1、第二十二章 高 效 液 相 色 譜 法第一節(jié) 概述 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography, HPLC）是20世紀(jì)六十年代末在經(jīng)典液相柱色譜法的基礎(chǔ)上引入了氣相色譜的理論和技術(shù)，采用高壓泵、高效固定相以及高靈敏度檢測(cè)器發(fā)展而成的分離分析方法。第一節(jié) 概述 經(jīng)典柱色譜法流動(dòng)相是在常壓或低壓下運(yùn)行，傳質(zhì)速度慢，所用固定相顆粒粗，柱效低，分離時(shí)間長(zhǎng)；色譜柱不能連續(xù)使用；樣品用量大，靈敏度低；除了用于制備分離外，不 能在線檢測(cè)。HPLC和GC的基本理論一致，定性定量原理完全一樣，均可用計(jì)算機(jī)控制色譜條件和色譜的處理程序進(jìn)行在線檢測(cè)。 第一節(jié) 概述H

2、PLC和GC的不同點(diǎn)為：流動(dòng)相不同：GC用氣體做流動(dòng)相，載氣種類少，性質(zhì)接近，改變載氣對(duì)柱效和分離效率影響小。HPLC以液體做流動(dòng)相，且液體種類多，性質(zhì)差別大，可供選擇范圍廣，是控制柱效和分離效率的重要因素之一；固定相差別：GC多是固體吸附劑或在擔(dān)體表面上涂漬液體固定相，且粒度粗。HPLC大都是新型的固體吸附劑、化學(xué)鍵合相等，粒度?。ㄒ话銥?10m）；使用范圍更廣：GC主要用于揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性好的物質(zhì)的分析。因此，GC只能分析占有機(jī)物總數(shù)15%20%的物質(zhì)。HPLC可分析高沸點(diǎn)、難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定的化合物、離子型化合物和高聚物乃至生物大分子等物質(zhì)。第一節(jié) 概述 HPLC采用高靈敏度檢測(cè)器，如紫外

3、檢測(cè)器的最小檢測(cè)量可達(dá)納克(10-9g)級(jí)、熒光檢測(cè)器的靈敏度可達(dá)10-11g。HPLC的特點(diǎn)：分離效率高、分析速度快、靈敏度高、色譜柱可反復(fù)使用、流動(dòng)相可選擇范圍寬、流出組分容易收集、操作自動(dòng)化、適用范圍廣。第二節(jié) 高效液相色譜儀 高效液相色譜技術(shù)得到迅速發(fā)展，基本原理和色譜流程都是相同的，仍然由流動(dòng)相輸送系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜分離系統(tǒng)、檢測(cè)記錄數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。 溶劑貯器1中的流動(dòng)相經(jīng)混合室2混勻，被泵3吸入，然后輸出，導(dǎo)入進(jìn)樣器5。被分析樣品用注射器6由進(jìn)樣器處注入，并隨流動(dòng)相一起依次通過(guò)預(yù)柱7、色譜柱8后進(jìn)入檢測(cè)器9。檢測(cè)信號(hào)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)系統(tǒng)10處理，記錄色譜峰面積和色譜圖。若是制備色譜，可

4、以使用餾分收集器11。復(fù)雜樣品采用梯度洗脫（借助于梯度控制器4）使樣品各組分均得到最佳分離。整個(gè)儀器可由微處理機(jī)操縱，包括數(shù)據(jù)處理和操作控制。液相色譜儀（2）第二節(jié) 高效液相色譜儀一、輸液系統(tǒng)（一）流動(dòng)相貯器流動(dòng)相貯器俗稱貯液瓶，它對(duì)大多數(shù)有機(jī)化合物呈化學(xué)惰性，耐酸堿腐蝕。常見(jiàn)質(zhì)地為玻璃或塑料，容量約為0.5L2.0L，通常無(wú)色透明，若流動(dòng)相需避光，有棕色瓶供選擇。貯液瓶放置位置要高于泵體，以便保持一定的輸液靜壓差。使用過(guò)程貯液瓶應(yīng)密閉，以防溶劑蒸發(fā)引起流動(dòng)相組成的改變和防止空氣中的O2、CO2重新溶解于已脫氣的流動(dòng)相中。第二節(jié) 高效液相色譜儀（二）脫氣裝置 流動(dòng)相在使用前必須進(jìn)行脫氣處理，目

5、的是除去其中溶解的氣體。在裝入貯液瓶之前必須經(jīng)過(guò)0.45m濾膜過(guò)濾。為了使溶劑便于脫氣，貯液瓶常需貯備抽真空及吹入惰性氣體裝置。在洗脫過(guò)程中如存在氣泡會(huì)增加基線噪音，嚴(yán)重時(shí)使分析靈敏度降低。此外溶解在流動(dòng)相中的氧氣，會(huì)造成熒光猝滅，影響熒光檢測(cè)器的檢測(cè)，還可能導(dǎo)致樣品中某些組分被氧化或使柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。常用的脫氣方法有如下幾種：第二節(jié) 高效液相色譜儀1超聲波振動(dòng)脫氣 使用超聲波提取器的方法，將欲脫氣的流動(dòng)相置放于超聲波提取器中，用超聲波振蕩1030min。此法較簡(jiǎn)單、常用。2抽真空脫氣 用微型真空泵，降壓至0.050.07Mpa既可除去溶解的氣體，使用水泵連接抽濾瓶和G4

6、微孔玻璃漏斗可以一起完成過(guò)濾機(jī)械雜質(zhì)和脫氣的雙重任務(wù)。由于抽真空會(huì)引起混合溶劑組成的變化，故此法適用于單一溶劑的體系脫氣。對(duì)于多元溶劑體系，每種溶劑應(yīng)預(yù)先脫氣后再進(jìn)行混合，以保證混合后的比例不變。第二節(jié) 高效液相色譜儀3.加熱回流脫氣 用于需要徹底脫氣的流動(dòng)相（電化學(xué)檢測(cè)器），因?yàn)槭褂昧嘶亓骼淠骺蓽p少揮發(fā)性組分的損失。此法的脫氣效果較好，不提倡用于混合流動(dòng)相。4.吹氦脫氣 使用在液體中比空氣溶解度低的氦氣在0.1Mpa壓力下，以60mL/min的流速緩緩地通過(guò)流動(dòng)相1015min，趕去溶入的氣體。此法適用于所有的溶劑，脫氣效果較好，但價(jià)格較貴。5真空在線脫氣 把真空脫氣裝置串接到貯液系統(tǒng)中，

7、并結(jié)合膜過(guò)濾器，實(shí)現(xiàn)流動(dòng)相在進(jìn)入輸液泵前的連續(xù)真空脫氣。此法可適用于多元溶劑體系，其結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖22-2。第二節(jié) 高效液相色譜儀（三）輸液泵 輸液泵的種類很多，目前，多用柱塞往復(fù)泵。柱塞往復(fù)泵(圖22-3)工作時(shí)柱塞向前運(yùn)動(dòng)，液體輸出，流向色譜柱向后運(yùn)動(dòng)，將貯液瓶中的液體吸入缸體。如此前后往復(fù)運(yùn)動(dòng)，將流動(dòng)相源源不斷地輸送到色譜柱中。這種泵的容積一般只有幾毫升，容易清洗及更換流動(dòng)相。柱塞往復(fù)泵屬于恒流泵，流量不受柱阻影響。泵壓一般最高可達(dá)30Mpa以上。但它的輸液脈動(dòng)性較大是缺點(diǎn)。目前多采用雙泵補(bǔ)償法及脈沖阻尼器克服脈動(dòng)性。按泵聯(lián)結(jié)方式分為并列式與串聯(lián)式，后者較多。第二節(jié) 高效液相色譜儀（四）

