1、斑馬魚核糖體蛋白RPL5和RPL11缺陷致使再生障礙性貧血樣病征的分子機制研究答辯人：學科專業：指導教師：2014.1.6華中科技大學生命科學與技術學院人類基因組研究中心提綱研究背景實驗流程結果與討論小結與展望致謝研究背景再生障礙性貧血（Diamond-Blackfan anemia, DBA）骨髓是人體最重要的造血器官，骨髓造血干細胞及造血微環境的損害必然會引發造血功能不足的相關病征，嚴重威脅著人類健康。DBA是一種臨床主要表現為貧血的遺傳性骨髓衰竭綜合征，通常在嬰兒期或兒童早期出現病征；主要來自于紅細胞發育以及正常血小板和骨髓系統如造血干細胞（hematopoietic stem cell

2、, HSC）不足。Alter BP, Young NS. The bone marrow failure syndromes. Hematology of infancy and childhood, 1998, 1: 237-335.在英國和荷蘭的研究發現，每一百萬新生兒就有4-5名患病，同時也有證據顯示該病具有顯性遺傳性，潛在發病率可能在12-25。Ball S, McGuckin C, Jenkins G, Gordon-Smith E. Diamond-Blackfan anaemia in the UK: analysis of 80 cases from a 20-year bir

3、th cohort. British journal of haematology ,1996, 94(4): 645-653.核糖體蛋白缺陷與DBA核糖體是細胞中最古老的分子機器，為生命活動必須。核糖體由不同的核糖體蛋白RPs和rRNA分別組成核糖體大、小亞基，直至大、小裝配形成完整的核糖體。Wool IG. The structure and function of eukaryotic ribosomes. Annual review of biochemistry, 1979, 48(1): 719-754.Wool IG, Chan Y-L, Glck A. Structure an

4、d evolution of mammalian ribosomal proteins. Biochemistry and Cell Biology, 1995, 73(11-12): 933-947.首次發現的由于核糖體蛋白（RPS19）結構缺陷致使DBA，且是最頻繁的突變核糖體蛋白基因，占大約25%的DBA患者。隨著研究的不斷深入，越來越多的基因突變編碼編碼的核糖體亞單位，如小型核糖體蛋白RPS19, RPS24, RPS17, RPS7, RPS10, RPS26以及大型核糖體蛋白RPL5, RPL11, RPL35等已被證明會導致DBA。Draptchinskaia N, Gustav

5、sson P, Andersson B, et al. The gene encoding ribosomal protein S19 is mutated in Diamond-Blackfan anaemia. Nature genetics, 1999, 21(2): 169-175.Dianzani I, Loreni F. Diamond-Blackfan anemia: a ribosomal puzzle. Haematologica, 2008, 93(11): 1601-1604.細胞損傷，外界壓力等p53途徑會被激活細胞周期阻滯細胞衰老凋亡MDM2蛋白催化P53蛋白泛素化P

6、53蛋白的下調反式激活阻礙P53蛋白對其反式激活核仁應作用異常核糖體蛋白與MDM2結合P53蛋白抑制抑制抑制PI3K通路和MAPKs通路與血液生成有絲分裂原活化激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族參與機體內多種信號機制，其中 MEK/ERK 和 PI3K/AKT信號通路在多種生長因子、激素、細胞因子的刺激（如造血細胞因子）下，最終分別通過磷酸化活化的ERK和AKT，激活或抑制其下游靶各種蛋白，進而調節細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。研究表明，造血細胞因子、生長因子、趨化因子以及通過與細胞外基質和基質細胞相互作用協調控制骨髓微環境中的造血作用。這些刺激引起的細胞內信號事件整合，

7、通過MEK/ERK 和 PI3K/AKT信號通路，從而調節各種血細胞的增殖、存活、分化以及其遷移至骨髓。Arai A, Jin A, et al. SDF-1 synergistically enhances IL-3-induced activation of the Raf-1/MEK/Erk signaling pathway through activation of Rac and its effector Pak kinases to promote hematopoiesis and chemotaxis. Cellular signalling, 2005, 17(4): 49

8、7-506.Hammerman PS, Fox CJ, Birnbaum MJ, et al. Pim and Akt oncogenes are independent regulators of hematopoietic cell growth and survival. Blood, 2005, 105(11):4477-4483.Shelton JG, Steelman LS, Lee JT, et al. Effects of the RAF/MEK/ERK and PI3K/AKT signal transduction pathways on the abrogation of

9、 cytokine-dependence and prevention of apoptosis in hematopoietic cells. Oncogene, 2003, 22(16): 2478-2492.以斑馬魚為模型的DBA研究斑馬魚作為模式生物，與哺乳類相比，其重要器官發生中的許多關鍵作用分子以及重要事件在進化和功能方面都有很強的保守性。尤其實在胚胎發育，血液發生直至引發DBA病征的研究中得到廣泛應用。Jing L, Zon LI. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Disease Model

10、s & Mechanisms, 2011, 4(4): 433-438.在RPS19異常會通過激活p53途徑引發人類紅系始祖細胞的發育缺陷；RPS29基因異常通過p53途徑阻礙造血干細胞以及紅系祖細胞的形成；在RPS7基因抑制的斑馬魚模型中，p53途徑被激活，從而引發下游靶基因反應和生物事件包括細胞凋亡和細胞周期阻滯的發生，以相同方法同時下調p53基因可以部分回補該異常表型。Dutt S, Narla A, et al. Haploinsufficiency for ribosomal protein genes causes selective activation of p53 in hu

