1、江蘇省寄生蟲病防治研究所 顧亞萍瘧原蟲鏡檢技術瘧原蟲的基本形態特征血片制作與染色瘧原蟲計數顯微鏡的維護與保養 瘧疾是由蚊子傳播的寄生蟲病，它的病原體是瘧原蟲。 寄生于人體的瘧原蟲有4 種瘧原蟲基本結構瘧原蟲基本構造為核、細胞質（胞漿）和瘧色素。原蟲經姬氏Giemsa或瑞氏Wright染色： 核呈紅色,胞質呈蘭色，瘧色素為本色胞漿瘧色素核1.核 呈鮮紅色，呈圓形或橢圓形。核的結構致密，只有在個別發育階段較為疏松，例如間日瘧原蟲雄配子體的核。瘧原蟲基本結構瘧原蟲基本結構不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲種類而異，瘧色素在蟲體內散在分布或聚集成團塊。間日瘧原蟲呈短棒狀，黃褐色；惡性瘧原蟲呈細砂狀，黑

2、褐色；三日瘧原蟲呈砂粒狀，深褐色；卵形瘧原蟲與間日瘧原蟲相似。3.瘧色素瘧色素滋養體期：早期、晚期滋養體裂殖體期：未成熟、成熟裂殖體配子體期：雌、雄配子體瘧原蟲在RBC內各期形態各不相同瘧原蟲在紅細胞內按照生長發育繁殖的階段不同瘧原蟲基本結構紅細胞通常漲大 薛氏點明顯 環狀體較粗大滋養體胞漿有阿米巴樣偽足血片中可見各期的原蟲形態成熟裂殖體約含12-24個裂殖子，排列不規則 間日瘧（P. vivax ） 鑒定要點紅細胞不漲大或略小環狀體中等大小，核較大，胞漿粗厚胞漿不活躍呈帶狀形 成熟裂殖體呈菊花狀,內含6-12個裂殖子 5. 雌雄配子體小于 正 常 紅細胞，瘧色 素呈深褐色 6. 常可查見各階

3、段 的瘧原蟲三日瘧（P.malariae） 診斷要點卵形瘧（P. ovale） 診斷要點紅細胞略漲大或正常，卵圓形或邊緣呈鋸齒狀環狀體中等大小，核較大，胞漿粗厚薛氏點出現較早粗大，量多成熟裂殖體約含6-12個裂殖子 5. 常可查見各階段的 瘧原蟲 寄生的紅細胞: 經染色后，因細胞內血紅蛋白溶解，輪廓消失，但有時尚留下殘骸的“影子”或點彩。 厚血膜由于用血量多，血膜小，細胞重迭，干燥緩慢，各期瘧原蟲的體積都略為縮小，其中大、小滋養體的形態有較大改變，裂殖體和配子體的形態則變化不大。厚血膜中瘧原蟲的形態：厚血膜惡性瘧原蟲厚血膜RingsGametocytes 由于在血膜制備過程中紅細胞溶解，因而其

4、原形態消失，且染液和玻片上可能存在雜質等，要根據瘧原蟲的三個基本要素仔細加以鑒別。（1)疑似瘧色素（2）疑似瘧原蟲核（3）疑似瘧原蟲胞漿瘧原蟲與其他異物的鑒別（4）血液成份與分析（5）雜質-類似瘧原蟲的物質（6） 形態失常 瘧原蟲成份丟失。 成份增加。 形態改變。 藥物影響。 血片的制作與染色 載玻片的清洗：新玻片的清洗方法 用加有洗潔精或洗衣粉的熱水洗滌，浸于95% 的乙醇中1小時以上已用過的玻片：用加有洗衣粉的熱水洗滌，浸于95% 的乙醇中1小時以上 載玻片 每張載玻片上分別做1個薄血膜，1個厚血膜。標準血膜的位置如下圖所示。血片制作 取血液4-5l 血滴置于載片的中央偏右1/3， 由里向

5、外劃圈涂成直徑為0.8-1厘米 厚薄均勻、圓形厚血膜.血片制作厚血膜的涂制：薄血膜的涂制：取血液1-1.5l血滴置于載玻片的中央，將推片的一端置于血滴之前，當血液在載玻片與推片之間向兩側擴展至約2cm寬時，兩玻片保持20-30角，推成舌狀薄血膜，長約2-2.5CM。血片制作血片染色兩種染色方法:吉氏染色法瑞氏染色法常用吉氏染色法 吉氏染液：染色方法薄血膜經甲醇固定干燥后，用PH7.0-7.2的磷酸緩沖液或蒸餾水將吉氏原液稀釋，原液與緩沖液為1:20。混勻染色20-30分鐘，晾干鏡檢。厚血膜溶血染色 放置多時未染色的血片（2天以上，薄片已用甲醇固定），在染色之前，須在厚血膜上用清水進行溶血，待血

