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文檔簡介

1、血清-球蛋白的分離、純化與鑒定 （見P157）背景：關鍵問題： 血清蛋白根據電泳法可分為5類：清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白。1.采用何種方法分離？2.此種方法分離會引入何種雜質？ 如何純化？鹽析凝膠層析3.如何鑒定純度和含量？電泳和雙縮脲法定量一、原理及操作 利用高濃度的中性鹽，如(NH4)2SO4、 Na2SO4、 Na2SO3和NaCl等破壞水化膜，中和表面電荷。鹽析法一般蛋白質不變性，常用于蛋白質的分離純化。1. 鹽析50%飽和(NH4)2SO4清蛋白溶解球蛋白沉淀33%飽和(NH4)2SO4其余球蛋白溶解-球蛋白沉淀飽和(NH4)2SO4 1ml邊加邊搖！棄上清加PBS溶

2、解沉淀至1ml靜置5min3500r/min 5min1）飽和(NH4)2SO4 0.5ml邊加邊搖！棄上清加PBS 0.5ml溶解沉淀靜置5min3500r/min 5min2）取1ml血清作1ml標記線2. 脫鹽1） 裝柱排氣、調整凝膠濃度、裝柱2）加樣上步樣品加樣、進樣、洗樣3）洗脫收集PBS洗脫；收集（1ml/管)；4）檢測收集約10管4）檢測NH4+檢測（納氏試劑）蛋白質檢測（雙縮脲試劑）1234567891011121234567891011121滴洗脫液+1滴檢測試劑1滴洗脫液+1滴檢測試劑5）收集脫鹽的蛋白質液進行鑒定 電泳技術是利用帶電粒子在電場中向與其所帶電荷相反的電極移動

3、的現象，對混合物組分進行分離、純化、鑒定和定量的技術。 電泳技術 （見P34）V = EQ6r電泳緩沖液：pH=8.6血清蛋白清蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白pI4.645.065.065.126.857.5分子量（104）695203091530含量（%）607023.5479111218表10-1 血清蛋白含量參考（ P89 )血清蛋白泳動方向？各種血清蛋白泳動順序？1）電泳前準備2）點樣（ 各組點-球蛋白液、每個電泳槽點2份血清）無光澤面點樣、量少、一次、迅速電泳操作5）染色麗春紅染色液中浸泡 2min6）漂洗依次進行三次漂洗，至背景無色蛋白雙縮脲法定量 （見P159）肽鍵 Cu2+ OH-紫紅色復合物蛋白質濃度與A540呈正比二、結果1. 脫鹽檢測結果1）納氏試劑、雙縮脲試劑顏色反應結果（半定量）2）收集哪些洗脫液用于鑒定2. 電泳鑒定結果繪出血清和-球蛋白液電泳結果3. 雙縮脲法定量鑒定結果計算-球蛋白液濃度三、討論根據結果評價分離效果，分析原因三、結果血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳點樣線_+清蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋

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