產α-淀粉酶菌株產酶培養基組成正交優化試驗目的要求了解正交試驗的基本原理、意義及在生物學研究領域的適用范圍和作用。掌握正交試驗設計一般基本方法和步驟，涉及因素、水平的選擇確定，正交表的選擇及因素水平在其中的合理安排。掌握正交試驗結果的極差分析方法，同時了解相關方差分析方法。基本原理利用正交試驗所選試驗的“均勻分散，齊整可比”特點，通過其中對部分試驗結果的分析，從而達到了解全面試驗的情況，最終完成用部分試驗來代替全面試驗的目的和結果。正交試驗知識介紹正交設計試驗的定義和特征定義：用正交表安排多因素試驗與分析試驗結果的方法，簡稱正交試驗法；是研究多因素多水平的一種設計方法，它是根據正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了“均勻分散，齊整可比”的特點。是一種高效率、快速、經濟的試驗設計方法。正交試驗設計的基本特點是：用部分試驗來代替全面試驗，通過對部分試驗結果的分析，了解全面試驗的情況。正交表日本著名的統計學家田口玄一將正交試驗選擇的水平組合列成表格，稱為正交表。

圖10-13因素3水平的全面試驗水平組合數為33=27，4因素3水平的全面試驗水平組合數為34=81，5因素3水平的全面試驗水平組合數為35=243，這在科學試驗中是有可能做不到的。

正交設計就是從選優區全面試驗點（水平組合）中挑選出有代表性的部分試驗點（水平組合）來進行試驗。上圖中標有試驗號的九個“(·)”，就是利用正交表L9(33)從27個試驗點中挑選出來的9個試驗點。即：（1）A1B1C1（2）A2B1C2（3）A3B1C3（4）A1B2C2（5）A2B2C3（6）A3B2C1（7）A1B3C3（8）A2B3C1（9）A3B3C2正交表的基本性質

1、正交性（1）任一列中，各水平都出現，且出現的次數相等（2）任兩列之間各種不同水平的所有可能組合都出現，且出現的次數相等

2、代表性一方面：（1）任一列的各水平都出現，使得部分試驗中包括了所有因素的所有水平；（2）任兩列的所有水平組合都出現，使任意兩因素間的試驗組合為全面試驗。另一方面：由于正交表的正交性，正交試驗的試驗點必然均衡地分布在全面試驗點中，具有很強的代表性。因此，部分試驗尋找的最優條件與全面試驗所找的最優條件，應有一致的趨勢。3、整齊可比性（1）任一列的各水平出現的次數相等；（2）任兩列間所有水平組合出現次數相等；這樣就使得任一因素各水平的試驗條件相同（整齊）。進一步保證了在每列因素各水平的效果中，最大限度地排除了其他因素的干擾。從而可以綜合比較該因素不同水平對試驗指標的影響情況（可比）。正交表的表示

以Ln（tq）代表正交表格式，則L代表正交表，n代表實驗次數，t代表因素水平數，q代表因素數。如L4（23）表示用此正交表可設計3個觀察因素，每個因素有2個水平，須進行4次實驗（完全試驗需要進行23=8個水平組合試驗）。又如L9(34)，完全試驗需要進行34=81個水平組合試驗。在分析測試中，常用的幾種正交表是L4(23)、L8(27)、L9(34)、L16(45)、L25(56)、L27(313)等。正交表的選擇依據在能容納所研究的因素數和因素水平數的前提下選用試驗次數最少的正交表來安排試驗。實際應用中所選擇的正交表的試驗次數不易太多，因素和因素水平不一定通過一次試驗全面考慮，可以通過多次試驗完成，否則會造成計算量的增大及分析工作的復雜性。試驗目的與要求試驗指標選因素、定水平因素、水平確定選擇合適正交表表頭設計列試驗方案試驗方案設計流程試驗結果分析進行試驗，記錄試驗結果試驗結果極差分析計算T值計算X值計算極差R繪制因素指標趨勢圖優水平因素主次順序優組合結論試驗結果分析：試驗結果方差分析列方差分析表，進行F檢驗計算各列偏差平方和、自由度分析檢驗結果，寫出結論正交試驗設計所包括的內容正交設計的因素水平表正交試驗表頭設計選用正交表及試驗方案試驗方案及其結果（包括直觀分析）因素各水平與試驗指標關系圖方差分析表重復試驗結果正交試驗結果的分析直觀分析——極差分析計算各因素各水平下試驗指標值的總和、平均值及因素水平平均值最大和最小之差值——極差，從而反映了各試驗因素的主次；優點是簡便、計算工作量小；缺點是判斷因素效應的精度不夠，也不能給出誤差的大小，即不能很好的判斷試驗結果存在的差異是因試驗誤差造成的，還是試驗真實的結果表現。方差分析建立在多因素方差分析基礎上，考慮了試驗誤差，從而反映了各因素對試驗結果影響的顯著性——試驗差異是否是因素的真實表現。因計算量較大及較復雜，可以通過相應的分析軟件（如SPSS、SAS、EXCEL等）進行計算及輔助分析完成。

