1、免疫學(xué)技術(shù)和臨床美國(guó)貝克曼庫爾特公司免疫產(chǎn)品市場(chǎng)部洪軍 2007.4 安徽內(nèi)容摘要什么是免疫分析的表現(xiàn)免疫分析的基本概念如何去設(shè)計(jì)一個(gè)免疫分析試劑免疫分析對(duì)臨床意義的改變Access2 介紹什么是免疫分析的表現(xiàn)免疫檢測(cè)的分析表現(xiàn)準(zhǔn)確性精密度靈敏度特異性檢測(cè)線性范圍試劑穩(wěn)定性定標(biāo)周期開瓶效期免疫分析檢測(cè)的臨床表現(xiàn)臨床靈敏度和特異性是分析結(jié)果準(zhǔn)確性的臨床表現(xiàn):理想狀態(tài)健康人群疾病人群靈敏度 100%特異性 60%特異性 100%靈敏度 50%靈敏度增加 特異性增加假陰性 假陽性Cut-off設(shè)置cutoff值在此處用于篩查分析設(shè)置cutoff值在此處減少錯(cuò)誤診斷帶來的高花費(fèi)設(shè)置cutoff值在此處

2、為了最少化錯(cuò)誤結(jié)果分析表現(xiàn)特點(diǎn): 正常人群參考值和10%CV（功能靈敏度）免疫分析的基本概念免疫學(xué)測(cè)定的中心問題作為免疫反應(yīng)，抗原抗體的選擇是整個(gè)免疫分析特異性和總體表現(xiàn)的關(guān)鍵如何選擇好一個(gè)抗體去檢測(cè)一個(gè)被檢物質(zhì)，而不與非常相似結(jié)構(gòu)的其它物質(zhì)有交叉反應(yīng)，或漏掉須反應(yīng)的物質(zhì)，這是分析設(shè)計(jì)的重中之重抗體的量必須恰當(dāng)，過多會(huì)引起復(fù)合物的溶解關(guān)于抗體的親合力抗體除了要求純度外（單價(jià)特異性）還必須要求親合力，效價(jià)指抗體的量，親合力指抗體的質(zhì)在非競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)的模式中抗體親和力比標(biāo)記物的最低檢測(cè)極限更能影響分析的靈敏度在競(jìng)爭(zhēng)法免疫反應(yīng)的模式中抗體親和力直接關(guān)系到競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果對(duì)于樣品中的干擾物質(zhì),親合力影響分析

3、的抗干擾的能力免疫分析的工作定義免疫分析(Immunoassay) 是一種測(cè)試方式,使用特殊的抗體與被檢測(cè)物質(zhì)的結(jié)合,此被檢測(cè)物質(zhì)不能通過簡(jiǎn)單的化學(xué)方法所容易檢測(cè)到的.通常在檢測(cè)系統(tǒng)中會(huì)使用到一種叫標(biāo)記物（labeling）的物質(zhì),常標(biāo)記在抗體上通常會(huì)有一個(gè)分離（separation）的過程在最后讀取信號(hào)前總是需要去仔細(xì)關(guān)注一下分析的模式（format） 檢測(cè)技術(shù)免疫分析檢測(cè)技術(shù)(Detection) 有許多可用的方法 應(yīng)用一些 “標(biāo)記物” 所產(chǎn)生的一些能量進(jìn)行測(cè)定標(biāo)記物可以或可以不被激活而產(chǎn)生能量通過一些相應(yīng)的檢測(cè)器對(duì)標(biāo)記物產(chǎn)生的能量進(jìn)行測(cè)定分離技術(shù) 分析模式 放射免疫分析(Radioimm

4、unoassay)優(yōu)勢(shì)優(yōu)秀的靈敏度較寬的檢測(cè)線性范圍局限性標(biāo)記物的半衰期短試劑效期短檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性差每次檢測(cè)都要做標(biāo)準(zhǔn)曲線分析的反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，半天2天發(fā)射性污染有害很難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)酶-顏色的變化酶(Enzymes) - EIA原理在免疫分析結(jié)束后通過催化所加入的酶底物典型的催化反應(yīng)包括顏色的變化,用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)優(yōu)勢(shì)非常容易使用的技術(shù)用于一些定性的分析局限性對(duì)定量分析所要求的靈敏度和寬線性難以實(shí)現(xiàn)ELISA技術(shù)必須每次定標(biāo)試劑部分成分要復(fù)溶重組反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光物質(zhì) - CLEIA原理不穩(wěn)定的分子通過加入一些化學(xué)基團(tuán)變得很穩(wěn)定,而移去這些起穩(wěn)定作用的化學(xué)基團(tuán)后,分子結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)

