1、精選優質文檔-傾情為你奉上精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業專心-專注-專業精選優質文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業養胃舒軟膠囊微生物限度檢查方法驗證方案方案審批：文件編號STP-YZ-FF-038-00 起 草 人日期審核人質量控制室日期質量管理部日期批準人質量管理負責人日期XXXXX藥業有限責任公司目 錄 TOC o 1-1 h z u 1. 背景：根據中國藥典2010年版二部附錄 J 微生物限度檢查法的要求，由于某些供試品具有抗菌活性，在建立微生物檢查方法或產品的組分發生改變或原檢查法的檢驗條件發生改變時，可能影響檢驗結果的準確性，必須對供試品的抑菌活性及測定方法的可靠性進行驗

2、證。2. 目的：為確認所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查，包括細菌、霉菌及酵母菌計數和控制菌檢查，特制定本驗證方案，通過比較試驗菌的恢復生長結果，來評價整個檢驗方法的準確性、有效性和重現性，以確認供試品在該實驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性可忽略不計，所采用的方法適用于該品種的微生物限度檢查。驗證過程應嚴格按照本方案規定的內容進行，若因特殊原因確需變更時，應填寫驗證方案修改申請并報驗證領導小組批準。 3. 范圍：本驗證方案適用于養胃舒軟膠囊的微生物限度檢查方法的驗證。4. 驗證組織及職責：4.1驗證小組組織：組長：。組員： 4.2職責：4.2.1驗證領導小組職責：負責驗證方案的審批；負責驗

3、證的協調工作，以保證本驗證方案規定項目的順利實施；負責驗證數據及結果的審核；負責驗證報告的審批；負責發放驗證合格證書。4.2.2質量管理部職責：負責制定分析方法驗證的標準、限度、檢查方法；負責制定分析方法的驗證方案，并組織實施；負責儀器設備的操作；負責各項目的取樣和檢測；負責收集各項驗證、試驗記錄，并對試驗結果進行分析后，起草驗證報告，報驗證領導小組。4.2.3設備動力車間責：負責保證各儀器設備處于完好狀態。4.2.4質量負責人職責負責驗證方案/報告的批準。5. 驗證內容：5.1 驗證要求：5.1.1 驗證前的準備：進行微生物限度檢查方法驗證前，應選用合格的培養基和試驗菌種，所有的平皿、培養基

4、、稀釋劑和檢驗用具都應嚴格按照相關的程序滅菌或消毒，以確保其對試驗結果沒有影響。試驗菌應包括G-和G+并不得超過五代。5.1.2 驗證試驗操作計劃：用3個不同批號產品或同一批號產品進行3次獨立的平行試驗，按微生物限度檢查方法進行操作，通過計算回收率或試驗菌生長情況來判斷微生物限度檢查方法是否對產品有影響。方法驗證試驗可與供試品的微生物限度檢查同時進行。5.1.3 驗證試驗可接受標準：通過3次獨立的平行試驗，細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證時，稀釋劑對照組和試驗組的菌數回收率均不得低于70%；控制菌檢查方法驗證時，陽性對照組應檢出試驗菌，陰性對照組應無菌生長。5.2 前瞻性風險評估：5.2.1評估

5、方法：對檢驗方法潛在的風險做出評估。根據風險的嚴重性（R）、發生的可能性(P)、各項指標等級進行打分，風險測量值為二個指標等級分的乘積，即風險得分為RPN。5.2.2風險評估評分表分數可能性嚴重性1發生的可能性很低對產品質量，設備及人員安全、GMP無影響2很少發生對產品質量，設備及人員安全、GMP有潛在影響3偶爾發生可能對產品質量，設備及人員安全、GMP產生影響4極易發生直接或嚴重影響產品質量，設備及人員安全、GMP5.2.3風險評估方法按照以上風險評估評分表對各項確認逐項進行打分（風險得分=嚴重性可能性），得分14分為低風險，低風險為可接受標準，68分為中風險，須加強管理或采取相關措施加以控