6、膜全部溶解后倒掉，用吉氏染液染色,清水漂洗干凈,晾干。 染色用水和沖洗用水pH7.0pH7.2緩沖蒸餾水效果最佳。先制備好兩種貯備液貯備液I 1/15M磷酸氫二鈉（Na2HPO4）溶液 Na2HPO4 9.5 g 蒸餾水 1000 ml貯備液 1/15M磷酸二氫鉀 （KH2PO4 ）溶液 KH2PO4 9.07 g 蒸餾水 1000 ml緩沖蒸餾水配制PH M/15 Na2HPO4 M/15 KH2PO4 DW (ml) ( ml) (ml)7.0 63 37 9007.1 68 32 9007.2 73 27 900緩沖蒸餾水宜用時新鮮配制為好。血片制作注意事項（1）在制作血片前，首先要核對

7、患者的 姓名、年齡和住址（2）載玻片必須清潔無油污，理想的薄 血膜是一層血細胞均勻分布不重 疊和空泡，血膜末端呈舌狀。（3）厚血膜厚度以一個油鏡視野內可見5-10個白細胞為宜。（4）制成的血片在未干前不能傾斜放置，待其自然干燥，不要加熱，加熱會使原蟲變形，影響鏡檢結果血片制作注意事項（1）染料溶劑的質量 （2）染液的新舊（3）染液稀釋后使用時間原液必須臨用時稀釋，隨配隨用。（4）染液的稀釋濃度（5）染色時間 (6) 染色稀釋用水:Ph7.0-7.2 染色質量影響因素（7）血膜在制備后應盡量能在當天染色，一般夏天不超過48小時，冬天也不能超過72小時。新制血片染色時厚血膜無需溶血放置多時的血片，

8、在染色之前先用清水滴加在厚血膜上進行溶血.瘧原蟲密度計算瘧原蟲密度計算 計算瘧原蟲密度的三種方法： 白細胞原蟲密度計數法 (厚血膜 WHO) 半定量計數法 (厚血膜) 紅細胞感染密度計算法(薄血膜)白細胞原蟲密度計數法鏡檢厚血膜，按視野順序，記錄200個白細胞中的瘧原蟲數，如果原蟲密度較低，可增加白細胞，計數500-1000 個。密度單位:原蟲數/l計算公式：瘧原蟲數 計數的白細胞數 患者每微升血白細胞數 = 瘧原蟲數/l血。如果不知患者的白細胞數，則每微升血以8000個白細胞計數(國際標準) 。瘧原蟲密度計算厚血膜的瘧原蟲計數從血膜的左上角開始，橫向。計數1個視野后，每次間隔5個視野,再計數

9、。厚血膜瘧原蟲密度計算用厚血膜每個視野中所觀察到瘧原蟲的平均數粗略地估計出瘧原蟲密度。這種方法簡便，缺點是計數的瘧原蟲數受血膜厚薄影響，只能定性，不宜作定量分析。此方法將密度分為6級：1.全厚血膜查見瘧原蟲數在10個以內，記錄實際數字2.全厚血膜查見瘧原蟲數在10個以上，但平均每個視野不到1個蟲，記錄“少”3.平均每個視野1-5個蟲，記錄“”4.平均每個視野6-10個蟲，記錄“+”5. 平均每個視野11-100個蟲，記錄“+ ”6. 平均每個視野100個蟲以上，記錄“+ ”。如：Pv R+T+G少半定量計數法瘧原蟲密度計算紅細胞瘧原蟲密度按以下公式計算：1.紅細胞瘧原蟲感染率（%）計算 紅細胞

10、原蟲感染率（%）= 瘧原蟲數 計數的紅細胞數X 100 2.紅細胞瘧原蟲感染密度計算 紅細胞瘧原蟲密度=紅細胞原蟲感染率X紅細胞數/每微升血 （男性500萬個/l；女性450萬個/l） 紅細胞瘧原蟲感染密度計算（薄血膜）瘧原蟲密度計算顯微鏡的使用與維護1.學習鏡檢瘧原蟲之前，必須熟悉顯微鏡的基本構造，使用方法和維修與保養。防止油鏡進灰、進油和發霉。2.瘧原蟲的厚薄血片都必須在油鏡下觀察，顯微鏡用光要充足。包括反光鏡、光圈、聚光器要達到油鏡使用的最佳限度。顯微鏡檢查注意事項3. 玻片未加油時觀察標本應按：低倍高倍油鏡程序。如在加油區內重找目標應按照：低倍油鏡程序，不要經高倍鏡，以免油沾污鏡頭。注意保護鏡頭，切不可壓碎標本被片，損壞鏡頭。 顯微鏡檢查注意事項4.視野模糊不清 顯微鏡問題： 鏡頭鏡油用量、沾污灰塵或含有氣泡； 油鏡頭破損、進油或有霉斑、灰塵； 顯微鏡用光調整不足。 血片問題： 載玻片不潔、毛玻璃樣或有霉斑； 血片染色過度或血膜過厚。顯微鏡檢查注意事項顯微鏡檢查注意事項5. 應先學會看薄血膜，掌握薄血膜上各期的形態特征后