關于流式細胞儀基本原理及應用第1頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-2-流式細胞儀和流式細胞術－概述流式細胞儀的工作原理和測量參數流式細胞儀在臨床檢測和科研中的應用免疫學檢測和科研應用血液病檢測和科研應用腫瘤學檢測和科研應用流式細胞儀的基本工作原理以及在基礎和臨床科研中的應用第2頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-3-一、流式細胞儀和流式細胞術的基本概念流式細胞儀(FlowCytometer，FCM):是集合光電子物理，光電測量技術，液流技術，計算機技術等現代高科技技術為一體的細胞測量和分析儀器。第3頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-4-一、流式細胞儀和流式細胞術的基本概念流式細胞術(FlowCytometry，FCM):是應用流式細胞儀，對處于快速流動液體中的細胞或生物顆粒進行多參數、快速測量和定量分析，以及分選的技術。第4頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-5-一、流式細胞儀和流式細胞術－特點多參數測量和分析（散射光和熒光）；快速測量和分析每秒可達1000-10000個細胞分選純度可達99%以上。獲取的數據分析結果更具有統計學意義；通常測量的對象如各種細胞細胞必須處在單個細胞懸液中。此外，也可測量微生物等生物顆粒，或者工合成微球非生物顆粒，第5頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-6-臺式機——FACSCalibur雙激光

488nm 635nm四熒光參數分選、濃縮系統第6頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五7第7頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-8-大型機——FACSVantageSE科研型八熒光參數高速分選多路分選第8頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-9-

流式細胞儀與熒光顯微鏡比較

流式細胞儀熒光顯微鏡

流動的細胞靜止的細胞樣本數量大數量少高速分選樣本難以再利用細胞群體特征量分布可揭示細胞內部結構信息第9頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-10-二、流式細胞儀的工作原理和測量參數光路系統：

激光光源，光路系統（透鏡、濾光片）電子系統：光電倍增管（PMT），補償電路液流系統：

鞘液系統，樣品流動系統數據系統：計算機，數據測量和分析軟件。細胞分選系統（一）流式細胞儀的結構

第10頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-11-流式細胞儀－光路系統激光(Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長、單一方向、同步的穩定光照激光波長:488nm,635nm光收集系統是由若干組透鏡,濾波片,小孔組成，將產生的光信號引導至檢測器第11頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-12-光路系統第12頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-13-InjectorTip第13頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-14-InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid第14頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-15-流式細胞儀－光學系統激發光源與熒光標記物第15頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-16-光學檢測信號第16頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-17-流式細胞儀的光學系統FACSCalibur第17頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-18-流式細胞儀－液流系統第18頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-19-液流系統：鞘液系統＋樣品流動系統第19頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-20-流式細胞儀的電子系統

信號檢測和分析當細胞攜帶熒光素,通過激光照射區,受到激發產生不同波長的、代表細胞內不同物質的熒光信號熒光信號由光電接收器接收，轉變為電脈沖信號，電脈沖信號經A/D轉換成數字信號數字信號傳送到計算機，進行儲存、作圖和統計分析第20頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-21-數據系統第21頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-22-（二）流式細胞儀可檢測的細胞參數細胞結構細胞大小細胞顆粒性程度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量細胞功能細胞表面蛋白抗原細胞胞漿內蛋白性抗原細胞內細胞因子細胞增殖細胞內鈣離子濃度二、流式細胞儀的工作原理和測量參數第22頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-23-（二）流式細胞儀可檢測的細胞的參數：

散射光信號前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

入射光的前向

(5)散射光信號,可反映：細胞相對大小及其表面積側向角散射光（SSC,SideScatter）

入射光90角的散射光信號，可反映：細胞顆粒性程度

（胞內成分和構造和表面結構的復雜性）第23頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-24-散射光信號前向角散射光－FSCFALSSensorLaser第24頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-25-散射光信號側向角散射光－SSCFALSSensor90LSSensorLaser第25頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-26-流式細胞的基本信息:“形態”第26頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-27-第27頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-28-外周全血細胞（紅細胞溶解后）