6、制，916分為高風險，須進行風險控制，制定整改措施，再確認評估風險，直至風險可接受。5.2.4風險評估結果：潛在的風險風險分析風險評價嚴重性發生的可能性RPN人員培訓、健康狀況文件指導性、可操作性物料或制劑自身易染菌性、均勻性、包裝質量試驗菌生長情況、菌液濃度均勻性取樣、檢驗操作規范性結果評估： 評估人/日期：5.3人員評估：評估參與微生物限度檢查方法的所有人員，其培訓檢查情況是否符合2010年版GMP要求。5.3.1評估方法：查閱培訓檔案，確認是否對參與微生物限度檢查方法驗證的所有人員進行了相關培訓及健康檢查，檢查內容包括： 5.3.1.1 2010年版GMP及藥品管理法培訓；5.3.1.2

7、 滅菌和消毒管理規程及實驗室安全管理規程培訓；5.3.1.3微生物基礎知識及微生物污染的防范培訓；5.3.1.4 微生物檢查方法驗證管理及檢查法操作規程培訓；5.3.1.5 取樣操作規程、相關質量標準及標準檢驗操作規程的培訓；5.3.1.6人員進出實驗室操作規程培訓、物品進出實驗室操作規程培訓；5.3.1.7 崗位操作規程培訓；5.3.2合格標準：參與微生物限度檢查方法驗證的所有人員，已經接受了相關的知識及操作技術培訓，并經考核合格，持證上崗；5.3.3人員培訓檢查報告：培訓主要內容（摘要）培訓對象、培訓情況姓 名職務/崗位培訓情況姓 名職務/崗位培訓情況檢查人/日期： 復核人/日期：5.4

8、檢查方法評估：5.4.1 實驗條件評估：5.4.1.1評估方法：查閱驗證或確認合格證書，確認驗證所用設備及系統是否符合驗證要求。包括：5.4.1.1.1 消毒滅菌設備驗證合格。5.4.1.1.2 凈化檢驗室空氣系統驗證及消毒效果驗證合格。5.4.1.1.3潔凈工作臺驗證合格。5.4.1.1.4培養箱確認合格。5.4.1.1.5 培養基適用性檢查合格。5.4.1.1.6試驗菌株符合要求。5.4.1.2合格標準：用于微生物限度檢查方法驗證的各設備或系統等實驗條件均驗證或確認合格，并在有效期內，所用培養基和試驗菌株均符合要求。5.4.1.3設備或系統評估報告：設備或系統名稱設備編碼驗證或確認報告編碼

9、檢查情況SPX-80BS-型生化培養箱MJ-160S-型霉菌培養箱LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器YJ-875SDB型凈化工作臺微生物室空氣凈化系統檢查人/日期復核人/日期5.4.1.4培養基評估報告：脫水培養基名稱生產商 培養基批號適用性檢查檢查情況營養瓊脂培養基玫瑰紅鈉瓊脂培養基膽鹽乳糖培養基（BL）4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基(MUG)營養肉湯培養基改良馬丁培養基檢查人/日期復核人/日期5.4.1.5試驗菌株評估報告：試驗菌株名稱菌株批號 傳代次數菌株生長情況檢查情況大腸埃希菌CMCC(B) 44102金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26003枯草芽孢桿菌CMCC(B) 63501白

10、色念珠菌CMCC(B) 98001黑曲霉菌CMCC(B) 98003檢查人/日期復核人/日期5.4.2 驗證前提文件評估：5.4.2.1評估標準要求：5.4.2.1.1 取樣方法已經批準，其中包括取樣操作規程和取樣地點。5.4.2.1.2質量標準及操作規程已經批準。5.4.2.1.3微生物限度檢查法操作規程已經批準。5.4.2.1.4檢定菌管理規程已經批準。5.4.2.2評估項目及結論評估：確認無菌檢查方法驗證的文件已建立，內容全面、詳細、準確，已簽發，符合驗證要求。5.4.2.3驗證前提文件評估報告：設備或系統名稱存放地點微生物檢查方法驗證管理規程成品取樣管理規程養胃舒軟膠囊質量標準養胃舒軟