5、定發(fā)出光（pH的改變，酶切作用，電激發(fā)等）優(yōu)勢(shì) 具備RIA所擁有的優(yōu)勢(shì)(靈敏度和寬線性),但排除其缺點(diǎn)用一個(gè)簡(jiǎn)單的光度計(jì)讀數(shù)非常低的背景干擾類型 閃爍(flash), 持續(xù)(glow) 發(fā)光發(fā)光物質(zhì)的穩(wěn)定性水溶液中的穩(wěn)定性化學(xué)發(fā)光物質(zhì)AMPPD, Dioxetane (Lumi-Phos 530TM)-最穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)（第三代）第一代：魯米那第二代：丫啶酯類，三聯(lián)吡啶釕代表性分析系統(tǒng)貝克曼庫爾特 - Access/Access 2 /DxI800終點(diǎn)讀數(shù), 更穩(wěn)定RLU00 5 10 時(shí)間(分鐘)55 60 ACCESS化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的特點(diǎn)很寬的檢測(cè)線性范圍可檢測(cè)到6個(gè)數(shù)量級(jí)(例如: 1

6、- 100,000 units)極高的靈敏度可檢測(cè)到小到10-21 摩爾/升很底的背景干擾對(duì)于一些超敏分析項(xiàng)目,有相當(dāng)接近零值的背景信號(hào)更超強(qiáng)的試劑穩(wěn)定性試劑效期開瓶效期定標(biāo)周期分離技術(shù)免疫分析檢測(cè)技術(shù)分離技術(shù)(Separation) 有很多方式典型的是,特異性結(jié)合的分析物被保留而未結(jié)合物質(zhì)和無用的反應(yīng)物被清除 分析模式 技術(shù)的創(chuàng)新微粒子包被珠包被微孔包被管包被分析模式免疫分析檢測(cè)技術(shù)分離技術(shù) 分析模式- 有很多種方式可定義為分析的 “處方”設(shè)定一個(gè)最優(yōu)化的模式(可變量)去最優(yōu)化項(xiàng)目的臨床應(yīng)用 分析模式可變量夾心法(Sandwich) vs.競(jìng)爭(zhēng)法(competitive)標(biāo)記物的放置同步(S

7、imultaneous) vs. 分步(sequential)試劑/樣品加入的順序孵育的次數(shù)(步驟)清洗分離的次數(shù)(步驟)試劑/樣品的體積/濃度孵育的時(shí)間孵育的溫度夾心法分析模式捕捉抗體(Capture antibody)和標(biāo)記抗體(labeled antibody)每個(gè)不同的抗體可以針對(duì)不同的抗原決定簇，或二個(gè)在同一個(gè)抗原決定簇分析更特異因?yàn)槎€(gè)抗體同時(shí)反應(yīng)適合于檢測(cè)大分子物質(zhì)bhCG TSHIgEProlactinFSH LH FerritinHBsAg競(jìng)爭(zhēng)法分析模式只有捕捉抗體主要針對(duì)小分子物質(zhì)檢測(cè) 沒有足夠表面積的分析物去符合 “夾心法” 要求T3FT3 B12 Digoxin Pro

8、gesteroneT4 FT4 Folate Cortisol Estradiol如何去設(shè)計(jì)一個(gè)免疫分析試劑一個(gè)免疫分析項(xiàng)目的誕生里程碑(Milestones)市場(chǎng)調(diào)研確定需求項(xiàng)目的詳細(xì)特點(diǎn)要求確定分析模式研發(fā)和優(yōu)化證明分析表現(xiàn)符合項(xiàng)目的詳細(xì)特點(diǎn)要求 (beta sites, clinical studies)提交注冊(cè)項(xiàng)目臨床應(yīng)用的要求臨床應(yīng)用(claims)篩查（Screening）檢測(cè)（Detection）診斷（Diagnosis）分層（Staging）預(yù)后（Prognosis）監(jiān)測(cè)（Monitoring）項(xiàng)目的臨床應(yīng)用與分析表現(xiàn)必須到達(dá)的分析表現(xiàn)特征靈敏度（Sensitivity）特異性

