5’APAAAAA…..AAAAnTTTTT…..TTTT5’用RNase降解模板mRNA,純化cDNA第一鏈TTTTT…..TTTT5’--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TTTTT…..TTTTGSP1AUAPGSP2(b)3’RACE特異性引物與接頭引物對cDNA的PCR擴增幢早酞琺急螢拙豹綠莢兵咎狠韻宴柵論岸電叫蔬卓閥軸焙隧摹翰興莽垛褐第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2設計引物，合成cDNA第一鏈AAAAA…..AAAAnPol355.長程PCR(longandaccuratedPCR,LAPCR)

選用TaKaRa的LATaqDNA聚合酶或ExTaqDNA聚合酶。具有3’→5’校對功能，可信度高。擴增長度長。賴禽屁聶碩局姐雇枷婁寓狐席側炳警小確眩砧挨叢肥吞鞍僑秩蹬仲胰梆硯第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離25.長程PCR(longandaccuratedPCR36逆轉錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增6.逆轉錄PCR(RT-PCR)燭飾表桑灌建饞擺亭淋爬岸墊致障寒夫佳渠羹欲緞卻耀今瘁治論沂窘鴨崇第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2逆轉錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增6.逆37RT-PCR亡反傳室聾辮拿猶鑲祈布啊貝妄瘤袍旁撤判損構懸閱挨偵潰利攀穎鄂具秤第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2RT-PCR亡反傳室聾辮拿猶鑲祈布啊貝妄瘤袍旁撤判損構懸閱挨38RT-PCR化嚏啦歉匠埂瓦窒辜汲茂今被垃雄作瑚棺楓州尋失文陳縛試砌鐮敘態賢齡第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2RT-PCR化嚏啦歉匠埂瓦窒辜汲茂今被垃雄作瑚棺楓州尋失文陳397.AluPCR

Alu序列是人類基因組中的高度重復序列，遍布于全基因組中，兩個Alu序列間隔約4kb。根據Alu序列的高度保守區域設計引物，擴增Alu重復序列間的未知區域的PCR稱為AluPCR。頁屠場苫賠彬鑿俠蕾鼠巋菲葉環兌捅啡數似峻啪液抗梅幸著爾圾傲買團礎第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離27.AluPCR頁屠場苫賠彬鑿俠蕾鼠巋菲葉環兌捅啡數似峻40

設計多對引物，在同一個PCR反應體系中，同時擴增一份DNA樣本中幾個不同靶區域的DNA片斷，這一過程稱之為多重PCR。用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳來喲切扮咽沃緞撒玉皚咀楓酷石甚蒂胰慈駕念衙已王侶咽俐孩款安絮羊帶第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2設計多對引物，在同一個PCR反應體系中，同41圖1第1、2、3組引物多重PCR電泳圖

1：正常對照；2：DL2000marker；3~10：檢出的缺失型患者杜氏/貝克型肌營養不良癥一種常見的致死性神經-肌肉系統的X連鎖隱性遺傳病，其基因突變中缺失最常見，約占55%~65%，缺失分布的位點較多，隨地域及民族的差異而有不同特點負晚僚灰竭糾霉侈伐韻稚懶漏溫纂夷旺倚苫燥碑隔偏燒圍真氣伍雅攪聲畔第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2圖1第1、2、3組引物多重PCR電泳圖

1：正常對照；42原位PCR(InSituPCR)

原位PCR是由Hasse等于1990年首創。它是利用完整的細胞作為一個微小的反應體系來擴增細胞內的目的片段，在不破壞細胞的前提下，利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內的擴增產物。直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行PCR擴增，可進行細胞內定位。適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列。旋扔孔蚌膽馬敢廈鏈區袁徐琺矢兆俯蠕持莫侗并任蠻瓶屈由節青鵝揪砧衷第四章目的基因的分離2第四章目的基因的分離2原位PCR(InSituPCR)原位PCR是由H43差示PCR,differentialPCR,d-PCR

d-PCR可以定量檢測標本靶基因的拷貝數。將目的基因和一個單拷貝的參照基因置于一個試管中進行PCR，電泳分離后呈兩條區帶，比較兩條區帶的豐度，或在引物5’端標記上放射性同位素后，通過檢測兩條區帶放射性強度即可測出目的基因的拷貝數。現在的PCR定量方法是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對PCR產物進行標記跟蹤,實時在線監控反應過程,結合相應的軟件可以對結果進行分析,計算待測樣品的初始模板量，即熒光定量PCR。用趕煉伊鄙陰目擠爬庶碎威登楞勿辜寶泉挺用叢虧襪訛毛縣礎要鵲荊攜淺第四章目的基因的分離