11、膠囊檢驗標準操作規程微生物限度檢查法檢定菌管理規程檢查人/日期復核人/日期5.5 驗證實施：5.5.1 試驗前的準備:5.5.1.1 試驗用具的準備：將試驗需用的試管、刻度吸管、薄膜過濾器、濾膜（孔徑0.22um、直徑50mm）、平皿、空三角瓶、稱量紙等，用牛皮紙包扎好后，放于濕熱滅菌器中，在121，滅菌30 min，在3天內使用。5.5.1.2試驗用培養基的制備：取適用性檢查合格的營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、營養肉湯培養基、膽鹽乳糖培養基（BL）、改良馬丁瓊脂培養基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基（MUG）等脫水培養基，按照相應的配制說明，用純化水配制、分裝后，在2小時內，放于濕熱滅菌

12、器中，在121，滅菌15 min，在3周內使用。5.5.1.3試驗用稀釋劑/緩沖液、沖洗液的制備：取在有效期內的試劑，按照相應的配制方法，配制pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液等，用純化水配制，加熱使溶，過濾，分裝，在121，滅菌15 min，在3周內使用。 5.5.2 試驗菌的制備和稀釋：5.5.2.1細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證用菌液：5.5.2.1.1取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物少許接種至10ml營養肉湯中，在3035培養1824小時；取白色念珠菌的新鮮培養物接種至改良馬丁培

13、養基中，在2328培養2448小時；取黑曲霉的新鮮培養物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，2328培養57天。5.5.2.1.2將上述大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的均勻培養物（菌懸液），用0.9%無菌氯化鈉溶液對倍稀釋制成每1ml含菌50100cfu的試驗菌液。在黑曲霉的改良馬丁瓊脂斜面培養基中，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫（菌懸液），用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌50100cfu的試驗孢子液。5.5.2.1.3上述菌液在供試驗的同時，取1ml注皿、培養、計數；大腸

14、埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌用營養瓊脂培養基，于3035倒置培養48小時，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰紅鈉瓊脂培養基，于2328倒置培養72小時。5.5.2.2控制菌檢查方法驗證用菌液：5.5.2.2.1取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物少許接種至10ml營養肉湯中，生孢梭菌的新鮮培養物少許接種至12ml硫乙醇酸鹽流體培養基中，在3035培養1824小時。5.5.2.2.2 取上述均勻培養物（菌懸液），用0.9%無菌氯化鈉溶液對倍稀釋，制成每1ml含菌10100cfu的試驗菌液。5.5.2.2.3上述菌液在供試驗的同時，取1ml注皿、注入營養瓊脂培養基

15、，于3035倒置培養48小時，計數。5.5.3供試液的制備：5.5.3.1 根據供試品的理化特性與生物學特性，采取適宜的方法制備供試液。5.5.3.2，取供試品養胃舒軟膠囊5g，加至含溶化的（溫度不超過45）5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻璃攪拌成團后，慢慢加入45pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1：20的供試液。5.5.3.3 供試液的制備如需用水浴加溫時，溫度不得超過45，時間不得超過30min。5.5.4細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證方法:5.5.4.1 驗證試驗分4組，照微生物限度檢查法操

16、作，分別用3個不同批號樣品進行3次獨立的平行試驗，并分別計算供試品組和對照試驗組的菌回收率。5.5.4.2試驗組： 5.5.4.2.1 平皿法：分1：20的供試液1ml和試驗菌液（含菌50100CFU）1ml，注入同一直徑90mm的滅菌平皿中，每株試驗菌平行制備2個平皿。5.5.4.2.2薄膜過濾法：取1：20的供試液110ml，加至100ml稀釋液中混勻，按薄膜過濾法過濾（水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜，油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥）。用適宜的沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量約100ml，總沖洗量不得超過1000ml，在最后一次沖洗液中加入一種試驗菌液1m