8、梯度洗脫裝置 梯度洗脫也稱溶劑程序，是指在分離過(guò)程中，隨時(shí)間函數(shù)程序地改變流動(dòng)相組成，即程序地改變流動(dòng)相的強(qiáng)度（極性、pH或離子強(qiáng)度等）。按多元流動(dòng)相的加壓與混合順序，可分為高壓與低壓梯度兩種洗脫裝置。高壓梯度洗脫是利用兩個(gè)輸液泵分別各吸一種溶劑增壓后輸入梯度混合室，混合后送入色譜柱，混合比由兩個(gè)泵的速度決定。低壓梯度洗脫是在常壓下用比例閥將多種溶劑按比例混合后，再用泵增壓輸至色譜柱。低壓梯度便宜，且易實(shí)施多元梯度洗脫，目前多采用低壓梯度。第二節(jié) 高效液相色譜儀（一）六通進(jìn)樣閥 如圖22-5所示。在狀態(tài)a位置，用微量注射器將樣品注入貯樣管。進(jìn)樣后，轉(zhuǎn)動(dòng)六通閥手柄至狀態(tài)b，貯樣管內(nèi)的樣品被流動(dòng)相

9、帶入色譜柱。貯樣管的體積可按需固定。六通進(jìn)樣閥具有進(jìn)樣量準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可帶壓進(jìn)樣等優(yōu)點(diǎn)。第二節(jié) 高效液相色譜儀（二）自動(dòng)進(jìn)樣裝置 采用微處理機(jī)控制進(jìn)樣閥采樣（通過(guò)閥針）、進(jìn)樣和清洗等操作。操作者只需把裝好樣品的小瓶按一定次序放入樣品架上（有轉(zhuǎn)盤(pán)式、排式），然后輸入程序（如進(jìn)樣次數(shù)、分析周期等），啟動(dòng)，設(shè)備將自行運(yùn)轉(zhuǎn)。第二節(jié) 高效液相色譜儀四、色譜分離系統(tǒng) 色譜分離系統(tǒng)包括保護(hù)柱、色譜柱、恒溫裝置和連接閥等。分離系統(tǒng)性能的好壞是色譜分析的關(guān)鍵。（一）保護(hù)柱 為保護(hù)分析柱擋住來(lái)源于樣品和進(jìn)樣閥墊圈的微粒，常在進(jìn)樣器與分析柱之間裝上保護(hù)柱。保護(hù)柱是一種消耗性柱，一般只有5cm左右長(zhǎng)，在分析5010

10、0個(gè)比較臟的樣品之后需要換新的保護(hù)柱芯。保護(hù)柱用分析柱的同種填料填裝，但粒徑要大得多，便于裝填。第二節(jié) 高效液相色譜儀（二）色譜柱 色譜柱是由柱管和固定相組成。每根柱端都有一塊多孔性（孔徑1m左右）的金屬燒結(jié)隔膜片（或多孔聚四氟乙烯片），用以阻止填充物逸出或注射口帶入顆粒雜質(zhì)。色譜柱按規(guī)格不同分為分析柱和制備型兩類。分析型柱，一般常量分析柱內(nèi)徑24.6mm，柱長(zhǎng)1025cm；半微量分析柱內(nèi)徑11.5mm，柱長(zhǎng)1020cm。毛細(xì)管柱，內(nèi)徑0.051mm，柱長(zhǎng)310cm;實(shí)驗(yàn)室用制備型柱，內(nèi)徑2040mm，柱長(zhǎng)1030cm。第二節(jié) 高效液相色譜儀（三）柱恒溫箱 柱溫是液相色譜的重要參數(shù)，精確控制柱

11、溫可提高保留時(shí)間的重現(xiàn)性。一般情況下較高柱溫能增加樣品在流動(dòng)相的溶解度，縮短分析時(shí)間，通常柱溫升高6，組分保留時(shí)間減少約30%；升高柱溫能增加柱效，提高分離效率；分析高分子化合物或粘度大的樣品，柱溫必須高于室溫；對(duì)一些具有生物活性的生物分子分析時(shí)柱溫應(yīng)低于室溫。液相色譜常用柱溫范圍為室溫至65。 第二節(jié) 高效液相色譜儀 （四）色譜柱柱效的評(píng)價(jià) 中國(guó)藥典2000版附錄中規(guī)定，用高效液相色譜法建立分析方法時(shí)，需進(jìn)行“色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)”，給出分析狀態(tài)下色譜柱（應(yīng)達(dá)到的）最小理論塔板數(shù)、分離度和拖尾因子。購(gòu)買新柱時(shí)也需檢驗(yàn)柱性能是否合乎要求。常用色譜柱柱效評(píng)價(jià)條件如下。第二節(jié) 高效液相色譜儀

12、硅膠柱 樣品：苯、萘、聯(lián)苯及菲（用己烷配制）；流動(dòng)相：無(wú)水己烷。 反相色譜柱（ODS柱等） 樣品：尿嘧啶（測(cè)死時(shí)間用）、硝基苯、萘及芴（或甲醇配制的硅膠柱樣品）；流動(dòng)相：甲醇-水(85:15, V/V)或乙腈-水(60:40, V/V)。 正相色譜柱（氰基與氨基柱等） 樣品：四氯乙烯（測(cè)死時(shí)間用）、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二正丁酯及肉桂醇。也可用偶氮苯、氧化偶氮苯及硝基苯為樣品；以正庚烷為流動(dòng)相。 按上述條件，測(cè)得各組分的W1/2及tR，求出理論塔板數(shù)n及相鄰組分的分離度R(1.5)。第二節(jié) 高效液相色譜儀 五、 檢測(cè)系統(tǒng) 理想的檢測(cè)器應(yīng)具有靈敏度高、響應(yīng)快、重現(xiàn)性好、線性范圍寬、使用范圍

13、廣、死體積小、對(duì)流動(dòng)相流量和溫度波動(dòng)不敏感等特性。第二節(jié) 高效液相色譜儀 （一） 紫外檢測(cè)器(ultraviolet detector, UVD) 紫外檢測(cè)器是HPLC應(yīng)用最普遍的檢測(cè)器，也是高效液相色譜儀配置最多的檢測(cè)器。主要用于具有-或者是p-共軛結(jié)構(gòu)的化合物。具有靈敏度高、精密度及線性范圍較好、不破壞樣品、對(duì)溫度及流動(dòng)相流速波動(dòng)不敏感、可用于梯度洗脫、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，屬濃度型檢測(cè)器。缺點(diǎn)是不適用于對(duì)紫外光無(wú)吸收的樣品，流動(dòng)相選擇有限制（流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)必須小于檢測(cè)波長(zhǎng)），目前的儀器常用的有可變波長(zhǎng)型及二極管陣列檢測(cè)器。第二節(jié) 高效液相色譜儀(一） 紫外檢測(cè)器(ultraviolet de

14、tector, UVD) 1可變波長(zhǎng)型檢測(cè)器 相當(dāng)于一臺(tái)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，波長(zhǎng)可按需要任意選擇，選擇樣品的最大吸收波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)，以增加檢測(cè)靈敏度。但由于光源是通過(guò)單色器分光后照射到樣品上，光源強(qiáng)度及透射光的強(qiáng)度都相應(yīng)減弱。因此，這種檢測(cè)器對(duì)光電轉(zhuǎn)換元件及放大器要求都較高。第二節(jié) 高效液相色譜儀2光電二極管陣列檢測(cè)器 由光源發(fā)出的紫外或可見(jiàn)光通過(guò)檢測(cè)池，所得組分特征吸收的全部波長(zhǎng)經(jīng)光柵分光、聚焦到二極管陣列上同時(shí)被檢測(cè)(圖22-6)，計(jì)算機(jī)快速采集數(shù)據(jù)，便得到三維色譜光譜圖，即每一個(gè)峰的在線紫外光譜圖。其中二極管陣列檢測(cè)元件可由1024（512或211）個(gè)光電二極管陣列組成，可同時(shí)檢測(cè)190