以散射光表示的雙參數點圖第28頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-29-外周全血細胞（紅細胞溶解后）

以散射光表示的雙參數點圖中性粒細胞單核細胞淋巴細胞第29頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-30-（二）流式細胞檢測細胞參數:

特征信息－熒光（Fluorescence）信號熒光素吸收激光（激發光波長）能量熒光素將吸收能量釋放，轉換為釋放較入射光波長更長的光量子（發射光波長）熒光素與特異抗體結合（熒光抗體）熒光抗體與細胞抗原結合越多，產生熒光信號越強 熒光素與細胞核酸結合，熒光強度反映核酸含量第30頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-31-（二）流式細胞檢測細胞參數:

特征信息－熒光（Fluorescence）信號Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)FL1（第一熒光）-FITC(異硫氰酸熒光素）FL2（第二熒光）-PE（藻紅蛋白）FL3（第三熒光）-PerCP,PeCy5等PL4（第四熒光）-APC（藻青蛋白）第31頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-32-熒光信號FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)第32頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-33-第33頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-34-熒光信號雙色直接染色第34頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-35-（三）流式細胞儀分析數據常見圖形：

（二維）點陳圖(DotPlot)適用于：雙參數分析第35頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-36-（三）流式細胞儀分析數據常見圖形：

直方圖(HistogramPlot)適用于：單參數分析僅需要觀察某個熒光強度的變化第36頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-37-流式細胞術檢測細胞的熒光標記方法單標：

一種單抗:FL1,FSC,SSC（三參數）雙標：兩種單抗：FL1,FL1,FSC,SSC（四參數）三標：三種單抗：FL1,FL2,FL3,FSC,SSC（五參數）四標－四種熒光標記抗體：四種單抗：FL1,FL2,FL3,FL4,FSC,SSC（六參數）第37頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-38-淋巴細胞亞群分析細胞凋亡

腫瘤學移植免疫三流式細胞儀在臨床檢測和科研中的應用血小板其它第38頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-39-淋巴細胞亞群分析第39頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-40-AdhesionMetabolic第40頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-41-第41頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-42-第42頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-43-

T淋巴細胞淋巴細胞亞群檢測：

Tcells,Tsubsets,NKcells,Bcells第43頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-44-淋巴細胞亞群T淋巴細胞(CD3+)名稱功能CD3+CD4+輔助性/誘導性T細胞(Th/Ti)輔助和誘導細胞免疫和體液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-輔助性T細胞(Th)誘導性T細胞(Ti)輔助細胞免疫和體液免疫誘導細胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細胞(Ts/Tc)抑制免疫反應/殺傷異源細胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T細胞(Ts)殺傷性T細胞(Tc)抑制細胞和體液免疫細胞毒性T細胞CD3+CD4+CD8+活化的T細胞在T細胞惡性增生時升高CD3+CD4-CD8-有調節功能的T細胞,其表達/T細胞受體(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/靜止的T淋巴細胞當免疫系統沒有能力更新輔助性或抑制性/細胞毒性淋巴細胞的祖細胞時此細胞亞群較低CD45RA-CD45RO+記憶性T淋巴細胞病菌感染時升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T細胞,感染時升高感染時升高第44頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-45-淋巴細胞亞群活化T淋巴細胞名稱功能CD3+HLA-DR+活化T細胞CD4+HLA-DR+活化的輔助性/誘導性T細胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細胞CD4+CD25+活化的輔助性/誘導性T細胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味著HIV患者的預后較差B淋巴細胞(19+)CD19+CD23+活化的B細胞過敏患者中升高CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高CD19+CD5+CD23+慢性B細胞白血病及單克隆B淋巴細胞NK細胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病時降低,而病毒感染時升高CD3+CD57+CMV(巨細胞病毒)感染的強烈征兆第45頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-46-淋巴細胞亞群與疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫性疾病系統性紅斑狼瘡類風濕性關節炎自身免疫性溶血性貧血重癥肌無力免疫缺陷病愛滋病病毒感染傳染性單核細胞增多癥慢性活動性肝炎活動性肝硬化腫瘤消化道癌,肝癌,肺癌再生障礙性貧血粒細胞減少癥第46頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-47-淋巴細胞亞群檢測意義疾病機理研究