17、l（含菌50100CFU），濾過，取出濾膜，菌面朝上貼于相應的經預培養合格的培養基平板上，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌用營養瓊脂培養基平板，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板。每株試驗菌平行制備2個平板。5.5.4.3菌液組：取試驗菌液各1ml，注入直徑90mm的滅菌平皿中，每株試驗菌平行制備2個平皿。5.5.4.4供試品對照組：5.5.4.4.1 平皿法：取1：20供試液1ml，注入直徑90mm的滅菌平皿中，每種培養基平行制備2個平皿。5.5.4.4.2薄膜過濾法：取1：20的供試液110ml（取用量同試驗組），加至100ml稀釋液中混勻，按薄膜過濾法過濾（水溶性供試液過

18、濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜，油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥）。用沖洗液沖洗濾膜，沖洗液、沖洗量及沖洗次數同試驗組，濾過，取出濾膜，菌面朝上貼于經預培養合格的營養瓊脂培養基和玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板上，每種培養基平行制備2個平板。5.5.4.5稀釋劑對照組：若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心等特殊處理時，需增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。5.5.4.5.1平皿法：分別取1ml稀釋劑或緩沖液和1ml試驗菌液（含菌50100CFU），注入同一直徑90mm的滅菌平皿中，每株試驗菌平行制備2個平皿。5.5.4.5.2薄膜過濾法：每個濾桶內加入100ml

19、稀釋液，按薄膜過濾法過濾，用沖洗液沖洗濾膜，沖洗液、沖洗量及沖洗次數同試驗組，在最后一次沖洗液中加入一種試驗菌液1ml（含菌50100CFU），濾過，取出濾膜，菌面朝上貼于相應的經預培養合格的培養基平板上，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌用營養瓊脂培養基平板，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板。每株試驗菌平行制備2個平板。5.5.4.6傾注培養基：在菌液組各平皿中分別傾注1520ml溫度不超過45的溶化的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，其中，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌用營養瓊脂培養基，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰紅鈉瓊脂培養基，混勻，凝固。5.5.4.7培養觀察：

20、用于細菌計數的營養瓊脂培養基平板，倒置于3035的培養箱中，培養48小時；用于霉菌、酵母菌計數的玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板，倒置于2328的培養箱中，培養72小時。逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數。5.5.4.8菌落計數：將平板置菌落計數器上或從平板的背面直接以肉眼點計，以透射光襯以暗色背景，仔細觀察并記錄結果。5.5.4.9計算回收率試驗組回收率試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數100%菌液組的平均菌落數稀釋劑對照組回收率稀釋劑對照組的平均菌落數100%菌液組的平均菌落數5.5.4.10結果判定：在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的回收率應均不低于70。試驗組的菌回收率均不低于70，則照

21、該供試液制備方法和計數法測定。若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70，則應采用薄膜過濾法、培養基稀釋法、離心沉淀集菌法、中和法等方法或聯合使用上述方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法學驗證。5.5.4.11細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證結果：第一次：樣品名稱試驗日期規 格樣品批號生 產 商類 別供試液的制備及處理 保溫振搖法 研缽法 勻漿儀 檔 min 水溶性供試品：供試品 g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液；取供試液 ml，沖洗次數 次，每膜沖洗量 ml。 非水溶性供試品：供試品 g(ml)，加乳化劑（名稱 ；批號 ） g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液；取供試液 m

22、l，沖洗次數 次，每膜沖洗量 ml。 其它： 。計數方法細菌計數霉菌和酵母菌計數培養基名稱營養瓊脂培養基玫瑰紅鈉瓊脂培養基配制批號培養溫度培養起止時間菌種名稱大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌種編號菌懸液批號菌液稀釋倍數試驗組（cfu）12平均菌液組（cfu）12平均稀釋劑對照組（cfu）12平均供試品對照組（cfu）12平均試驗組回收率(%)稀釋劑對照組回收率(%)結 論檢查人/日期復核人/日期第二次：樣品名稱試驗日期規 格樣品批號生 產 商類 別供試液的制備及處理 保溫振搖法 研缽法 勻漿儀 檔 min 水溶性供試品：供試品 g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液