15、800nm全部紫外光和可見(jiàn)光的波長(zhǎng)范圍內(nèi)的信號(hào)。（A-t曲線）及每個(gè)色譜組分的光譜圖（A-曲線），即三維時(shí)間-色譜-光譜圖，它可以提供關(guān)于色譜分離、定性、定量的豐富信息，可以同時(shí)得到多個(gè)波長(zhǎng)的色譜圖，計(jì)算不同波長(zhǎng)的相對(duì)吸收比，可以在色譜分離期間，對(duì)每個(gè)色譜峰的指定位置實(shí)時(shí)記錄吸收光譜圖，并計(jì)算最大吸收波長(zhǎng)。也可以用計(jì)算機(jī)將兩個(gè)譜圖繪在一張三維坐標(biāo)圖上（t、A、分別為X、Y、Z軸），而獲得三維光譜-色譜圖。光電二極管陣列檢測(cè)器第二節(jié) 高效液相色譜儀（二） 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 （evaporative light-scattering detector，ELSD） 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器是90年代出現(xiàn)的新

16、型泛用檢測(cè)器。這種檢測(cè)器是將流出色譜柱的流動(dòng)相及組分先引入通載氣（常用高純氮）的蒸發(fā)室，在蒸發(fā)室和漂移加熱管中，流動(dòng)相蒸發(fā)而除去，樣品組分則在蒸發(fā)室內(nèi)形成不揮發(fā)的微小顆粒，在漂移管末端，此微粒在強(qiáng)光照射下產(chǎn)生光散射（丁鐸爾光效應(yīng)），用光電倍增管檢測(cè)到的散射光與組分的量成正比。為避免透射光的影響，光電倍增管和入射光的角度應(yīng)在90 o 160 o，一般選用120 o，以利于測(cè)量到衍射光的最大強(qiáng)度。第二節(jié) 高效液相色譜儀此檢測(cè)器是一種通用型的質(zhì)量檢測(cè)器，對(duì)所有固體物質(zhì)（檢測(cè)時(shí)）均有幾乎相等的響應(yīng)，檢測(cè)限一般為810ng，可用于揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品組分，但對(duì)于有紫外吸收的組分的檢測(cè)靈敏度較低。E

17、LSD可用于梯度洗脫，除可用作HPLC檢測(cè)器，還可用作超臨界色譜(SFC)的檢測(cè)器，特別適用于無(wú)紫外吸收的樣品，主要用于糖類、高分子化合物、高級(jí)脂肪酸、維生素及甾體類等化合物，是一種正在迅速發(fā)展中的檢測(cè)器。第二節(jié) 高效液相色譜儀（三） 熒光檢測(cè)器(fluorophotometric detector, FD) 熒光檢測(cè)器用于在紫外光的激發(fā)下能發(fā)熒光的化合物，或不產(chǎn)生熒光的物質(zhì)但能利用熒光試劑在柱前或柱后衍生化制成熒光衍生物的檢測(cè)。在現(xiàn)有高效液相檢測(cè)器中，靈敏度最高，比紫外檢測(cè)器的靈敏度高2個(gè)數(shù)量級(jí)，選擇性也好。常用于酶、甾族化合物、維生素、氨基酸等成分的HPLC分析，是體內(nèi)藥物分析常用的檢測(cè)器

18、。第二節(jié) 高效液相色譜儀六、數(shù)據(jù)記錄與處理系統(tǒng) 數(shù)據(jù)記錄與處理系統(tǒng)是將色譜系統(tǒng)的檢測(cè)信號(hào)變成為下一步使用的永久性的記錄的裝置。分析結(jié)果可用原始記錄儀繪制譜圖，數(shù)據(jù)以圖表的形式打印出來(lái)，或貯存在磁盤(pán)中，現(xiàn)已廣泛使用微處理機(jī)和色譜工作站來(lái)記錄和處理色譜分析的數(shù)據(jù)。每次色譜分析結(jié)束，打印繪圖機(jī)可當(dāng)場(chǎng)繪出色譜圖，同時(shí)標(biāo)出每個(gè)色譜峰的名稱、保留時(shí)間、峰高或峰面積，在計(jì)算峰面積時(shí)，可自動(dòng)修正和優(yōu)化色譜分析數(shù)據(jù)。硬件是一臺(tái)微型計(jì)算機(jī)，加上色譜數(shù)據(jù)采集卡和色譜儀器控制卡。軟件包括色譜儀實(shí)時(shí)控制程序，峰識(shí)別和峰面積積分程序，定量計(jì)算程序，報(bào)告打印程序等。色譜工作站在數(shù)據(jù)處理方面的功能有：色譜峰的識(shí)別、基線的校正

19、、重疊峰和畸形峰的解析，計(jì)算峰參數(shù)（包括保留時(shí)間、峰高、峰面積、半峰寬等），定量計(jì)算組分含量等。第二節(jié) 高效液相色譜儀 七、 儀器性能 色譜儀實(shí)際是由分離和檢測(cè)兩大部分組成，儀器性能指標(biāo)應(yīng)包括這兩部分。儀器性能主要指流量重復(fù)性、噪音、漂移、敏感度、線性、定性定量重復(fù)性。紫外檢測(cè)器及熒光檢測(cè)器等光學(xué)檢測(cè)器，還有波長(zhǎng)精度等指標(biāo)。第三節(jié) 高效液相色譜法的基本理論 來(lái)源于氣相色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)理論速率理論，也適用于液相色譜。液相色譜中以液體作為流動(dòng)相，由于液體與氣體在擴(kuò)散系數(shù)、粘度、表面張力、密度等方面的差別，因此，主要表現(xiàn)在液相色譜的速率理論方程式中縱向擴(kuò)散項(xiàng)（B/）及傳質(zhì)阻力項(xiàng)(C)對(duì)H值的影響與氣

20、相色譜不同。第三節(jié) 高效液相色譜法的基本理論 Van Deemter方程式用于液相色譜與氣相色譜的區(qū)別，主要表現(xiàn)在縱向擴(kuò)散項(xiàng)（B/）及傳質(zhì)阻抗項(xiàng)(C)的差別上，在液相色譜中，流動(dòng)相是液體，粘度()比氣體大的多，柱溫又比氣相色譜低的多（HPLC多采用室溫），又因DmT/,因此液相色譜的Dm比氣相色譜的Dm約小105倍。其次，為了節(jié)約分析時(shí)間，在液相色譜中，所采用的流動(dòng)相的流速，一般至少是最佳流速的35倍。這些因素都促使縱向擴(kuò)散項(xiàng)B/減小，一般可忽略不計(jì)，于是Van Deemter方程式在HPLC中的表達(dá)式為：第三節(jié) 高效液相色譜法的基本理論此式說(shuō)明在HPLC中，可以近似地認(rèn)為流動(dòng)相的流速與板高成

21、直線關(guān)系，A為截距，C為斜率。流速增大，板高增加，色譜柱柱效降低。為了兼顧柱效與分析速度，一般都盡可能地采用較低流速。內(nèi)徑4.6mm柱，流量多采用1mL/min。流動(dòng)相的流速對(duì)GC與HPLC板高影響的差別如圖 第三節(jié) 高效液相色譜法的基本理論由圖22-9可知：當(dāng)uu最佳時(shí)，B/u項(xiàng)對(duì)板高起主要作用，即u越小，柱效越低；當(dāng)uu最佳時(shí)，Cu項(xiàng)對(duì)板高起主要作用，即流速（u）越大，柱效越低；當(dāng)u=u最佳時(shí)，分子擴(kuò)散項(xiàng)（B/u）對(duì)板高的貢獻(xiàn)可以忽略。由H最小可以看出，HPLC比GC有更高的柱效。由低的u最佳值可看出H-u曲線有平穩(wěn)的斜率，表明要用高的液體流速時(shí)，柱效無(wú)明顯損失。第三節(jié) 高效液相色譜法的基