疾病輔助診斷移植后免疫檢測治療方案的確定及療效評價CD25高于正常值5-10%,表明即將或已發生排斥CD4/CD8比值下降提示并發兇險感染

<0.2時,必須停用免疫抑制劑CD2+HLA-DR+增加5-10%,且不伴有CD25的增加,提示巨細胞病毒感染慢性疲勞,感染后綜合征,纖維肌痛,類風濕性關節炎,過敏等

疾病預防第47頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-48-淋巴細胞亞群檢測意義

Control（n=20)ActiveSLE(n=17)StableSLE(n=13)CD370.4±5.8765.8±10.968.5±8.95CD435.0±5.7022.1±4.15**34.5±4.23CD827.9±5.7345.7±9.58**32.7±9.01CD4/CD81.27±0.140.43±0.12**1.05±0.26*NK17.8±5.484.37±3.31**7.59±5.01**鑒別活動期和非活動期SLE第48頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-49-HIVANDAIDS第49頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-50-Th1/Th2細胞第50頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-51-Th1/Th2細胞Th1型細胞因子介導細胞免疫反應引起遲發型過敏反應、巨噬細胞活化、局部炎癥刺激來源：病毒、某些細菌Th2型介導體液免疫反應引起B細胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、促進I型變態反應（過敏反應）刺激來源：多細胞寄生蟲、過敏原第51頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-52-Th1/Th2細胞PMA+Ionomycin刺激4-6hr第52頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-53-流式細胞儀檢測胞內細胞因子

新鮮分離PBMC

加PMA＋Io刺激后6h測定胞內細胞因子IL-4和IFN-g

檢測免疫細胞表型和結合檢測胞內細胞因子：操作和分析方法；

第53頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-54-四色標記胞內因子FCM檢測第54頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-55-Th1/Th2失衡相關疾病嗜酸性細胞增多和IgE升高相關疾病

Ommen’sSyndrome(Ommen’s綜合征)HyperosinophilicSyndrome(高嗜曙紅細胞綜合征)Kimura’sDisease(Kimura’s疾病)Well’sSyndrome(Well’s綜合征)傳染病

病毒性疾病

人類免疫缺陷性病毒感染和愛滋病(AIDS)

麻疹

呼吸道合胞體病毒感染

慢性活動性乙型肝炎病毒感染

分枝桿菌和其它細菌感染

麻瘋病/肺結核

鳥結核分枝桿菌復合感染滑膜炎反應性關節炎

淋病和梅毒

第55頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-56-Th1/Th2失衡相關疾病寄生蟲病

原寄生蟲感染：皮膚和內臟利什曼病

蠕蟲病：絲蟲病和血吸蟲病真菌性疾病

過敏性支氣管肺霉菌病

念珠菌病

隱球菌病

類球孢子菌病球孢子菌病

組織胞漿菌病惡性腫瘤

皮膚基底細胞和鱗細胞癌

SezarySyndrome(Sezary綜合征)

淋巴瘤

EBV相關的B細胞和非何杰金氏淋巴瘤

何杰金氏淋巴瘤

大細胞退行性(CD30+)淋巴瘤

多發性骨髓瘤和Castleman’s綜合征

卡氏肉瘤第56頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-57-Th1/Th2失衡相關疾病變應性疾病

皮膚性哮喘

變應性哮喘

春季結膜炎炎性和自身免疫性疾病

巨細胞(暫時性的)動脈炎

系統性紅斑狼瘡

類風濕性關節炎

自身免疫性甲狀腺疾病

類肉瘤病

銀屑病(牛皮癬)IgA腎病

多發性硬化第57頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-58-Th1/Th2細胞檢測意義疾病治療發病機制研究使用Th1和Th2相關的細胞因子