23、；取供試液 ml，沖洗次數 次，每膜沖洗量 ml。 非水溶性供試品：供試品 g(ml)，加乳化劑（名稱 ；批號 ） g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液；取供試液 ml，沖洗次數 次，每膜沖洗量 ml。 其它： 。計數方法細菌計數霉菌和酵母菌計數培養基名稱營養瓊脂培養基玫瑰紅鈉瓊脂培養基配制批號培養溫度培養起止時間菌種名稱大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌種編號菌懸液批號菌液稀釋倍數試驗組（cfu）12平均菌液組（cfu）12平均稀釋劑對照組（cfu）12平均供試品對照組（cfu）12平均試驗組回收率(%)稀釋劑對照組回收率(%)結 論檢查人/日期復核人/日期第三次

24、：樣品名稱試驗日期規 格樣品批號生 產 商類 別供試液的制備及處理 保溫振搖法 研缽法 勻漿儀 檔 min 水溶性供試品：供試品 g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液；取供試液 ml，沖洗次數 次，每膜沖洗量 ml。 非水溶性供試品：供試品 g(ml)，加乳化劑（名稱 ；批號 ） g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液；取供試液 ml，沖洗次數 次，每膜沖洗量 ml。 其它： 。計數方法細菌計數霉菌和酵母菌計數培養基名稱營養瓊脂培養基玫瑰紅鈉瓊脂培養基配制批號培養溫度培養起止時間菌種名稱大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌種編號菌懸液批號菌液稀釋倍數試驗組（cf

25、u）12平均菌液組（cfu）12平均稀釋劑對照組（cfu）12平均供試品對照組（cfu）12平均試驗組回收率(%)稀釋劑對照組回收率(%)結 論檢查人/日期復核人/日期5.5.5控制菌檢查方法驗證方法:5.5.5.1 根據各品種項下微生物限度標準中規定檢查的控制菌，選擇相應驗證的菌株，驗證大腸菌群檢查法時，采用大腸埃希菌作為驗證菌株。驗證試驗分3組，分別用3個不同批號樣品或同一批號樣品進行3次獨立的平行試驗。5.5.5.2試驗組：5.5.5.2.1 平皿法：取1：10的供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、10cm2）和1ml試驗菌液（含菌10100CFU），加入同一增菌培養基中，按相應控

26、制菌的檢查方法進行檢查。5.5.5.2.2薄膜過濾法：取1：10的供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、10cm2），按薄膜過濾法過濾（水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜，油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥）。用適宜的沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量約100ml，總沖洗量不得超過1000ml，在最后一次沖洗液中加入1ml試驗菌液（含菌10100CFU），濾過，取出濾膜，放入增菌培養基中，按相應控制菌的檢查方法進行檢查。5.5.5.3 陽性對照：取1ml試驗菌液（含菌10100CFU），加入增菌培養基中，按相應控制菌的檢查方法進行檢查。5.5.5.4 陰性對照：取1

27、0ml稀釋劑或緩沖液替代供試液，加入增菌培養基中，按相應控制菌的檢查方法進行檢查。5.5.5.5結果判定：在3次獨立的平行試驗中，陽性對照組應檢出試驗菌，陰性菌對照組應無菌生長。若試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應采用薄膜過濾法、培養基稀釋法、離心沉淀集菌法、中和法等方法或聯合使用上述方法消除供試品的抑菌活性，建立新的方法，并重新驗證。5.5.5.6控制菌檢查方法驗證結果：第一次：控制菌名稱樣品名稱試驗日期規 格樣品批號生 產 商類 別供試液的制備及處理 保溫振搖法 研缽法 勻漿儀 檔 min 水溶性供試品：供試品 g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液；取供試液 ml，沖洗次數 次，每膜沖洗量 ml。 非水溶性供試品：供試品 g(ml)，加乳化劑（名稱 ；批號 ） g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液；取供試液 ml，沖洗次數 次，每膜沖洗量 ml。 其它： 。培養基名稱培養溫度培養起止時間菌落生長情況試驗組陽性對照陰性對照結 論檢查人/日期復核人/日期第