22、本理論從渦流擴(kuò)散項(xiàng)與傳質(zhì)阻抗項(xiàng)對(duì)HPLC柱效的影響可以認(rèn)為：為了使A減小，提高色譜柱柱效，可從兩方面采取措施：降低dp。采用小粒度固定相，直徑越小，A越小，以前多用10m固定相，目前商品柱多采用35m粒徑的固定相。降低。采用球形、顆粒度分布（RSD5%）固定相。球形固定相，除了能降低外，還能增加柱滲透性，降低柱壓。35m球形固定相，柱效一般為85104/m，可高達(dá)1105/m 。傳質(zhì)阻抗項(xiàng)是傳質(zhì)阻抗系數(shù)與流動(dòng)相流速之積.傳質(zhì)阻抗系數(shù)在HPLC中與在GC不同,在HPLC中傳質(zhì)阻抗系數(shù)由3個(gè)系數(shù)組成C = Cm + Csm + Cs 式中, Cm 、Csm 及Cs分別是組分在流動(dòng)相、靜態(tài)流動(dòng)相和固

23、定相中的傳質(zhì)阻抗系數(shù)。由于通常都采用化學(xué)鍵合相，它的“固 定液”是鍵合在載體表面固定液官能團(tuán)的單分子層。因此，固定液的傳質(zhì)阻抗可以忽略。于是C = Cm + Csm 由此得到HPLC最常見(jiàn)的Van Deemter方程式的表現(xiàn)形式H = A + Cm + Csm 此式說(shuō)明：HPLC色譜柱的理論塔板高度，主要由渦流擴(kuò)散項(xiàng)、 流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗項(xiàng)和靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗項(xiàng)三項(xiàng)所構(gòu)成。第三節(jié) 高效液相色譜法的基本理論 Van Deemter方程式所獲得的降低板高提高柱效的方法可概括為：采用小粒度、窄分布的球形固定相，首選化學(xué)鍵合相；采用低粘度流動(dòng)相，低流量（1mL/min）；柱溫以2530為宜。太低，則使流動(dòng)

24、相的粘度增加，溫度高易產(chǎn)生氣泡。第四節(jié) 各類高效液相色譜法一、分配色譜分配色譜法（partition chromatography ）又稱液-液分配色譜法（liquid-liquid partition chromatography）,是根據(jù)物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間相對(duì)溶解度的不同，而在兩相間進(jìn)行不同分配實(shí)現(xiàn)分離的方法。分配系數(shù)較大的組分，保留值也較大。第四節(jié) 各類高效液相色譜法 (一)正相分配色譜法流動(dòng)相極性小于固定相極性，稱為正相分配色譜法（mormal phase partition chromatography），它對(duì)于極性強(qiáng)的組分有較大的保留值，常用于分離強(qiáng)極性化合物。由于以含水硅膠

25、為固定相，固定液易流失，現(xiàn)已采用正相鍵合相色譜代替，常用氰基或氨基化學(xué)鍵合相。氰基鍵合相以硅膠作載體，用氰乙基取代硅膠的羥基，形成氰基化學(xué)鍵合相，其分離選擇性與硅膠相似，但極性小于硅膠。分離機(jī)制主要靠誘導(dǎo)作用力，分離對(duì)象主要是可誘導(dǎo)極化的化合物或極性化合物。 第四節(jié) 各類高效液相色譜法(一)正相分配色譜法氨基鍵合相是用丙氨基取代硅膠的羥基而成，與硅膠性質(zhì)有較大差異，前者為堿性，后者為酸性，因而具有不同的選擇性。分離機(jī)制主要為誘導(dǎo)作用力和氫鍵作用力，主要用于分析糖類物質(zhì)。由于固定相是極性填料，流動(dòng)相常選用低極性溶劑如烴類，加入適量極性溶劑、醇類等調(diào)節(jié)洗脫液。梯度洗脫時(shí)，通常逐漸增大洗脫劑中極性溶

26、劑的比例，故樣品中極性小的組分先流出，極性大的組分后流出。第四節(jié) 各類高效液相色譜法(二)反相分配色譜法流動(dòng)相極性大于固定相極性的稱為反相分配色譜法（reversed phase partition chromatography）。它對(duì)于極性弱的組分有較大的保留值，適合于分離弱極性的化合物。極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上，形成化學(xué)鍵合固定相，取代了機(jī)械涂漬的液體固定相。 第四節(jié) 各類高效液相色譜法 典型的反相鍵合相色譜是將十八烷基鍵合在硅膠表面所得的SOD柱上，采用甲醇水或乙腈水作流動(dòng)相，分離非極性和中等極性的化合物

27、。其分離機(jī)制常用疏溶劑理論來(lái)解釋。當(dāng)非極性溶質(zhì)或溶質(zhì)分子中的非極性部分進(jìn)入到極性流動(dòng)相中時(shí)，由于疏溶劑效應(yīng)，分子中的非極性部分與極性溶劑分子間產(chǎn)生排斥力，和鍵合相的烴基產(chǎn)生疏溶劑締合。此時(shí)溶質(zhì)的保留主要不是由于溶質(zhì)分子與鍵合相間的色散力。非離子型溶質(zhì)分子與鍵合相非極性烴基間的締合反應(yīng)是可逆的。流動(dòng)相的表面張力越高，締合力越強(qiáng)。反之，若溶質(zhì)分子有極性官能團(tuán)存在時(shí)，則與極性溶劑間的作用力 增強(qiáng)，而不利于締合。第四節(jié) 各類高效液相色譜法二、 吸附色譜吸附色譜法（adsorption chromatography）又稱液-固吸附色譜法(liquid-solid adsorption chromato-

28、graphy)，是根據(jù)被分離組分的分子與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心，靠溶質(zhì)分子的吸附系數(shù)的差別而分離。適合于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性樣品，在常用的幾種高效液相色譜法中，吸附色譜法是分離異構(gòu)體的最好方式。第四節(jié) 各類高效液相色譜法三、離子交換色譜 離子交換色譜（ion exchange chromatography, IEC）是以離子交換劑為固定相，用緩沖液為流動(dòng)相，根據(jù)選擇性差別而分離的方法。早期采用高分子聚合物，如苯乙烯二乙烯苯為基體的離子交換樹(shù)脂為固定相，由于遇溶劑膨脹、不耐壓以及表面的微孔型結(jié)構(gòu)影響傳質(zhì)速率等弱點(diǎn)，已被鍵合離子交換劑（離子型鍵合相）所代替。鍵合離子交換劑多以薄殼

29、型或全多孔微粒硅膠為載體，表面經(jīng)化學(xué)反應(yīng)鍵合上各種離子交換基團(tuán)。強(qiáng)酸性磺酸型（-SO3H）與強(qiáng)堿性季銨鹽型（-NR3Cl）鍵合相，分別為常用陽(yáng)離子與陰離子交換劑。第四節(jié) 各類高效液相色譜法三、離子交換色譜 離子交換色譜廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里，如氨基酸分析、肽和蛋白質(zhì)的分離。也可作為有機(jī)和無(wú)機(jī)混合物的分離，還可作為對(duì)水、緩沖劑、尿、甲酰胺、丙烯酰胺的純化手段，從有機(jī)物溶液中去除離子型雜質(zhì)等。第四節(jié) 各類高效液相色譜法四、離子色譜 離子色譜法（ion chromatography ,IC）是離子交換色譜法的最重要進(jìn)展，固定相為離子交換樹(shù)脂，流動(dòng)相為電解質(zhì)溶液，通常以電導(dǎo)檢測(cè)器為通用檢測(cè)器。離子色