表1正交設計的因素水平表

此表的目的：列表確定需要考察的因素和水平表2正交試驗表頭設計

此表的目的：所選正交表的各列和考察因素一一對應。表4試驗方案及其結果

因素各水平與測定指標關系圖表6方差分析表

（空D列，無重復）

注：F0.05（2，8）=4.46；F0.01（2，8）=8.65變異來源平方和自由度均方FA286216.9582143108.4790.783B1446223.1842723111.5923.955C279613.4592139806.7300.765誤差365675.9252182837.963

總變異2377729.5278

表7重復試驗結果

針對此次正交試驗的說明試驗設計中的因素問題可變因素——需要進行考察的因素；不變因素——不需要考察的因素，在試驗起始或過程中固定不變（相對而言）。基本條件的確定及操控——需要綜合設定，統籌準備，嚴格控制，試驗組之間保持不變。pH值在搖瓶發酵中的作用一般情況下（實驗室），只能做到起始pH的調整；試驗過程中的pH控制很難進行或精確控制；培養基經過滅菌后，有時會有一定變化（一般會變低）；所以試驗設置pH作為因素，可能在搖瓶發酵培養中達不到相應的目的。初次進行正交試驗時的要求設計可以先粗放一些，后面的工作可以越來越細；先找出影響大的因素，再進行細致研究；影響不大在后續試驗中不再考慮（需要注意因素之間的交互作用）；水平設置可以把梯度拉大（生物的適應是有一定容度的），這樣可以使結果更加明顯（直接可以把相關因素的水平設置為“0”）。裝液量作為因素時的要求裝液量的多少可以改變培養基溶解氧的多少（非定量的間接反映）；一般請用500ml三角瓶，這樣可以很好的進行設置；需要考慮培養過程中的蒸發量損耗。溫度設定及搖瓶轉速設定的問題搖瓶機及搖床的控制精度不夠和臺套數不足，溫度、轉速設定不夠精確（儀器之間相差較大），可能會帶來一些不清楚的影響，建議不要采用。盡量圍繞著培養基的組成來進行開展試驗。試驗設計的準備工作計算所需菌種量（種子培養基的準備）；正交試驗培養基的準備；配制過程中要細致，不要出錯，每組試驗一瓶一瓶配制，認真仔細檢查，共同的非可變因素可以統一配制后，分別加入；不要急于實施試驗，仔細推敲試驗方案；試驗時間，用倒推計算；試驗的基本安排確定因素、水平，選定L9（34）正交表。根據正交表安排，配制表中9個試驗號的培養基、1個初篩和復篩中使用的培養基（作為對照），共計10種培養基，滅菌后備用。準備接種用的液體活化菌,提前12-24小時接種培養；接種：9個試驗號培養基、1個對照培養基，共計10瓶，接種量2mL/瓶。37℃搖瓶培養3天（往復式振蕩培養100~120轉/分）。分別測定10組酶活力，結果采用極差分析和方差分析，得出結論。基本流程滅菌確定因素及水平選擇合適正交表結果分析配制培養基37℃搖瓶培養3天測定酶活力極差分析方差分析因素的主次關系、理論最優組合液體菌種活化12~14小時接種2mL/瓶滅菌備用培養基保藏斜面菌種接種1環于活化培養基方差分析表各因素水平差異的顯著性完成后結合試驗及分析結果進行重復試驗重復試驗

——結合2種情況安排相關試驗極差分析后得到的理論最優化組合；理論最優化組合是否出現在所用正交表組合中（實際試驗組合中）；①出現（說明理論和試驗有一定吻合），再找出正交表組合中出現的次優組合，2種組合的培養基各配制2~3瓶；②未出現，找出正交表組合中出現的最優組合（試驗），和理論最優組合的培養基各配制2~3瓶。相關培養基滅菌后，冷卻后接種液體活化菌種，搖瓶培養3天，測酶活力，結合測定結果進行綜合分析判斷。重復試驗后發酵液的處理合并測定酶活力后的發酵液于1個500mL三角瓶（選酶活力高的）；裝入6只100mL帶蓋離心管中，兩兩天平稱重配平（連蓋）；10000~12000轉/分鐘離心10min，收集上清液，放入密封容器中（500mL飲料瓶），蓋好蓋子密封；放入-20℃冰箱（柜），凍存備用；用時提前冷水浴溶化。重復試驗后發酵液的處理及酶的粗提取（粗酶粉的制備）流程酶活力高的發酵液合并離心（12000轉/分鐘，10分鐘測定發酵液酶活力-20℃冷凍保存收集上清液用時提前水浴溶化量取250mL放入1000mL離心瓶中離心瓶精確稱重加入2倍體積的-20℃預冷無水乙醇（500mL）混勻后冷凍離心（4000轉/分鐘，10分鐘）去上清乙醇混合液（統一收集）冷凍離心（4000轉/分鐘，10分鐘）再加入100mL-20℃預冷無水乙醇脫水處理輕搖后去上清乙醇液（統一收集）沉淀室溫真空干燥（備用）留樣凍存備以后比較分析試驗的基本安排一、下周停課，進行必要準備工作：1、分組自行設計正交試驗方案；2、完成以前實驗報告；3、下周星期一上交正交試驗方案及實驗報告。二、試驗過程的安排：1、上課時間準備正交試驗用培養基，接種；2、菌種的活化自己安排好（保證菌種正常）；3、具體測定時間的安排根據各組的試驗方案再定。SPSS用于正交試驗的數據分析數據的輸入及分析準備啟動SPSS，進入變量視