1、第四章 生產(chǎn)菌種的制備與保藏第一頁，共四十五頁。生產(chǎn)菌種的制備： 即種子制備，是發(fā)酵生產(chǎn)的第一道工序。即將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌種的過程。目的： 提供發(fā)酵產(chǎn)量高、生產(chǎn)性能穩(wěn)定、數(shù)量充足、未被雜菌污染的生產(chǎn)用菌種第二頁，共四十五頁。第一節(jié)種子制備的過程第二節(jié)種子質(zhì)量控制第三節(jié)種子保藏與復(fù)壯第三頁，共四十五頁。第一節(jié)種子制備的過程第四頁，共四十五頁。兩個過程：孢子制備過程固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)孢子，種子制備過程液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌絲。第五頁，共四十五頁。（一）放線菌孢子的制備1.一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)

2、基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨、無機(jī)鹽2.C和N源不要太豐富（C約為1%，N約為0.5%）3.干燥和限制營養(yǎng)可直接或間接誘導(dǎo)孢子形成。4.斜面培養(yǎng)溫度大多為28，少數(shù)為37。5.培養(yǎng)時間514天。一、孢子制備第六頁，共四十五頁。一、孢子制備（二）霉菌孢子的制備1.霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。2.霉菌培養(yǎng)溫度大多為2528。3.培養(yǎng)時間414天。第七頁，共四十五頁。一、孢子制備（三）細(xì)菌孢子的制備1.一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，碳源限量而氮源豐富，如牛肉膏、蛋白胨作有機(jī)氮源2.細(xì)菌培養(yǎng)溫度大多為 37 少數(shù)為28 。3.細(xì)

3、菌和菌體培養(yǎng)時間12天， 可產(chǎn)芽孢的菌則510天。第八頁，共四十五頁。二、種子制備是將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出來的孢子或菌體轉(zhuǎn)入到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其繁殖成大量菌絲或菌體的過程。目的：形成一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體。第九頁，共四十五頁。方法：搖瓶種子制備和種子罐種子制備種子罐的級數(shù)主要決定于菌種的性質(zhì)、菌體生長速度、發(fā)酵設(shè)備的合理應(yīng)用。一級種子、二級種子N1級發(fā)酵搖瓶種子制備：某些孢子發(fā)芽和菌絲繁殖速度緩慢的菌種，需將孢子經(jīng)搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進(jìn)入種子罐。培養(yǎng)基要求比較豐富和完全，并易被菌體分解利用，氮源豐富有利于菌絲生長。種子罐種子制備：第十頁，共四十五頁。細(xì)菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級

4、發(fā)酵。 茄子瓶種子罐發(fā)酵罐 霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵 孢子懸浮液一級種子罐（27C,40小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲 ）二級種子罐（ 27C,1024小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）發(fā)酵罐 放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵第十一頁，共四十五頁。種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機(jī)會；種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機(jī)會；種子罐級數(shù)：產(chǎn)物的品種、生產(chǎn)規(guī)模、工藝條件。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。 確定種子級數(shù)需注意的問題第十二頁，共四十五頁。第二節(jié)種子質(zhì)量控制一、影響孢子質(zhì)量的因素及其控制培養(yǎng)基、培養(yǎng)

5、溫度和濕度、培養(yǎng)時間和接種量。二、影響種子質(zhì)量的因素及其控制孢子質(zhì)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡和接種量。第十三頁，共四十五頁。影響孢子質(zhì)量的因素及控制培養(yǎng)基培養(yǎng)條件接種量一、影響孢子質(zhì)量的因素及其控制第十四頁，共四十五頁。(一)培養(yǎng)基影響因素：原材料；瓊脂的牌號不同；水質(zhì)的影響注意事項(xiàng)：原材料需經(jīng)過化學(xué)分析及搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格控制滅菌后的培養(yǎng)基質(zhì)量使用前應(yīng)在適當(dāng)溫度下放置一定時間考慮不同代謝類型的菌落對多種氨基酸的選擇第十五頁，共四十五頁。(二)培養(yǎng)溫度和濕度龜裂鏈霉菌斜面最適溫度為36.5 37 菌體的糖代謝和氮代謝的各種酶類，對溫度的敏感性是不同的，培養(yǎng)溫度不同，菌體的生理狀態(tài)也不同。因此，需

6、要用最適合孢子生長的溫度進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)室的相對濕度對孢子形成的速度、數(shù)量和質(zhì)量有很大影響。在北方相對濕度控制在40%45%；而在南方則控制在35% 42%第十六頁，共四十五頁。(三)培養(yǎng)時間和冷藏時間1、孢子的培養(yǎng)時間 孢子的培養(yǎng)時間應(yīng)控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。2、孢子的冷藏時間 冷藏時間宜短不宜長。冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān) 如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右冷藏，發(fā)現(xiàn)冷藏78天菌體開始自溶。而培養(yǎng)5天后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。 例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6 C 冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏

7、3個月后降低35%。第十七頁，共四十五頁。(四) 接種量 制備孢子時的接種量要適中。接種量的大小影響到在一定量培養(yǎng)基中孢子的個體數(shù)量的多少，進(jìn)而影響到菌體的生理狀況。第十八頁，共四十五頁。二、影響種子質(zhì)量的因素及其控制影響種子質(zhì)量的因素及控制接種量種齡孢子的質(zhì)量培養(yǎng)基培養(yǎng)條件第十九頁，共四十五頁。(一) 培養(yǎng)基主要是碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長素和水等。選用原則：營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要；營養(yǎng)成分要盡可能地和發(fā)酵培養(yǎng)基接近；pH值要比較穩(wěn)定第二十頁，共四十五頁。(二) 培養(yǎng)條件（1）溫度（2）通氣量: 在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培養(yǎng)基外，有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。例如，青霉素

8、的生產(chǎn)菌種在制備過程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生產(chǎn)菌，一級種子罐的通氣量小對發(fā)酵有利。第二十一頁，共四十五頁。(三) 種齡種齡：種子罐中培養(yǎng)液從開始接種到移入下一級種子罐或發(fā)酵罐的培養(yǎng)時間。種齡過短前期生長緩慢、整個發(fā)酵周期延長。種齡過長生產(chǎn)能力下降、菌絲過早自溶最適的種齡為生命力極為旺盛的對數(shù)生長期，菌體量尚未達(dá)到最高峰時移種。第二十二頁，共四十五頁。(四) 接種量接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度。采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖到達(dá)高峰

9、的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來。生產(chǎn)上多以加大種子量及采用豐富培養(yǎng)基作為獲得高產(chǎn)的措施。雙種法：二只種子罐接一只發(fā)酵罐倒種法：以適宜的發(fā)酵液倒出適量給另一發(fā)酵罐作種子第二十三頁，共四十五頁。三、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞或菌體：以單細(xì)胞菌體為種子的質(zhì)量要求菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列和形態(tài)；以霉菌、放線菌為種子的質(zhì)量要求是菌絲粗壯，對某些染料著色力強(qiáng)、生產(chǎn)旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況良好。生化指標(biāo)：種子液的糖、氮、磷含量的變化和pH值變化。產(chǎn)物生成量：測定產(chǎn)物含量。酶活力：如胞內(nèi)的淀粉酶等。 第二十四頁，共四十五頁。四、種子的異常狀況 菌種生長發(fā)育異常 孢子質(zhì)量、種子罐的培養(yǎng)條件

10、菌絲結(jié)團(tuán) 攪拌效果差、接種量小菌絲粘壁 攪拌效果不好、泡沫過多以及種子罐裝料系數(shù)過小等第二十五頁，共四十五頁。第三節(jié)種子保藏與復(fù)壯一、菌種保藏 優(yōu)良菌種被選育出來后，要保持其生產(chǎn)性能穩(wěn)定、不污染雜菌、不死亡，這是保藏菌種的主要目的。第二十六頁，共四十五頁。（一）菌種保藏的原理根據(jù)菌種的生理生化特性，人工創(chuàng)造條件使菌體的代謝活動處于休眠狀態(tài)。通常利用菌種的休眠體（孢子、芽孢等），采用的方法有低溫、隔絕空氣或氧氣、缺乏營養(yǎng)物質(zhì)，以降低菌種的代謝活動，減少菌種的變異，達(dá)到長期保存的目的。第二十七頁，共四十五頁。（二）菌種保藏的方法 各種微生物由于遺傳特性不同，因此適合采用的保藏方法也不一樣。一種良好

11、的有效保藏方法，首先應(yīng)能保持原菌種的優(yōu)良性狀長期不變，同時還須考慮方法的通用性、操作的簡便性和設(shè)備的普及性。 第二十八頁，共四十五頁。1、斜面低溫保藏法 將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，置于4左右的冰箱中保藏，每隔一定時間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。 應(yīng)用范圍：適用于細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌等大多數(shù)微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍干燥保藏的菌種。 優(yōu)點(diǎn)：簡便易行，容易推廣，存活率高 缺點(diǎn)：菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。 第二十九頁，共四十五頁。2、液體石蠟封藏法 在無菌條件下，將滅過菌