30、譜法分為化學(xué)抑制型離子色譜法（雙柱離子色譜法）和非抑制型離子色譜法（單柱離子色譜法）兩大類。第四節(jié) 各類高效液相色譜法 以典型的雙柱離子色譜法，簡(jiǎn)要說(shuō)明其檢測(cè)原理及特點(diǎn)。該法是用兩根離子交換柱，一根為分析柱，另一根為抑制柱，兩根色譜柱串聯(lián)，用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)。由于抑制柱裝有與分析柱相反的離子交換劑，因而高濃度的酸、堿洗脫液（流動(dòng)相）通過(guò)抑制柱后變?yōu)樗似涓唠妼?dǎo)本底，以利于對(duì)樣品離子信號(hào)的檢測(cè)。另一特點(diǎn)是離子色譜儀的泵及流路等，用耐腐蝕材料制成。 離子色譜法應(yīng)用很廣，不但可以分析無(wú)機(jī)與有機(jī)陰、陽(yáng)離子，而且可以分析氨基酸，以及糖類和DNA、RNA的水解產(chǎn)物等。離子色譜儀第四節(jié) 各類高效液相色譜

31、法五、離子對(duì)色譜 在固定相上涂漬或流動(dòng)相中加入溶質(zhì)分子電荷相反的離子對(duì)試劑，進(jìn)行分離離子型或可離子化的化合物的方法稱為離子對(duì)色譜法（ion pair chromato-graphy，IPC）或離子對(duì)色譜（paired ion chromato-graphy, PLC），是由離子對(duì)萃取發(fā)展而成的一種分離分析的方法。 第四節(jié) 各類高效液相色譜法離子對(duì)萃取是一種液液分配分離離子型化合物的技術(shù)，這種萃取方法是選擇合適的反電荷離子加入到水相中，與被分離化合物形成離子對(duì)，離子對(duì)表現(xiàn)為非離子性的中性物質(zhì)，被萃取到有機(jī)相中 。離子對(duì)色譜法分為兩類：正相離子對(duì)色譜和反相離子對(duì)色譜法。現(xiàn)在最常用的是反相離子對(duì)色譜

32、，它使用反相譜中常用的固定相（如ODS），能同時(shí)分離離子型化合物和中性化合物。第四節(jié) 各類高效液相色譜法反相離子對(duì)色譜常用非極性疏水固定相，在強(qiáng)極性溶劑中加入與被分離離子電荷相反的平衡離子（如B-），當(dāng)樣品（含有被分離的離子A+）進(jìn)入色譜柱之后，A+和B-相互作用生成中性化合物AB，AB就會(huì)被疏水性固定相溶解或吸附，按照它和固定相及流動(dòng)相之間的作用力大小被流動(dòng)相洗脫下來(lái)。 第四節(jié) 各類高效液相色譜法第四節(jié) 各類高效液相色譜法常用的流動(dòng)相是甲醇-水和乙腈-水，增加甲醇或乙腈，k值減小。在流動(dòng)相中增加有機(jī)溶劑的比例，應(yīng)考慮離子對(duì)試劑的溶解度。流動(dòng)相酸度對(duì)保留值的影響，一般pH在27.4比較合適。離

33、子對(duì)試劑的種類，大小及濃度都對(duì)分離有很大的影響，選擇離子對(duì)試劑的種類決定于被分離樣品的性質(zhì)。 第四節(jié) 各類高效液相色譜法反相離子對(duì)色譜在許多領(lǐng)域中得到應(yīng)用，如無(wú)機(jī)陰離子、陽(yáng)離子、生物堿、維生素、抗菌素以及其它藥物的分析，在生物化學(xué)、石油化工等方面也有很多應(yīng)用。第四節(jié) 各類高效液相色譜法六、尺寸排阻色譜尺寸排阻色譜（size exclusion chromatography, SEC）用化學(xué)惰性的多孔性凝膠作固定相，按固定相對(duì)樣品中各組分分子體積阻滯作用的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。SEC是快速分離不同分子量混合物的色譜方法，可以快速地確定樣品混合物的復(fù)雜組分，并同時(shí)給出各個(gè)組分的大概分子量及分布。第四節(jié)

34、各類高效液相色譜法常用的流動(dòng)相有四氫呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、鄰二氯苯、間甲酚、緩沖溶液等。第四節(jié) 各類高效液相色譜法七、膠束色譜以膠束水溶液為流動(dòng)相的色譜法稱為膠束色譜法（micellar chromatography, MC）。因?yàn)樵诹鲃?dòng)相中又增加了一相（膠束相），故又稱為假相色譜。該系統(tǒng)具有：固定相-流動(dòng)相-膠束-固定相，三個(gè)界面、三個(gè)分配系數(shù)，因此有較好的選擇性。其次是膠束水溶液無(wú)毒、便宜、安全。第五節(jié) 固定相色譜柱是高效液相色譜的心臟，其中的固定相（stationary phase或稱為填充劑、填料），是保證色譜柱高柱效和高分離度的關(guān)鍵。高效液相色譜法對(duì)固定相的要求比氣相色譜法高得

35、多。主要類型的固定相有硅膠、化學(xué)鍵合相、離子交換劑等。 一、硅 膠是液-固吸附色譜常用的固定相之一。分為表孔硅膠、無(wú)定形全多孔硅膠、球形全多孔硅膠及堆積硅珠等類型 。表面多孔型硅膠粒度約為3070m，現(xiàn)已很少應(yīng)用。無(wú)定形全多孔硅膠約510m，球形全多孔硅膠約為310m，堆積硅珠約為35m。硅膠的主要性能參數(shù)有：形狀、粒度、粒度分布、比表面積及平均孔徑等。硅膠是應(yīng)用很廣的固定相，主要用于分離溶于有機(jī)溶劑的極性至弱極性的分子型化合物。也可用于分離某些幾何異構(gòu)體。二、化 學(xué) 鍵 合 相二、化學(xué)鍵合相 （一）非極性鍵合相 （二）中等極性鍵合相 （三）極性鍵合相二、化 學(xué) 鍵 合 相 用化學(xué)反應(yīng)的方法將

36、固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面上，所形成的填料稱為化學(xué)鍵合相（chemically bonded phase），簡(jiǎn)稱鍵合相。化學(xué)鍵和固定相的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)固定液流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性和使用壽命；化學(xué)性能穩(wěn)定，在pH28的溶液中不變質(zhì)；傳質(zhì)過(guò)程快，柱效高；載樣量比硅膠約大一個(gè)數(shù)量級(jí)；適于作梯度洗脫。 化學(xué)鍵合固定相兼有分配作用和一定的吸附作用，吸附作用的大小視鍵合覆蓋率而定。用化學(xué)反應(yīng)方法將載體表面上殘存的硅醇基除去，稱為封尾、封頂或遮蓋，所形成鍵合相稱為封尾鍵合相。這種鍵合相沒(méi)有吸附作用，強(qiáng)疏水是其缺點(diǎn)。二、化 學(xué) 鍵 合 相化學(xué)鍵合相不僅可用于正相色譜、反相色譜，還用于離子對(duì)色譜、離子交換色譜等

37、。特別是反相化學(xué)鍵合相色譜應(yīng)用最廣。按固定液（基團(tuán)）與載體（硅膠表面Si-OH基團(tuán)）相結(jié)合的化學(xué)鍵類型，主要可分為硅氧碳鍵型（Si-O-C）與硅氧硅碳鍵型 (Si-O-Si-C)。Si-O-C型鍵合相因易發(fā)生水解或與酯發(fā)生交換反應(yīng)而損壞，已淘汰。Si-O-Si-C型穩(wěn)定性好，容易制備是目前應(yīng)用最廣泛的鍵合相。按極性可分為非極性、中等極性與極性三類。反相色譜常用非極性和中等極性鍵合相。極性鍵合相為正相色譜所用。二、化 學(xué) 鍵 合 相（一）非極性鍵合相這類鍵合相表面基團(tuán)為非極性烴基，如十八烷基、辛烷基、甲基與苯基等。應(yīng)用最廣的十八烷基鍵合相（ODS或C18）是由十八烷基氯硅烷試劑與硅膠表面的硅醇基