11、man erythroid progenitor cells. Blood, 2011, 117(9): 2567-2576.Taylor AM, Humphries JM, et al. Hematopoietic defects in rps29 mutant zebrafish depend upon p53 activation. Experimental Hematology, 2012, 40(3): 228-237.Duan J, Ba Q, Wang Z, et al. Knockdown of ribosomal protein S7 causes developmental

12、 abnormalities via p53 dependent and independent pathways in zebrafish. The international journal of biochemistry & cell biology, 2011, 43(8): 1218-1227.有關RPL5和RPL11異常與DBA的研究近期有大量臨床數據分析顯示，DBA患者中有10.1%的RPL5基因突變和6.5%的RPL11基因突變，并且在該患者中沒有發現RPS19或是RPS24基因突變。 Gazda HT, Sheen MR, Barras N, et al. Mutations

13、 of the genes for ribosomal proteins L5 and L11 are a common cause of Diamond-Blackfan anemia. In: Blood, 2007. AMER SOC HEMATOLOGY 1900 M STREET. NW SUITE 200, WASHINGTON, DC 20036 USA: 130A-131A.Cmejla R, Cmejlova J, Handrkova H, et al. Identification of mutations in the ribosomal protein L5 (RPL5

14、) and ribosomal protein L11 (RPL11) genes in Czech patients with DiamondBlackfan anemia. Human mutation, 2009, 30(3): 321-327.通過基因型及表型分析發現，大約有20%的患者篩查出帶有RPL5或者RPL11編碼基因突變。Quarello P, Garelli E, Carando A, et al. Diamond-Blackfan anemia: genotype-phenotype correlations in Italian patients with RPL5 a

15、nd RPL11 mutations. Haematologica, 2010, 95(2): 206-213.RPL5和RPL11異常與p53途徑關系密切Marechal V, Elenbaas B, Piette J , et al. The ribosomal L5 protein is associated with mdm-2 and mdm-2-p53 complexes. Molecular and cellular biology, 1994, 14(11): 7414-7420.Zhang Y, Wolf GW, Bhat K, , et al. Ribosomal prot

16、ein L11 negatively regulates oncoprotein MDM2 and mediates a p53-dependent ribosomal-stress checkpoint pathway. Molecular and cellular biology, 2003, 23(23): 8902-8912.結果與討論有報道，DBA病征還表現為生長阻滯和先天性畸形，尤其是在顱面、上肢、心臟、泌尿系統中出現缺陷。Gazda HT, Sheen MR, et al. Ribosomal protein L5 and L11 mutations are associated

17、 with cleft palate and abnormal thumbs in Diamond-Blackfan anemia patients. The American Journal of Human Genetics, 2008, 83(6): 769-780.10hpf時期的RPL11 MO注射的胚胎出現外包明顯減慢，甚至往后的發育過程中，到尾牙期無法外包，或者外包30%后停止，直至死亡（如圖4 G）；48hpf時期的胚胎，RPL5 MO注射的胚胎出現腹部的尾鰭少量減少，背部、尾部下垂，卵黃偏大等輕度畸形（如圖4 E,F）；48hpf時期RPL11 MO注射組有約20%的胚胎出現

18、較嚴重畸形，胚胎腹部尾鰭完全缺失，且尾部卷曲，頭部縮小，卵黃增大明顯。RPL5 和RPL11 缺陷對斑馬魚胚胎形態特征的影響共注射檢驗RPL5和RPL11 Morpholino功效RPL targeted morpholino-pEGFP-N1+Control MO注射組發出較明顯的綠色熒光（如圖A,C,E,G），說明該質粒在胚胎正常表達綠色熒光蛋白，而RPL targeted morpholino-pEGFP-N1+RPL11 MO注射組幾乎沒有綠色熒光。證實注射的RPL5 MO和RPL11 MO能與斑馬魚細胞中RPL5 和RPL11對應的mRNA起始密碼子區域互補結合氨基酸序列系統進化樹分

19、析updownsumRPL11 MO vs. Control51122173RPL5 MO vs. Control102203305RPL5 和RPL11 缺陷的斑馬魚全基因組RNA-Seq數據分析cirh1a, nat10, noc2l, dkc1, abce1, tars, polr1b, ahsa1, pwp2h, pdcd11, nol6, aatf等重要節點基因表達異常RPL5RPL11鐵代謝以及亞鐵血紅素合成不足血紅蛋白合成障礙血液生發障礙血液生發相關信號通路造血干細胞生成障礙alas2, tfa, and tfr1b等基因表達異常RPL5 和RPL11 缺陷對血液生發的影響 RP

20、L11和RPL5缺陷的斑馬魚體與對照組O-染色Chen AT, Zon LI. Zebrafish blood stem cells. Journal of cellular biochemistry, 2009, 108(1): 35-42.血液相關探針的原位雜交 RPL5和RPL11缺陷的斑馬魚體與對照組蘇丹黑B-染色 24hpf時期的對照組和RPL5和RPL11缺陷的斑馬魚體gata1, scl, pu1變化 36hpf和48hpf時期的對照組和RPL5和RPL11缺陷的斑馬魚體c-myb, runx1變化 36hpf和48hpf時期的對照組和RPL5和RPL11缺陷的斑馬魚體c-myb, runx1變化 對照組，RPL缺陷的斑馬魚體和RPL MOp53 MO共注射組蘇丹黑B-染色 6s時期的對照組，RPL 缺陷的斑馬魚體和RPL MOp53 MO共注射組gata1,scl,pu1表達變化 血液相關探針的胚胎整體原位雜交RT-PCR分析定量血液相關標記基因的表達c-myb，run