IFN-治療麻瘋病

用抗Th1和Th2相關細胞因子或其受體的抗體

抗IL-4抗體治療真菌和寄生蟲感染

使用調節Th2/Th2細胞因子平衡的藥物:

薩力多胺(Thaliodomide)治療巨細胞動脈炎疾病治療監測第58頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-59-

腫瘤學第59頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-60-腫瘤發生發展第60頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-61-02004006008001000PI熒光強度(DNA含量)DNA含量分析2N4NCountsG0/G1G2/MS異倍體第61頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-62-DNA含量分析70%人類癌癥中存在著異倍體或細胞周期的改變1.RossJS.DNAPloidyandCellCycleAnalysisinPathology.NewYork:Igaku-Shoin;1996:47-60DNA倍體和S期比例--指導治療[2]卵巢癌，乳腺癌，結腸癌，子宮內膜癌，原發部位不明的癌癥--早期(I/II期)DNA倍體和DNA指數--預后長期和無病生存期[2]卵巢癌--晚期2.TheRecommendMedicareNationalCoveragePolicyforFlowCytometry.HCFAWebsite,1999第62頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-63-P53/Bcl-2第63頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-64-P53乳腺癌

與病理學分級有關,并與乳腺癌的淋巴結轉移顯著相關大腸腫瘤

早期發現大腸癌胃癌

與預后相關肝細胞癌

與組織分級,腫瘤預后,轉移及腫瘤大小密切相關第64頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-65-Bcl-2Bcl-2在正常組織中的表達

造血系統細胞—淋巴,單核細胞等受激素或生長因子調節的腺上皮—前列腺上皮,子宮內膜等干細胞或增值細胞—皮膚的基底細胞,腸上皮壽命長的分裂細胞—神經元胚胎組織Bcl-2在腫瘤組織中的表達

腎臟腫瘤—腎癌,腎盂乳頭瘤,Wilms瘤,腎嗜酸細胞瘤前列腺癌

B細胞性淋巴瘤乳腺癌(43%)

甲狀腺癌第65頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-66-nm23nm23與多種腫瘤的轉移及預后相關

肝細胞癌甲狀腺腫瘤乳腺癌結腸癌肉瘤第66頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-67-CD44(CD44s/CD44v)第67頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-68-腫瘤多藥耐藥性(MDR)檢測P-gp在腫瘤組織中的表達

乳腺癌,膀胱癌,胃癌,食管癌,卵巢癌,前列腺癌等化療前高表達化療后高表達

腎細胞癌,結腸癌,肝癌,腎上腺皮質癌,胰腺癌等化療前低表達

非何杰金氏淋巴瘤,成神經細胞瘤,急性髓白血病等化療不敏感化療敏感化療不敏感第68頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-69-乳腺癌石蠟切片脫臘ER(雌激素受體)ER抗體染色酶解流式檢測固定(多聚甲醛)破膜(70%甲醇)細胞第69頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-70-Cyclin(細胞周期蛋白)第70頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-71-細胞凋亡第71頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-72-細胞凋亡分析

第72頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-73-DNA斷裂第73頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-74-乳腺癌Fas/FasL與疾病慢性病毒性肝炎惡性腫瘤細胞-黑色素瘤、結腸癌、肺癌、肝癌等腦缺血后細胞凋亡自身免疫性疾病—系統性紅斑狼瘡Fas/FasL(CD95/CD95L)第74頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-75-乳腺癌Caspases早期細胞凋亡AnnexinV/PI第75頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-76-移植免疫第76頁，共90頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五-77-CD25高于正常值5-10%,表明即將或已發生排斥CD4/CD8比值下降提示并發兇險感染

<0.2時,必須停用免疫抑制劑CD2+HLA-DR+增加5-10%,