38、，經(jīng)多步反應(yīng)脫HCl生成ODS鍵合相。鍵合反應(yīng)示意如下：二、化 學(xué) 鍵 合 相 1載體性質(zhì) 多數(shù)產(chǎn)品采用全多孔YWG(液相、無(wú)定形、硅膠)、YQG（液相、全多孔、硅膠）或堆積硅珠作為ODS鍵合相的載體。載體的比表面決定鍵合基團(tuán)的總量，總量大，k大，保留時(shí)間長(zhǎng)。渦流擴(kuò)散項(xiàng)與柱滲透性，取決于載體的形狀，以球形為好。按載體不同分為各種型號(hào)。國(guó)產(chǎn)品：YWG-C18H37(5、10m)、YQG-C18H37(堆積硅珠，35m)及YWG-C6H5(5、10m)等。固定相代號(hào)的前部為載體，后部為官能團(tuán)。進(jìn)口品：Nucieosil C18（球形，3m或5m）及Zorbax-ODS（球形，5m）等。二、化 學(xué)

39、鍵 合 相 2表面覆蓋度 在硅膠表面，每平方納米約有6個(gè)硅醇基可供化學(xué)鍵合。由于鍵合基團(tuán)的立體結(jié)構(gòu)障礙，使這些硅醇基不能全部參加鍵合反應(yīng)。表面覆蓋度的大?。▍⒓臃磻?yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例），決定鍵合相是分配還是吸附占主導(dǎo)。Partisil 5-ODS表面覆蓋度為98%，即殘存2%的硅醇基，分配占主導(dǎo)。例Partisil 5-ODS表面覆蓋度為50%，既有分配又有吸附作用。封尾鍵合相只有分配作用，如國(guó)內(nèi)產(chǎn)品YWG-FN是用氟酰胺遮蓋了硅膠的吸附部位，分離效果良好，但疏水性強(qiáng)。在同樣分離條件下，柱壓高于普通鍵合相柱。二、化 學(xué) 鍵 合 相3鍵合基團(tuán)的鏈長(zhǎng) 鏈長(zhǎng)增加，極性降低，載樣量

40、增大，k值增大，如C18基團(tuán)大于C8。ODS鍵合相最大允許載樣量為每克固定相210-3g。（二）中等極性鍵合相常見(jiàn)的有醚基鍵合相（代號(hào)ETH或ROR）。這種鍵合相可作正相或反相色譜的固定相，視流動(dòng)相的極性而定。國(guó)產(chǎn)品如YWG-ROR(5、10m)。進(jìn)口品如Permaphase-ETH（表孔硅膠、2537m）。 （三）極性鍵合相常用極性鍵合相為氨基鍵合相（強(qiáng)極性）、氰基鍵合相（中強(qiáng)極性），是分別將氨丙硅烷基-Si(CH2)3NH2及氰乙硅烷基-Si(CH2)2CN鍵合在硅膠上而制成。它們可用作正相色譜的固定相。（三）極性鍵合相氨基鍵合相是分析糖類最常用的固定相，常用乙腈-水為流動(dòng)相，而不用烷烴，

41、因?yàn)樘遣蝗芙庥谕闊N。氰基鍵合相的分離選擇性與硅膠相似，但極性比硅膠弱。因此，在相同流動(dòng)相條件下的保留值較硅膠小。若要維持相似的保留值，則需用極性更小的流動(dòng)相洗脫。許多能在硅膠上分離的樣品，可以在氰基鍵合相上完成。氰基鍵合相對(duì)雙鍵異構(gòu)體有很好的分離選擇性。（三）極性鍵合相國(guó)產(chǎn)品：YWG-CN及YWG-NH2 (5m或10m)； YQG-CN及YQG-NH2（5m或10m）。進(jìn)口品：Lichrosorb CN(無(wú)定形，10m)、 Zorbax-CN(球形，46m)等。此處介紹的化學(xué)鍵合相是用于反相與正相色譜的化學(xué)鍵合相。廣義的化學(xué)鍵合相，還包括鍵合型離子交換劑、手性固定相及親合色譜固定相等。三、凝

42、 膠尺寸排阻色譜法常用的固定相為具有一定孔徑范圍的多孔性凝膠。所謂凝膠是含有大量液體（一般是水）的柔軟而富于彈性的物質(zhì)，是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。根據(jù)強(qiáng)度，這類凝膠可分為軟質(zhì)、半硬質(zhì)及硬質(zhì)三種。軟質(zhì)凝膠在壓強(qiáng)0.1MPa左右即被壓壞，因此這類凝膠只適用于常壓下的分子排阻色譜法，不適用于高效液相色譜。三、凝 膠（一）半硬質(zhì)凝膠 由苯乙烯和二乙烯苯交聯(lián)而成，顆粒直徑約10m，表面是非極性的，適用于以非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的凝膠滲透色譜。優(yōu)點(diǎn)是具有可壓縮性，填得緊密，柱效高。缺點(diǎn)是醇類、丙酮等極性溶劑對(duì)其有溶脹效應(yīng)，不宜使用。三、凝 膠（二）硬質(zhì)凝膠 有多孔硅膠及多孔玻璃珠等，它主要

43、為無(wú)機(jī)材料。其優(yōu)點(diǎn)是在有機(jī)溶劑中不變形，孔徑尺寸固定，溶劑互換性好。缺點(diǎn)是裝柱時(shí)較易碎，不易裝緊，因此柱效較低，一般為有機(jī)膠的1/31/4。它的吸附性較強(qiáng)，有時(shí)易拖尾。三、凝 膠 （三）凝膠的主要性能參數(shù) 凝膠的分子量排斥極限和平均孔徑是凝膠性能的主要參數(shù)。 凝膠的分子量排斥極限（或分子量范圍）是指指定的高分子化合物達(dá)到某分子量后，而不能進(jìn)入凝膠的所有孔徑，此時(shí)的分子量稱為該凝膠的分子量排斥極限。選擇凝膠時(shí)，必須使樣品的分子量小于凝膠的分子量排斥極限而大于全滲透點(diǎn)的分子量，即使樣品的分子量落入凝膠的“分子量范圍”。否則，tR（或VR）將不隨分子量而變化。四、離子交換劑常用的離子交換劑包括離子交

44、換樹(shù)脂和離子交換鍵合相兩類。離子交換色譜法早期采用離子交換樹(shù)脂作固定相。因這種固定相具有膨脹性、不耐壓，以及表面的微孔結(jié)構(gòu)影響傳質(zhì)速率，已被離子型鍵合相所代替。四、離子交換劑最常見(jiàn)的離子型鍵合相是以薄殼型或全多孔微粒硅膠為載體，其表面經(jīng)化學(xué)鍵合上所需的各種離子交換基團(tuán)。按鍵合離子交換基團(tuán)可分為陽(yáng)離子鍵合相（強(qiáng)酸性和弱酸性），常用強(qiáng)酸性磺酸型交換基為亞硫酸基（-SO3H）；陰離子鍵合相（強(qiáng)堿性和弱堿性），常用強(qiáng)堿性季銨鹽型交換基為季銨鹽（-NR3Cl）。四、離子交換劑常用國(guó)產(chǎn)的離子交換鍵合相有YWG-SO3H、YWG-R3NCl、YSG-SO3Na及YSG- R3NCl。進(jìn)口品有Zipax-SA

45、X（系薄殼載體強(qiáng)陰離子鍵合相）、Lichrosorb Si 100 SCX（全多孔無(wú)定形強(qiáng)陽(yáng)離子鍵合相）、Zipax-SCX（薄殼型陽(yáng)離子鍵合固定相）、Zipax-WAX及Zipax-WCX（分別為薄殼載體弱陰離子及弱陽(yáng)離子鍵合固定相）等。第六節(jié) 流 動(dòng) 相在液相色譜中，流動(dòng)相可以從有機(jī)溶劑到水溶液，既能用純?nèi)軇部捎枚蚨嘣旌先軇?。流?dòng)相溶劑的性質(zhì)和組成對(duì)色譜柱效、分離選擇性和組分的k值影響很大。改變流動(dòng)相的性質(zhì)和組成，是提高色譜系統(tǒng)分離度和分析速度的重要手段。一、流動(dòng)相選擇的一般要求（一）化學(xué)惰性好。如液-液分配色譜中用作流動(dòng)相的溶劑應(yīng)與固定相不互溶，高純度，以防所含微量雜質(zhì)在柱中積

