1、 生化實驗設計 蛋白質的提取與分離純化主講人：第三組組員：華中師范大學化學學院 已知某蛋白的分子量約為17 kDa，等電點3.94.1，它能耐一定的高溫，在90 C加熱34 min后仍然能夠保持80%的活性。該蛋白含有較多的疏水性殘基，與Ca2+結合后可以暴露它的疏水基團。該蛋白的作用是作為生物體內酶的激活劑。請設計一個從腦組織中提取和分離純化該蛋白的實驗方案，要求寫出具體的步驟和理由，以及檢測方法。文獻查得： 鈣調蛋白（CaM）是由148個氨基酸組成的單鏈分子,其pI值在3.9-4.1之間,分子量約為17KDa.該蛋白能夠耐一定的高溫，在90oC加熱3-4min后仍然能夠保持80%的活性。該

2、蛋白分子中含有較多的疏水性殘基，與Ca2+結合后可以暴露出它的疏水基團。整個實驗過程一般可分為 5 個階段： 材料的選擇和預處理 細胞的破碎（有時需進行細胞器的分離）提取 純化（包括等電點沉降法，鹽析，有機溶劑沉淀，吸附、層析、等）分析鑒定。一、材料的選定：大鼠腦組織 預處理： 將切取的組織用4預 冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血漬，再用濾紙吸干殘留的PBS（磷酸鹽緩沖液 ） 。實驗步驟：玻璃勻漿機b、細胞器的分離 細胞器的分離一般采用差速離心法。細胞經過破碎后，在適當介質中進行差速離心。三、蛋白質粗提取原理：利用蛋白質在PH等電點時的溶解度最小，因而會以沉淀的方式析出。試劑：檸檬酸、磷

3、酸氫二鈉步驟：1向試管中加入磷酸氫二鈉和檸檬酸，使其PH=4。2將提取的溶液加入到第1步驟所配的緩沖液中。3靜置一段時間，待沉淀完全。4過濾或離心出粗產品。注意事項：防止局部過酸或過堿造成蛋白質變性。金屬螯合親和層析 固定化金屬螯合親和層析是建立在蛋白質表面的氨基酸與固定化金屬離子的親和力的不同來進行蛋白質分離的一項技術。過渡態金屬離子能夠與電子供體，如氮、硫、氧等原子以配位鍵結合，金屬離子上剩余的空軌道是電子供體的配位點，當它在溶液中會被水分子或陰離子占據。 鈣調蛋白的外形似啞鈴,有兩個球形的末端,中間被一個長而富有彈性的螺旋結構相連,每個末端有兩個Ca2+ 結構域,每個結構域可以結合一個C

4、a2+ , 這樣,一個鈣調蛋白可以結合4個Ca2+ ,鈣調蛋白與Ca2+ 結合后的構型相當穩定 。四、精細純化值得注意的是，在洗脫時，會有少許配基與蛋白質一同被洗脫下來，因此常在其后加一凝膠層析以除去小分子的配基。 凝膠層析法屬最常用的蛋白質分離方法。系混合物隨流動相流經裝有凝膠作為固定相的層析柱時，混合物中各物質因分子大小不同而被分離的技術。在洗柱過程中，分子量最大的物質不能進入凝膠網孔而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外。分子量最小的物質因能進入凝膠網孔而受阻滯，流速緩慢，致使最后流出柱外。 當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式： logMW=K-bX， 式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。B、定量分析紫外檢測法、考馬斯亮藍法、Folin-酚試劑法（最常用方法）Folin-酚試劑法包括兩步反應：第一步是在堿性條件下，蛋白質與銅作用生成蛋白質-銅絡合物；第二步是此絡合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin 試劑）還原，產生深藍色（磷鉬藍和磷鎢藍混合物），顏色深淺與蛋白質含量成正比。此法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100 倍，定量范圍為5100g 蛋白質。Folin 試劑