1、丹參新酮抗血小板作用及對血栓形成的影響第一章丹參新酮對血小板功能的影響目的: 血栓性疾病嚴重威脅人類健康,需要更多供選擇的抗栓藥物治療。 血小板的過度活化是血栓形成的一個重要因素,因而抗血小板藥物是其中重要一類。目前市售抗血小板藥物存在諸多不足, 從傳統中藥尋找抗血小板活性成分是一個良好途徑。前期實驗我們從丹參中發現一個抗血小板活性成分, 但其作用特點及機制尚不清楚。本部分實驗主要研究丹參新酮對血小板功能的影響及其可能的作用機制。方法 : 取健康成年雄性小鼠外周血 , 制備洗滌血小板和富血小板血漿 (PRP)。用血小板聚集儀評價丹參新酮對不同激動劑 ( 膠原、 CRP、凝血酶、 ADP、花生四

2、烯酸 ) 引起的血小板聚集的影響; 用血小板聚集儀評價丹參新酮對膠原、凝血酶引起的血小板釋放的影響; 用流式細胞儀評價丹參新酮對膠原、凝血酶誘導血小板 p-selectin和 JON/A的表達 ; 采用顯微熒光技術檢測丹參新酮對血小板在膠原表面的黏附和纖維蛋白原上擴展功能的影響; 觀察丹參新酮對血小板經凝血酶誘導的斑塊回縮功能的影響; 用流式細胞儀評價丹參新酮對不同激動劑誘導的血小板 ROS的影響和血小板胞內Ca2+的影響 ; 采用免疫蛋白印跡法檢測丹參新酮對血小板相關信號通路的影響。 結果 : 終濃度為 2 M,4M,8M的丹參新酮濃度依賴性地抑制膠原、 CRP、凝血酶引起的血小板聚集, 對

3、 ADP(4M,10M)和花生四烯酸 (100 M,50M)引起的血小板聚集無影響。丹參新酮能夠抑制膠原與凝血酶引起的血小板ATP釋放 ; 抑制膠原誘導的血小板 p-selectin和 JON/A的表達。丹參新酮可抑制血小板在膠原表面的黏附和在固化纖維蛋白原表面的擴展。丹參新酮能夠顯著抑制血小板斑塊回縮但不影響血小板胞內鈣離子的釋放。免疫印跡實驗結果顯示 , 丹參新酮能夠抑制膠原受體下游的PLC2,PKC,Akt,GSK3,ERK1/2 等蛋白的磷酸化。丹參新酮能夠降低由整合素IIb 3 介導的“ outside-in”信號中的 Src和 FAK磷酸化水平 , 但是不抑制 3 磷酸化。丹參新酮

4、可抑制 CRP誘導引起的血小板胞內 ROS水平增加 , 但對凝血酶誘導的胞內 Ca2+的內鈣釋放和外鈣內流均無明顯影響。結論 : 丹參新酮可能通過影響血小板 PLC2/PKC/ERK1/2,PI3K/Akt,Src/FAK信號抑制血小板“ inside-out”和“outside-in”信號通路 , 從而抑制血小板活化和聚集, 最終發揮抗血小板效應。 第二章丹參新酮對血栓形成的影響目的 : 上一章實驗研究發現丹參新酮具有較好的體外抗血小板活性 , 且起效濃度較低。但是丹參新酮是否在經機體代謝后仍具有抗血小板活性甚至抗栓活性尚不清楚。因此 , 我們在體研究丹參新酮的抗血小板作用, 同時觀察丹參新

5、酮對實驗動物血栓形成的影響。方法 : 在體給藥檢測丹參新酮對膠原和凝血酶誘導的血小板聚集的影響。建立小鼠膠原合并腎上腺素制備小鼠肺栓塞模型, 尾靜脈注射丹參新酮后 , 觀察其對模型小鼠肺血栓形成的影響; 建立三氯化鐵誘導的小鼠頸動脈血栓模型, 觀察尾靜脈給予丹參新酮后 , 小鼠頸動脈血栓形成時間的變化; 下腔靜脈狹窄法建立小鼠深靜脈血栓模型 , 觀察尾靜脈給予丹參新酮后, 丹參新酮對小鼠下腔靜脈血栓形成率、血栓大小、血栓長度的影響。觀察丹參新酮對小鼠斷尾出血時間的影響。結果 : 尾靜脈給予丹參新酮0.5 h后 , 膠原和凝血酶誘導的血小板聚集相比對照組顯著減弱。丹參新酮改善肺栓塞小鼠的自發癥狀

6、, 減少膠原聯合腎上腺素引起的小鼠肺部微血栓的形成。丹參新酮能延長小鼠頸動脈血栓的形成時間, 丹參新酮能夠降低深靜脈血栓發生率 , 并抑制深靜脈血栓模型小鼠血栓長度。丹參新酮能夠輕微延長小鼠斷尾出血時間。結論: 丹參新酮可抑制小鼠血栓形成 , 輕度延長出血時間。第三章血小板微顆粒 (PMPs)對深靜脈血栓形成的影響目的: 靜脈血栓的產生機制與動脈血栓存在顯著差異, 血小板在上述兩種血栓形成過程中可能發揮了不同作用 , 具有促凝作用的 PMPs可能介導深靜脈血栓的發生, 從而在靜脈血栓發生過程中發揮重要作用。為進一步探討丹參新酮對深靜脈血栓形成的影響, 我們以PMPs為切入點 , 通過研究 PMPs對深靜脈血栓形成的影響, 研究血小板與深靜脈血栓形成的可能聯系。方法 : 用流式細胞術建立 PMPs測定方法 ; 比濁法研究 PMPs對血小板聚集的影響 ; 流式細胞術檢測下腔靜脈狹窄小鼠外周血PMPs的相對含量 ; 流式細胞術研究PMPs對小鼠外周血中性粒細胞活化的影響; 免疫熒光實驗研究PMPs對小鼠深靜脈血栓中性粒細胞胞外誘捕網(NETs)的影響。結果 :PMPs自身不引起血小板的聚集 , 但能夠促進膠原誘導的血小板聚集 ;PMPs能夠促進下腔靜脈狹窄所致深靜脈血栓形成。DVT小鼠外周血中 PMPs