46、累，引起柱性能的改變。液固色譜中，硅膠吸附劑不能用堿性溶劑（如胺類）；氧化鋁吸附劑不能用酸性溶劑。 （二）選用的溶劑性能應(yīng)與所使用的檢測(cè)器相互匹配。如使用紫外吸收檢測(cè)器，就不能選用在檢測(cè)波長(zhǎng)有紫外吸收的溶劑。一、流動(dòng)相選擇的一般要求（三）溶劑對(duì)樣品有足夠的溶解能力，以提高測(cè)定的靈敏度，同時(shí)避免在柱頭產(chǎn)生沉淀。（四）選擇的溶劑應(yīng)具有低的粘度和適當(dāng)?shù)偷姆悬c(diǎn)。使用低粘度溶劑，可減少溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力，利于樣品的純化。（五）應(yīng)盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑，以保證操作人員的安全。一、流動(dòng)相選擇的一般要求一、流動(dòng)相選擇的一般要求二、常用流動(dòng)相溶劑的性質(zhì) （一）沸點(diǎn)(b.p) （二）粘度() （三）互溶性 （

47、四）流動(dòng)相溶劑的極性二、常用流動(dòng)相溶劑的性質(zhì)（一）沸點(diǎn)(b.p) 大部分可供選用的溶劑沸點(diǎn)較低，這樣便于回收分離樣品。在LC-MS聯(lián)用技術(shù)中，低沸點(diǎn)溶劑不適用于往復(fù)泵，容易在泵體形成氣泡，影響泵的輸液精度。（二）粘度() 隨溶劑粘度增加，傳質(zhì)速率降低，柱效下降。在柱壓降（P）一定時(shí)，流動(dòng)相線速度與其粘度成反比，應(yīng)盡可能選用低粘度溶劑。除采用水溶液的離子交換色譜外，保持溶劑粘度低于0.40.5厘泊（cP）是不困難的。（三）互溶性 在采用二元混合溶劑時(shí)應(yīng)考慮溶劑的互溶性，防止溶劑分層。二、常用流動(dòng)相溶劑的性質(zhì)（四）流動(dòng)相溶劑的極性高效液相色譜中的流動(dòng)相由于它在兩相分配過(guò)程中起著重要作用，為了描述它

48、和溶質(zhì)作用力的大小，有必要對(duì)流動(dòng)相的綜合作用力給以定量的表示，即“極性”。在高效液相色譜中常用Rohrschneider的數(shù)據(jù)來(lái)描述溶劑的極性，以極性參數(shù)P表示，表22-5中列出常用溶劑的P,其中水的極性最大。在正相色譜中，P越大，洗脫能力越強(qiáng)，在反相色譜中，P越大，洗脫能力越弱。調(diào)節(jié)溶劑極性可使樣品組分的容量因子在適宜范圍。一般粗略的說(shuō)P值改變2個(gè)單位，k就改變10倍。二、常用流動(dòng)相溶劑的性質(zhì)在色譜分析中流動(dòng)相常常由兩種或兩種以上不同的溶劑組成。這種混合溶劑的極性是由它的各種組分根據(jù)其所占份額而貢獻(xiàn)的極性之和構(gòu)成。如A和B兩組分組成混合溶劑，其極性參數(shù)可由下式計(jì)算： 式中和分別為混合溶劑中A

49、和B所占的體積分?jǐn)?shù)，Pa和Pb分別為A和B的極性參數(shù)。二、常用流動(dòng)相溶劑的性質(zhì)在吸附色譜中還可以使用溶劑強(qiáng)度參數(shù)0表示流動(dòng)相溶劑極性。0值越大，洗脫能力越強(qiáng)。調(diào)節(jié)溶劑極性可使樣品組分的k值在適應(yīng)范圍。對(duì)正相色譜、二元溶劑的極性參數(shù)和組分k值有如下關(guān)系：對(duì)反相色譜則為 =式中，和分別為初始和調(diào)整后二元溶劑的極性參數(shù)；k1和k2則為組分相應(yīng)的容量因子。二、常用流動(dòng)相溶劑的性質(zhì)例 在一反相色譜柱上，流動(dòng)相為30甲醇和70水（體積比）時(shí)，某組分的保留時(shí)間為25.6min，死時(shí)間為0.35min，如何調(diào)整溶劑配比使k5 解：即調(diào)整溶劑比例為75甲醇和25水，使k5。三、溶劑的選擇性與分類 Rohrsch

50、nieder和McReynold曾使用五或十種實(shí)驗(yàn)溶質(zhì)在氣相色譜固定液上保留值不同來(lái)測(cè)定氣相色譜固定液的分離選擇性。根據(jù)類似原理，Synder將溶劑和樣品分子間的作用力作為溶劑選擇性分類的依據(jù)，并將溶劑選擇性參數(shù)分為3類：溶劑接受質(zhì)子、給予質(zhì)子和偶極作用的能力。三、溶劑的選擇性與分類 根據(jù)3類選擇性參數(shù)Xe（質(zhì)子接受體）、Xd（質(zhì)子給予體）、Xn（強(qiáng)偶極矩），將用于液相色譜的81種溶劑的Xe，Xd ，Xn值作成三角坐標(biāo)圖（圖22-12），按具有相似選擇性原則進(jìn)行選擇性分類可分為8組溶劑。例如，組溶劑的Xe較大，是純質(zhì)子接受體，如乙醚見(jiàn)（表22-5），是強(qiáng)偶極中性化合物，是質(zhì)子給予體等。三、溶劑

51、的選擇性與分類 三、溶劑的選擇性與分類 根據(jù)溶劑的性質(zhì)和圖22-12溶劑選擇性分類，各選擇性組大致包括如下一些溶劑。組：脂肪醚（純質(zhì)子接受體）；組：脂肪醇（質(zhì)子接受-給予體）；組：吡啶衍生物、四氫呋喃（質(zhì)子接受體，易極化）；組：乙二醇、乙酸、甲酰胺；組：二氯甲烷、二氯乙烷（大偶極矩）；組：脂肪酮、酯、二氧六環(huán)；組：芳烴、芳醚、硝基甲烷；組：氟代醇、氯仿、水（質(zhì)了給予體）。各種同系物屬同一個(gè)選擇性組。三、溶劑的選擇性與分類從圖22-12可以看到，、三組溶劑距離最遠(yuǎn)。由一組溶劑變換到另一組溶劑，將發(fā)生最大的選擇性變化，如正相色譜由三氯甲烷（）變?yōu)橐颐眩ǎ┑那闆r。同一組溶劑在分離中具有相似的選擇性，

52、不同組別的溶劑，其選擇性差別較大。采用不同組別的溶劑，可顯著改變?nèi)軇┑倪x擇性。四、不同色譜模式選用的流動(dòng)相(一)吸附色譜用流動(dòng)相 對(duì)于常用硅膠作吸附劑的液固吸附色譜中，改變?nèi)軇┘纯傻玫竭m宜的k。以硅膠為吸附劑時(shí)一些溶劑的0參見(jiàn)表22-5。如果選用初始溶劑太強(qiáng)，使樣品組分的k值過(guò)小，則可由表中選值0較小的溶劑來(lái)代替；反之，若樣品組分k值太大，則選0較大的溶劑。通常吸附色譜使用二元混合溶劑作流動(dòng)相，可使溶劑強(qiáng)度隨其組成連續(xù)改變，可以獲得最佳的分離選擇性。若混合溶劑中強(qiáng)極性溶劑的含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)或含量很低，其分離因子呈現(xiàn)最大值。使用混合溶劑的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可使流動(dòng)相保持低的粘度，并可保持高的柱效。 四、

