1、結核分枝桿菌Rv2450c基因的克隆和原核表達李立青，蘇明權，李立文，郝曉柯【關鍵詞】分枝桿菌lningandprkarytiexpressinfybateriutuberulsisRv2450gene【Keyrds】ybateriutuberulsis;resusitatinprtingfatr;lning,leular;geneexpressin【摘要】目的：研究結核分枝桿菌Rv2450基因是否能促進其復生和生長.要領：造就結核分枝桿菌，提取其基因組，PR擴增出Rv2450基因，克隆入pSP73載體，測序闡發.將該目的基因亞克隆入pGEX4T2表達載體，測序證明準確后轉化大腸桿菌BL21D

2、E3，30用IPTG誘導5h然后舉行SDSPAGE闡發.效果：測序效果證明得到了Rv2450基因，其序列與GenBank中報道完全同等.SDSPAGE闡發表白，Rv2450基因在大腸桿菌BL21DE3中表達了重組卵白，表達的卵白量約占菌體卵白的22.9%.結論：樂成克隆告終核分枝桿菌Rv2450基因，并在大腸桿菌中得到了高效表達.【關鍵詞】分枝桿菌，結核；促進復生因子；克隆，分子；基因表達0弁言如今天下生齒的三分之一被結核分枝桿菌熏染，此中大部門為暗藏性熏染，當機體對抗力落落時，休眠的結核分枝桿菌即活化，引發結核病.在這個歷程中結核分枝桿菌排泄的促進復生因子resusitatinprtingf

3、atr,RPF起了緊張作用，但其詳細機制還不明晰1，2.結核分枝桿菌H37Rv基因序列中Rv0867,Rv1009,Rv1884,Rv2389和Rv2450基因均編碼RPF樣卵白，它們同源性很高，是r約為16000的排泄卵白.我們克隆表達了Rv2450基因，為進一步研究其活性奠基了底子.1質料和要領1.1質料大腸桿菌TP10，BL21DE3為第四軍醫大學西京病院查驗科保存；原核表達載體pGEX4T2購自Pharaia公司；質粒提取試劑盒購自Siga公司；克隆載體pSP73、膠接納試劑盒購自Prega公司；BaH,ER等限定性內切酶和PyrbestDNA聚合酶、T4DNA毗連酶、IPTG等購自T

4、akara公司.1.2要領2效果2.1Rv2450基因序列的得到與斷定經熱啟動PR得到一條約為562bp巨細的特異性條帶，與預期目的片斷巨細相稱Fig1.2.2pGEX4T2Rv2450的雙酶切斷定及測序酶切后瓊脂糖凝膠電泳表現出現了4960bp的載體片斷和約562bp的目的基因片斷，測序后證明其序列與GenBank中所給序列完全雷同Fig2.2.3pGEX4T2Rv2450的誘導表達將斷定準確的陽性克隆株在差異條件下舉行誘導表達，120g/LSDSPAGE闡發效果創造，經誘導后表達r約44000的外源卵白，與預期巨細同等.在30,A600n值為0.6,IPTG終濃度為0.3l/L、誘導表達5

5、h后交融卵白表達量較高，占菌體卵白的22.9%，同時創造交融卵白以可溶性卵白和包容體兩種情勢存在Fig3.3討論結核分枝桿菌的5個RPF基因疏散在整個基因組中，對刺激靜息期細菌生長起緊張作用，因此推測對宿主體內暗藏的結核分枝桿菌的復生起促進作用.別離敲除結核分枝桿菌基因組中的某一個RPF基因時，其生長并沒受到顯著影響，說明這一卵白家屬的成效有必然重疊，不是結核分枝桿菌生長所必須的，但從對數生恒久到停滯期它們的表達形式差異，在特定的熏染期每個RPF基因的成效也不雷同1，3.Rv2450是唯一可被15in酸打擊aidshk誘導的RPF基因，在它編碼序列的氨基端有一個富含脯氨酸的區，使它成為免疫學上

6、緊張的排泄型抗原，可猛烈刺激機體產生抗體及產生遲發型超敏反響4，5，研究意義龐大，而海內RPF樣卵白的研究報道少少.我們的研究擴增告終核分枝桿菌Rv2450基因全長序列，并將其克隆入原核表達載體pGEX4T2.表達載體pGEX4T2是GST交融表達載體，它含有強啟動子ta及la把持基因、SD序列及la阻遏卵白基因等，是一種較為高效的卵白表達載體.并且在表達載體pGEX4T2GST的卑劣有編碼凝血酶識別位點的序列，高效表達的外源卵白可用GSTrapFF親和層析純化，用凝血酶水解接納外源卵白.我們用IPTG誘導，在大腸桿菌BL21DE3中表達交融基因GSTRv2450，SDSPAGE電泳表現，在裝

7、有外源基因表達載體的大腸桿菌中，出現了特異的r約44000的交融卵白，而GST處的卵白質條帶消散，僅含空載體的大腸桿菌在r26000處有GST卵白的表達，證明白GSTRv2450交融基因的表達.原核表達中，重組卵白經常以包容體的情勢表達，對包容體舉行變性、復性處置懲罰不但操縱繁瑣，并且重組卵白的活性也每每受到影響.我們將誘導表達后的大腸桿菌超聲裂解后，別離取上清、沉淀和菌體做SDSPAGE電泳，創造表達的卵白以可溶性和包容體兩種情勢存在，凝膠掃描闡發確定表達的目的卵白量占菌體卵白的22.9%，因此我們得到了GSTRv2450交融卵白的高效表達，這與我們選用了最正確的表達載體和宿主菌及重復優化表

8、達條件是分不開的，其可溶性卵白為我們下一步大量純化表達產物，闡發其活性，進而深化研究Rv2450卵白的布局和成效奠基了底子.【參考文獻】1TufariellJ,JabsRJr,hanJ.IndividualybateriutuberulsisresusitatinprtingfatrhlguesaredispensablefrgrthinvitrandinvivJ.InfetIun,2022;721:515-526.2蘇明權，李立文，張彩蓮，等.結核分枝桿菌Rv1009的生物信息學闡發及克壟表達J.生物技能通訊，2022；146：557-559.SuQ,LiL,ZhangL,etal.Biin

9、fratianalysis，lngingandexpressinfRv1009fybateriutuberulsisJ.LettinBitehnl,2022;146:557-559.3ukalvaGV,KaprelyantsAS,YungDI,etal.AbaterialytkineJ.PrNatlAadSi,1998;95:8916-8921.4ana,LyashhenkK,langeliR,etal.T28,anvel28kildaltnprlinerihseretedantigenspeififrtheybateriutuberulsisplexJ.InfetIun,1997;6512:4951-4957.5artin