1、復習題為什么說基因工程技術是上世紀60 年代末70 年代初發展起來的？因為：（1）1967 年發現了連 接酶；（2）大腸桿菌的轉化技術是 1970 年獲得突破；（3）限制性內切核酸酶的分離始于 1970 年；（4） Berg在1972年構建了第一個重組的DNA分子。重組DNA的含義是什么？將一個生物的DNA片段插入到一個載體中，并引入到另一個生物體 中進行繁殖。限制性內切核酸酶的切割頻率？切割頻率是指限制性內切核酸酶在DNA分子中預測的切點數。 假定DNA分子中4種堿基的頻率相同，且限制性內切酶的識別位點隨機分布，那么任何一種限 制酶的切割頻率，理論上應為1/4n n為該限制酶識別的堿基數。什

2、么是細菌的限制-修飾系統？它有什么意義？細菌中有作用于同一 DNA 的兩種酶，即分解 DNA的限制酶和改變DNA堿基結構使其免遭限制酶分解的修飾酶,這兩種酶作用于同一DNA 的相同部位，把這兩種酶所組成的系統稱為R-M system。不同種的細菌或不同的細菌菌株具有 不同的限制酶和修飾酶組成的R-M system。修飾的本質是通過甲基化酶將DNA中某些堿基進 行甲基化修飾，由于宿主自身DNA上的這些位點進行了修飾，限制酶就不能進行切割，而外來 的DNA在相應的堿基上沒有被甲基化，宿主的限制酶通過對該位點的識別來分辨敵我，并將入 侵的外來DNA分子降解掉。所以DNA的限制和修飾作用為細菌提供了保

3、護，它是通過對外源 DNA的限制和對自身DNA的修飾實現的。堿性磷酸酶的種類、差別及用途？ CIP的活性比BAP高10-20 倍,且加熱到68C就可完全失活， 而BAP卻是耐熱酶，耐酚抽提。用途：（1） dsDNA的5端脫磷酸，防止線性載體DNA的自身 環化。（2） DNA和RNA脫磷酸后，用于多核苷酸激酶進行5末端標記。如何利用T4DNA聚合酶制備平末端？ T4 DNA聚合酶具有5, -3,合成酶活性和3, -5,外切核酸 酶活性，并且在高濃度的dNTP存在時，降解作用即會停止。根據這一特性可以調整反應條件, 用T4 DNA聚合酶的3, -5,外切酶活性將具有3,突出末端的雙鏈DNA切成平末

4、端；用T4 DNA 聚合酶的5, -3,合成酶活性將具有5,突出末端的雙鏈DNA填補成平末端。（而Klenow酶是由大 腸桿菌DNA聚合酶I全酶經枯草桿菌蛋白酶水解之后，產生的分子量為76kDa的大片段分子。Klenow酶仍具有5, -3，的聚合酶活性和3，-5，的核酸外切酶活性，但失去了全酶的5，-3, 的核酸外切酶活性，且 3， -5，的核酸外切酶活性很弱，故僅可對 3，-隱蔽末端的雙鏈 DNA 填補成平末端。）理想質粒載體必須具備的條件？（1）具有復制起點，這是質粒自我增殖所必不可少的基本條件， 可使繁殖后的細胞維持一定的質粒拷貝數。（2）帶有抗菌素抗性基因，最好具有兩種抗菌素抗 性基因

5、，且抗性基因內有若干單一的酶切位點，便于利用插入失活法篩選重組體。（3）具有若 干限制酶單一識別位點，這樣可以有選擇地供帶有不同末端的外源DNA定點插入。（4）較小的 分子量和較高的拷貝數，小分子量的質粒易于操作，更能抵抗機械剪切力的切割，可容納外源 DNA片段也更長（不超過15kb）,且可有效地轉化給受體細胞；小分子量的質粒往往屬于松弛 型質粒，在細胞中拷貝數較高，擴增后回收率高。質粒改造包括哪些基本內容？ a.刪除一些非必要區段及對宿主有不良影響的區段，削減載體分 子量，使載體具有更大的容納外源片段的能力；b.加上易于選擇或檢測的標記；c.限制性內切酶 酶切位點的改造，便于外源基因插入到載

6、體中的特定位置；d.加上一些調控元件，有利于克隆 基因的表達；e.安全性改造，限定載體的宿主范圍。為什么野生型的入噬菌體DNA不宜作為基因工程載體？野生型的入噬菌體DNA，分子量大， 對常用的核酸內切限制酶具有過多的酶切位點（如5個EcoR I限制位點,7個Hindlll限制位點）， 沒有選擇標記，而且具有感染性，顯然它本不適于用作基因克隆的載體，因此有必要將入噬菌 體的非必要J基因到N基因）區段和多余的酶切位點進行刪除，以便改造成適用的克隆載體。黏粒載體具有哪些特點與不足？ a. 柯斯質粒載體具有質粒復制子，因此進入寄主細胞后能夠像 質粒一樣進行復制，并且能在氯霉素作用下進一步擴增。b.具有