12、并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端lcm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕。 應(yīng)用范圍：適于保藏霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細(xì)菌等，對霉菌和酵母菌的保藏效果較好。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，保藏時間長（1 2年）缺點(diǎn)：對很多厭氧性細(xì)菌的保藏效果較差，尤其不適用于某些能分解烴類的菌種。 第三十頁，共四十五頁。3、固體曲保藏法 采用麩皮、大米、小米或麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為產(chǎn)孢子培養(yǎng)基，使菌種產(chǎn)生大量的休眠體（孢子）后，在室溫或低溫加以保存。應(yīng)用范圍：適用于產(chǎn)孢子的真菌要點(diǎn)：控制適當(dāng)?shù)乃值谌豁摚菜氖屙摗?、沙土管保藏法 先將砂與土分別洗凈、烘干、過篩，按一定比例

13、混勻，分裝于小試管中，砂土的高度約1cm，以121蒸汽滅菌11.5h，間歇滅菌3次。50烘干并經(jīng)無菌檢查后備用。需要保藏的菌株先用斜面培養(yǎng)基充分培養(yǎng)，再以無菌水制成1081010個/ml菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約24h，封口后置于干燥器中，在室溫或4冰箱內(nèi)保藏。 特點(diǎn)：保藏期較長、效果較好，且微生物移接方便，經(jīng)濟(jì)簡便。它比石蠟油封藏法的保藏期長，約110年。 第三十二頁，共四十五頁。5、冷凍干燥法 用保護(hù)劑（脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等）制備擬保藏菌種的細(xì)胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，

14、使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即融封，造成無氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。應(yīng)用范圍：適用于除不產(chǎn)孢子的絲狀真菌之外的其他大多數(shù)微生物如病毒、細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等優(yōu)點(diǎn)：保藏期長，一般達(dá)515年，存活率高，變異率低 缺點(diǎn)：該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需凍干機(jī)第三十三頁，共四十五頁。第三十四頁，共四十五頁。6、液氮超低溫保藏法 是以甘油、二甲基亞砜等作為保護(hù)劑，在液氮超低溫（-196）下保藏的方法。其主要原理是菌種細(xì)胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過細(xì)胞膜外滲出來，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰

15、晶而使細(xì)胞損傷。 應(yīng)用范圍：適用于各種微生物菌種的保藏 優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、高效、保藏期一般可達(dá)到15年以上；可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進(jìn)行保藏 （孢子或菌體、液體或固體） 缺點(diǎn)：超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費(fèi)用較高 第三十五頁，共四十五頁。（三）菌種保藏的注意事項(xiàng)1、菌種在保藏前所處的狀態(tài)絕大多數(shù)微生物的菌種均保藏其休眠體。2、菌種保藏所用的基質(zhì)斜面低溫保藏：碳源應(yīng)少些、營養(yǎng)成分應(yīng)貧乏砂土管保藏：砂和土要充分洗凈冷凍干燥：應(yīng)注意保護(hù)劑3、操作過程對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害第三十六頁，共四十五頁。二、菌種的復(fù)壯菌種復(fù)壯：使衰退的菌種重新恢復(fù)原來的優(yōu)良特性。菌種衰退：生產(chǎn)上使用的菌種，在使用和保藏過程

16、中，逐漸向不利于生產(chǎn)的方向發(fā)展變化，這種變化稱之為菌種衰退。第三十七頁，共四十五頁。1. 純種分離法 通過純種分離,可將衰退菌種細(xì)胞群體中一部分仍保持原有典型性狀的單細(xì)胞分離出來,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng),就可恢復(fù)原菌株的典型性狀。采用稀釋平板法、涂布平板法、平板劃線法等方法獲得單菌落。 第三十八頁，共四十五頁。2.淘汰法 將衰退菌種進(jìn)行一定的處理（如藥物，低溫、高溫等），往往可以起到淘汰已衰退個體而達(dá)到復(fù)壯的目的。 3.選擇合適的培養(yǎng)條件 將保藏后的菌種接種在保藏前所使用的同一培養(yǎng)基上，有利于原有性狀的恢復(fù)。第三十九頁，共四十五頁。（1） ATCC American Type Culture Collec

17、tion. Rockvil1。美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所，美國，馬里蘭洲，羅克維爾市。（2） CSH （Cold Spring Harbor Laboratory），冷泉港研究室，美國。（3） IAM （Institute of Applied Microbiology），University of Tokyo，Japan。日本東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所，日本東京。（4） IFO （Institute for Fermentation）， Osaka，Japan。發(fā)酵研究所，日本大阪。（5） KCC （Kaken Chemical Company Ltd）， Tokyo，Japan。科研化學(xué)有限公司，日本東京。附：國內(nèi)外主要菌種保藏機(jī)構(gòu)介紹第四十頁，共四十五頁。第四十一頁，共四十五頁。CGMCC中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center）成立于1979年，是以提供專業(yè)技術(shù)服務(wù)為主的公益性機(jī)構(gòu)，1995年獲得布達(dá)佩斯條約國際保藏中心的資格，是我國唯一