53、不同色譜模式選用的流動(dòng)相(一)吸附色譜用流動(dòng)相 吸附色譜中，樣品的值的改變可在等溶劑強(qiáng)度（0不變）下，用不同性質(zhì)的溶劑替換強(qiáng)溶劑來(lái)試驗(yàn)，找到最適宜的流動(dòng)相。選擇不同溶劑時(shí)，除考慮0值外，還應(yīng)考慮試樣分子與溶劑分子間的氫健作用等因素。因吸附色譜分離機(jī)制和薄層色譜相同，可以薄層色譜作先導(dǎo)試驗(yàn)來(lái)確定液固色譜的最優(yōu)分離條件。四、不同色譜模式選用的流動(dòng)相(二)分配色譜用流動(dòng)相 1正相分配色譜 正相色譜的固定相是極性的，故增加溶劑的，可增加洗脫能力，使組分k值下降。選擇合適值的溶劑，使樣品k值在110范圍內(nèi)，通常在飽和烷烴，流動(dòng)相主體為己烷、庚烷，可加入20%的極性改性劑。如正己烷中加入極性溶劑，調(diào)節(jié)極性

54、溶劑的比例使能達(dá)到理想的k值。若分離的選擇性不好，則改用其他組別的溶劑類改善選擇性。若二元溶劑不行，還可考慮使用三元或四元溶劑體系。四、不同色譜模式選用的流動(dòng)相(二)分配色譜用流動(dòng)相 2、反相分配色譜 反相色譜固定相是非極性的，所以溶劑的極性增加，洗脫能力增加，樣品的k值增加。使用的流動(dòng)相相似于液固色譜法中使用非極性吸附劑時(shí)應(yīng)用的流動(dòng)相。此時(shí)流動(dòng)相的主體為水，加入10%的改性劑，如二甲基亞砜、乙二醇、乙腈、甲醇、對(duì)二氧六環(huán)、乙醇、四氫呋喃、異丙醇等。四、不同色譜模式選用的流動(dòng)相(二)分配色譜用流動(dòng)相 2、反相分配色譜 溶質(zhì)在混合溶劑流動(dòng)相中的容量因子k會(huì)隨改性劑的加入而減小，表明混合溶劑的洗脫

55、強(qiáng)度增強(qiáng)。一般以水和甲醇或乙腈組成二元溶劑，已能夠滿足多數(shù)分離要求。有時(shí)也可加入適當(dāng)?shù)乃峄驂A來(lái)控制流動(dòng)相的pH值，以防止出現(xiàn)不對(duì)稱色譜峰。反相色譜常采用梯度洗脫，使每個(gè)組分都在適宜條件下獲得分離。四、不同色譜模式選用的流動(dòng)相(三)離子交換色譜 離子交換色譜流動(dòng)相常用含鹽的水溶液（緩沖溶液），有時(shí)加入適量的有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈等，以增加某些組分的溶解度。溶劑強(qiáng)度和選擇性與鹽的類型、濃度、pH值以及加入的有機(jī)溶劑的種類和濃度有關(guān)。四、不同色譜模式選用的流動(dòng)相(四)尺寸排阻色譜 排阻色譜和其他方法不同之處是，不用采取改變流動(dòng)相組成的方法來(lái)控制分離度。故選擇流動(dòng)相僅需考慮能很好溶解樣品，粘度要低，要與

56、柱填料匹配。為減少樣品和填料表面之間的相互作用（除了排阻色譜保留作用之外），如填料吸附作用和離子交換作用等，可采用控制流動(dòng)相pH值和離子強(qiáng)度來(lái)解決。第七節(jié) HPLC分析條件的選擇一、分離條件的選擇（一）分離方法的選擇 HPLC可供選擇的固定相及流動(dòng)相選擇都有自身的特點(diǎn)和應(yīng)用范圍，選擇分離類型應(yīng)根據(jù)分離分析的目的、試樣的性質(zhì)和量的多少、現(xiàn)有設(shè)備條件等來(lái)確定最合適分離條件。對(duì)于不同的樣品分離方式的選擇可參見(jiàn)下圖。第七節(jié) HPLC分析條件的選擇一、分離條件的選擇（二）梯度洗脫 根據(jù)分離度的要求，在色譜分離過(guò)程中樣品組分的k值范圍應(yīng)控制在110之間。如果樣品組分較少、性質(zhì)差別不大，一般采用等度洗脫（i

57、socratic elution）（溶劑組成與配比在一分析周期內(nèi)保持恒定）可以使所有組分的k值都處于這個(gè)范圍內(nèi)。但是對(duì)于組分?jǐn)?shù)目較多、性質(zhì)相差較大的復(fù)雜混合物，采用等度洗脫時(shí)，所選擇的溶劑強(qiáng)度對(duì)于一些組分不是太強(qiáng)就是太弱，其結(jié)果是弱保留組分很快流出，色譜峰尖而重疊在一起；強(qiáng)保留組分流出很慢，峰寬且矮平，有的甚至無(wú)法檢測(cè)。一、分離條件的選擇（二）梯度洗脫 為使復(fù)雜混合物中的各組分均得到滿意的分離，必須采用梯度洗脫（gradient elution）技術(shù)，即在一個(gè)分析周期中，程序控制流動(dòng)相的組成（如溶劑的極性、離子強(qiáng)度、pH值等）改變，使每個(gè)組分都在適宜的條件下獲得分離。梯度洗脫在液相色譜中所起的

58、作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫。一、分離條件的選擇（二）梯度洗脫 梯度洗脫可以采用二元混合溶劑或多元混合溶劑，即所謂二元梯度和多元梯度。在整個(gè)分離過(guò)程中，溶劑強(qiáng)度連續(xù)變化，這種變化是按一定程序進(jìn)行的。強(qiáng)度連續(xù)變化的溶劑是通過(guò)弱溶劑A和強(qiáng)溶劑B混合得到的。開(kāi)始B的濃度很低，然后逐漸提高B的濃度。溶劑混合比例及一定比例下的洗脫時(shí)間均由程序控制。這樣可以使不同極性的組分都能夠在比較合適的分配比下通過(guò)色譜柱，使各組分都有合適的出峰時(shí)間。一、分離條件的選擇（二）梯度洗脫梯度洗脫特別適用于極性范圍很寬的混合物分離。它的主要優(yōu)點(diǎn)是：縮短總分析時(shí)間； 提高分離度，是使k值相差103104的樣品組分，在合理分析

59、速度下得到適當(dāng)分離度的唯一方法；改善峰形，提高峰的對(duì)稱性，減少峰的區(qū)域?qū)挾?，使微量組分易被檢出，降低最小檢出量，提高檢測(cè)靈敏度。但梯度洗脫也有不足之處，如常常會(huì)引起基線漂移，且梯度洗脫的重現(xiàn)性較差。 二、檢測(cè)器的選擇 高效液相色譜的檢測(cè)器種類很多，針對(duì)樣品的性質(zhì)不同可以選擇適合的檢測(cè)器。紫外檢測(cè)器有比較高的靈敏度，但是只能檢出在儀器特定波長(zhǎng)下有吸收的化合物。主要用于芳烴與稠環(huán)芳烴、芳香基取代物、芳香氨基酸、核酸、甾體激素、羧基與羰基化合物等。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器可用于揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品組分，但對(duì)于有紫外吸收的組分的檢測(cè)靈敏度較低。主要用于糖類、高分子化合高級(jí)脂肪酸及甾體類等幾十類化合物。熒光檢測(cè)器只適用于能產(chǎn)生熒光或其衍生物能發(fā)熒光的物質(zhì)。主要用于氨基酸、多環(huán)芳烴、維生素、甾體化合物及酶等的檢測(cè)。電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器，對(duì)于電活性物質(zhì)來(lái)說(shuō)是一類較好的選擇性檢測(cè)器。主要用于有機(jī)胺類化合物。三、色譜條件的評(píng)價(jià)（一）色譜柱的理論板數(shù)（n）