9、（Specificity）精密度（Precision）線性范圍（Dynamic range）其它分析模式的選擇需考慮的因素分析物的特征體積（競(jìng)爭(zhēng)法還是夾心法）濃度（一步法，二步法，反應(yīng)時(shí)間等）潛在的“鉤狀效應(yīng)”（hook effect）- 假陰性解決的方法可以使用2步法模式樣品量和試劑量的平衡抗干擾能力儀器的能力局限性預(yù)處理的要求試劑原材料的選擇原材料抗體標(biāo)準(zhǔn)品封閉試劑（稀釋液）清洗緩沖液YYYYY抗體的選擇單克隆(Monoclonal) 和多克隆( polyclonal)選擇的標(biāo)準(zhǔn)(criteria)特異性(Specificity)靈敏度(Sensitivity)供應(yīng)能力(Supply)相關(guān)

10、性(Correlation)可制造性(Manufacturability)花費(fèi)(Cost)多克隆抗體(Polyclonal Antibodies)免疫動(dòng)物獲得,如羊或兔 時(shí)間長(zhǎng),復(fù)雜的制作流程注射,監(jiān)測(cè)滴度(可能反復(fù)注射)周期性的抽血獲得特征化(Characterization)和純化(purification)生產(chǎn)出”雞尾酒”式的抗體,針對(duì)所有抗原決定簇適合對(duì)臨床靈敏度要求較高分析測(cè)試YYYYYYYYYYYYYYYYYYYY單克隆抗體(Monoclonal antibodies)YYYYYYYYYYYYY克隆的結(jié)果抗體的產(chǎn)生具有高度的同源性和特異性并針對(duì)一個(gè)抗原決定簇可以選擇最好的抗體在大量

11、生產(chǎn)時(shí)可以確保持續(xù)的供應(yīng)適合對(duì)臨床特異性和批間一致性要求較高的分析測(cè)試抗體的選擇篩選抗體需經(jīng)過靈敏度，特異性和穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)許多的抗原決定簇并非一種分子所獨(dú)有被測(cè)抗原的穩(wěn)定性不同被測(cè)抗原的游離和結(jié)合模式案例: hLH 抗原位點(diǎn)圖BetaAlphaB-D 1hTSHhCGB-D 2hCGA-D 1hCGhFSHhTSHB-D 3A-D 3A-D 2hCGhFSHhTSH案例: Troponin-I 抗原位點(diǎn)圖肌鈣蛋白 - I穩(wěn)定性的問題氧化的問題磷酸化的問題N-terminalC-terminal010203040506070809010011012013014015016017018019020

12、0POO_ _Access 1st Gen31-3458-70 (cross-react)157-160PMP Detect Access AccuTnI _24-4041-49PMPDetect抗體的選擇等分子(Equimolar) vs. 非等分子(non-equimolar)分析依賴于特異性抗體的選擇結(jié)合模式-一些位點(diǎn)被隱藏游離模式-所有位點(diǎn)都暴露PSAACTPSA嗜異性抗體(Heterophile Antibody)病人樣品中可能自然產(chǎn)生一些針對(duì)動(dòng)物免疫球蛋白的抗體(通常是鼠或羊)來源于暴露于這些動(dòng)物或接受過動(dòng)物血清的治療分析的干擾可以在雙單克隆夾心法分析模式中引起假陽性可以在單克隆/