7、質粒載體的抗生素抗性基因。c.具有入噬菌體的包裝和轉導特性。d.容載能力大。克隆的最大片段為45kb，最小片段為19kb。 用 cosmid 進行克隆時有兩個缺點：( 1 )兩個或多個 cosmid 分子之間的重組，即自我重組降低 了重組率。(2)兩個或多個外源DNA片段同時插入。PCR的基本原理是什么？ PCR反應是在模板DNA、引物和dNTPs存在的條件下，依賴于DNA聚 合酶的酶促合成反應，它根據DNA半保留復制的原理，在體外進行DNA的變性、復性(退火) 和引物延伸反應。欲擴增下圖所示的兩段序列之間的DNA,請從所列出的的引物中選出合適的一對。(1)、(8)。5-GACCTGTGGAA

8、GCCATACGGGATTG-33-CTGGACACCTTCGGTATGCCCTAAC-5a) 引物1：1)5-GACCTGTGGAAGC( 2)5-CTGGACACCTTCG3)5-CGAAGGTGTCCAG( 4)5-GCTTCCACAGGTCb) 引物2：5)5-CATACGGGATTG( 6)5-GTATGCCCTAAC7)5-GTTAGGGCATAC( 8)5-CAATCCCGTATG引物設計的一般原則是什么？ a.長度1530bp, Tm 55C75C。b.G+C占50%60%，避免單 一堿基的連續排列，一般兩端G+C含量近似。c.引物3端必須與模板DNA互補。d.對引物間 不能有

9、4個以上的堿基互補。e.引物本身應避免有回文序列。對于已知序列基因的克隆方法主要有：(1)根據已知序列，設計特異性引物進行PCR擴增，如 果序列不是全長基因，可通過5 RACE和3 RACE對其基因的兩端進行擴增測序，最終獲得全 長基因序列。(2)根據已知序列制備探針，利用該探針與該生物DNA文庫或cDNA文庫進行雜交， 篩選目的序列所在的克隆，測序分析后，從克隆上獲得目的序列全長基因。有哪些可能的原因使一個基因在DNA庫中丟失？ a.假定這個基因在高拷貝數的載體上，由于它 的產物太多，而對宿主是有毒的；b.在部分消化中，某個基因中含有所用酶的切點；c.酶切位點 離基因太遠，結果由于DNA片段

10、太長而不能有效地克隆。DNA 重組連接的方法大致分為四種：黏性末端連接，平末端連接，同聚物接尾連接，人工接頭 連接。其中黏性末端連接法是最常用的連接方法，具有實驗操作簡單，易于回收外源DNA片段 的優點，而不足之處：(1)載體易自身環化；(2)用同一種限制酶產生的黏性末端連接不易定 向克隆；(3)難插入特定的基因；(4)大片段DNA的重組率較低，即使用堿性磷酸酶處理了載 體，載體也有成環的傾向；(5)用這種方法產生的重組體往往含有不止一個外源片段或不止一 個載體連接起來的串聯重組體，增加篩選工作的困難。什么是同尾酶？為什么說用同尾酶進行體外重組效率最高？同尾酶是又一類限制酶，它們雖然 來源各異

11、，識別的靶子序列也各不相同，但卻產生相同的粘性末端。用同尾酶處理載體和外源 DNA得到的粘性末端可以像完全親和的粘性末端那樣進行連接，不同的是連接后的產物往往失 去原有的限制性內切核酸酶的切點，卻又能被另外一種同尾酶識別。用同尾酶進行體外重組時， 在限制酶切割反應之后不必失活原有的內切酶，即可直接進行重組連接。由于連接體系中存在 原有的限制酶，載體就不會自連，從而保證了載體同外源DNA的連接。所以在用同尾酶進行的 連接反應中不必用堿性磷酸酶進行載體的脫磷反應而得到最高的連接效率。反應中通常涉及三 種不同的限制酶，其中兩種是識別六堿基的酶，另一種是識別四堿基的酶。什么 是受體細胞的感受態？常用的

12、誘導方法有哪些？接受外源 DNA 的生理狀態；化學法(CaCl2)、電擊法。某一質粒載體具有Tef和Kanr的表型，在Kan抗性基因內有一 Bgl I的切點。現用Bgl I切割該 載體進行基因克隆，問：(1)轉化后涂皿時應加什么樣的抗生素？(2)培養后長出的菌落具有 什么樣的抗性基因型？(3)如何利用抗性變化篩選到含有插入片段的重組體？(1)加四環素(Tet)； (2) Tef Kanr和Tef Kans ； (3)將生長在含Tet平板上的菌落，重新點種在含Kan的 平板上，選擇只在Tet平板上生長而不在Kan平板上生長的菌落，即為所需的重組體。簡述農桿菌介導法的轉基因基本原理及其優缺點。農桿