13、多克隆分析模式中出現(xiàn)假陰性嗜異性抗體反應(yīng)假陽性 較多見嗜異性抗體在捕捉抗體和檢測(cè)抗體中搭橋,出現(xiàn)在雙單克隆夾心法模式中嗜異性抗體反應(yīng)假陰性 較少見嗜異性抗體爭(zhēng)奪捕捉或檢測(cè)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn),出現(xiàn)在單克隆/多克隆分析模式中稀釋液封閉劑（稀釋液）可以加在反應(yīng)基質(zhì)中或整合在試劑盒內(nèi)動(dòng)物蛋白（鼠，兔，羊等）各個(gè)廠家生產(chǎn)的分析試劑都有可能會(huì)不同程度的受到任何一個(gè)病人血清的影響！定標(biāo)程序廠家產(chǎn)生的主定標(biāo)曲線感覺節(jié)省的校正型 2 點(diǎn)定標(biāo)會(huì)增加定標(biāo)的頻率對(duì)非線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線可能會(huì)有問題(大多數(shù)的免疫分析產(chǎn)生的是非線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線)多點(diǎn)定標(biāo)曲線定量 典型的是6個(gè)水平, 定性 典型的是2個(gè)水平可以達(dá)到最大的靈敏度,準(zhǔn)

14、確性和精密度可以有更長(zhǎng)的定標(biāo)周期間隔標(biāo)準(zhǔn)品 參比物參比物純化蛋白(Purified protein)通常制作較便宜相對(duì)較短的穩(wěn)定時(shí)間,需特殊的存放條件一般需要凍干保存可能會(huì)有批間的不一致性重組(Recombinant)相對(duì)昂貴很長(zhǎng)的研發(fā)時(shí)間更穩(wěn)定和可靠可以以液體的模式供應(yīng)分析清洗液清洗液使用的類型和量，在清洗步驟結(jié)束后分析物提供的有效保留方式的能力和清洗殘留的有效去除能力等，都會(huì)影響到分析表現(xiàn)清洗液中加入適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┛梢匀コ恍枰纳锘钚晕镔|(zhì) (干擾物質(zhì))免疫反應(yīng)中不能用水進(jìn)行分析內(nèi)的清洗分離!試劑的優(yōu)化需優(yōu)化參數(shù)時(shí)間程序步驟各類試劑濃度pH/離子強(qiáng)度需優(yōu)化的內(nèi)容擴(kuò)散的速率結(jié)合的速率復(fù)合

15、物的穩(wěn)定性優(yōu)化后達(dá)到的表現(xiàn)靈敏度(Sensitivity)精密度(Precision)線性范圍(Dynamic range)準(zhǔn)確性(Accuracy)相關(guān)性(Correlation)試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇對(duì)臨床檢測(cè)結(jié)果的影響臨床試驗(yàn)結(jié)果反映了試驗(yàn)過程中各種條件的優(yōu)化免疫分析設(shè)計(jì)及優(yōu)化開發(fā)免疫分析試劑盒的過程就是選擇并優(yōu)化各種實(shí)驗(yàn)條件，達(dá)到預(yù)期結(jié)果并能準(zhǔn)確反應(yīng)臨床真實(shí)情況的過程抗原/抗體分析模式分離技術(shù)檢測(cè)技術(shù)總體分析表現(xiàn)Beckman Access AccuTn-I符合NABC/IFCC/ESC/ACC的導(dǎo)則要求最好的99%分位值的比值沒有嗜異性抗體,HAMA和RF的干擾對(duì)樣品沒有抗凝劑（肝素）的要求周轉(zhuǎn)時(shí)間(TAT)小于30分鐘(12分鐘)最寬的檢測(cè)線性范圍最長(zhǎng)的定標(biāo)穩(wěn)定時(shí)間最多的臨床應(yīng)用診斷危險(xiǎn)分層（高靈敏度和精密度）治療監(jiān)測(cè)為什么貝克曼有如此好的結(jié)果表現(xiàn)呢？心肌鈣蛋白和心臟疾病cTnI的水平已用于AMI的診斷, 但隨著診斷檢測(cè)技術(shù)的提高cTnI可對(duì)病人的短期和長(zhǎng)期的心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)期免疫分析的未來過去癥狀的處理沒有標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)則現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)化的診斷和治療的步驟減少操作的可變性 和不依從性著重單個(gè)個(gè)體明天人群疾病的花費(fèi)和因果關(guān)系確認(rèn)一些醫(yī)學(xué)措施所帶來的益處風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估教育項(xiàng)目預(yù)防發(fā)病率展望控制發(fā)病率(控制你因某病而死亡)緊急監(jiān)護(hù)疾病管理人群健康管理更有效合理的管理疾病的