13、菌介導法的基本原理是利用農桿菌的 Ti 質粒為載體，通過農桿菌感染植物受體細胞將外源基因導入受體細胞，借助T-DNA與受體基因 組交換將外源基因整合到受體基因組上從而實現遺傳轉化。農桿菌介導的優點：（1）模仿天然 載體轉化系統，成功率高，效果好；（2）可以轉化較大的完整的DNA片段至植物基因組中；（3） 外源基因在受體中多數為單拷貝，穩定性好。 缺點：受宿主范圍的限制，主要適應于雙子葉植 物，單子葉植物效果較差。簡述基因槍法的轉基因基本原理及其優缺點。基因槍法是在真空條件下，利用粒子加速器將外 面包裹了外源基因DNA的金粉顆粒打入完整的受體細胞，使外源基因在受體細胞中實現遺傳轉 化。基因槍法優

14、點：（1）不受植物宿主范圍和組織類型的限制；（2）操作簡便；缺點：（1）轉 化頻率不高；（2）外源基因在受體中多數為多拷貝；（3）成本較高。Northern和Southern的根本區別在于：（1）印跡對象不同：Northern是RNA,而Southern是 DNA； （2）電泳條件不同，Northern變性條件，Southern是非變性條件（酶切）。在Southern 印跡中，DNA轉移的速度主要取決于DNA片段的大小和瓊脂糖凝膠的濃度。放射免疫篩選的原理基于哪三點？ a.抗體分子可以牢固地吸附到固體支持物（如聚乙烯塑料） 上; b.同一個抗原可以同幾種不同的抗體結合；c.抗體分子可以通過碘化

15、作用被I125標記。如何防止載體DNA分子的自身環化問題？ a.利用堿性磷酸酶處理線性載體分子；b.使用同尾酶產 生的粘性末端連接，可以自動地防止線性載體DNA分子的自身環化；c.采用同聚物加尾連接技 術，使線性DNA分子的兩個3-OH末端，因具有同樣的堿基結構而無法自身環化；d.應用柯斯 質粒，亦可防止質粒DNA分子發生自身再環化作用。下面幾種序列中你認為哪一個（哪些）最有可能是II類酶的識別序列：GAATCG, AAATTT，GATATC，ACGGCA。為什么？ AAATTT, GATATC 因為它們是回文序列。Sanger雙脫氧法測序的原理？ （1）以雙脫氧的底物取代正常的DNA合成底物

16、摻入到正在合成 的新鏈上；（2）由于是雙脫氧，將不能同下一個脫氧單核苷酸形成磷酸二酯鍵，從而使合成終 止。分離DNA時，為什么要在緩沖液中加入一定濃度的EDTA與蔗糖？（1）EDTA是螯合劑，可同Mg2+ 離子螯合，使核酸酶失去了作用的輔助因子，而抑制核酸酶的活性；（2）蔗糖可增加緩沖液的 黏度，保護DNA不易斷裂。抽提DNA去除蛋白質時，怎樣使用酚與氯仿較好？酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當 蛋白水溶液與酚或氯仿混合時，蛋白質分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合 狀態而變性。經過離心，變性蛋白質的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面 從而與溶解在水相中的DNA分

17、開。而酚與氯仿有機溶劑的比重更大，保留在最下層。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與 水相有一定程度的互溶，大約10%15%的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA， 且單獨用酚抽提 DNA 不能完全除去酚，而殘留的酚抑制限制性內切酶和連接酶活性，甚至導致 酶變性，而氯仿也是蛋白變性劑，變性作用雖不如酚效果好，但它不與水互溶，不會帶走DNA， 而與苯酚互溶，故可帶去殘留酚。所以在抽體過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊醇？在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇 烈震蕩容器數次，這時在混合液內易產生氣泡，

18、氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能 降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產生。一般采用氯仿與異戊醇為24： 1 之比。 也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25： 24： 1，同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相， 中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。提取DNA時為何使用無水乙醇沉淀DNA?這是實驗室最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優點是 可以以任意比例和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的 沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水 分子，使DNA失水而易于聚合。為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于 DNA 的分離？氧化后如何處理？苯酚呈酸性，易氧化產生自 由基，引起磷酸二脂鍵斷裂，故重蒸除去氧化物，然后用Tris-Hcl飽和酚，調pH至中性。飽 和酚可防止酚吸收更多DNA溶液，以降低DNA損失率。氧化的酚可