1、質(zhì)粒DNA的提取及檢測 質(zhì)粒（plasmid）是染色體外小型（1-200kb）的共價、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子（cccDNA），能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。 常常編碼一些對宿主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等 質(zhì)粒的復(fù)制：嚴(yán)緊型復(fù)制（1n個）松弛型復(fù)制（20個以上） 常用的質(zhì)粒載體是通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的。pUC18, pUC19Ampr抗性基因Ampr抗性基因編碼一種周質(zhì)酶（-內(nèi)酰胺酶）可特異地切割A(yù)mp的-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力質(zhì)粒提取的思路質(zhì)粒的特性：共價、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA要去除的物質(zhì)：蛋白基因組DNA脂類及小分子

2、雜質(zhì)RNA 凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）第一部分質(zhì)粒DNA的提取目 錄 返回標(biāo)題 一實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?shí)驗(yàn)原理附：原理示意圖三試劑四器材五注意事項(xiàng) 六操作步驟 1 六操作步驟 2 六操作步驟 3一目的了解提取質(zhì)粒的原理。學(xué)習(xí)和掌握質(zhì)粒提取的方法和技術(shù)。三個基本步驟：細(xì)菌的生長和質(zhì)粒的擴(kuò)增菌體的收集裂解及質(zhì)粒DNA的分離質(zhì)粒DNA的純化返回目錄二原理堿變性法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異：在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)；將pH調(diào)至中性并有高濃度鹽存在的條件下，染色體DNA之間交

3、聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)。通過離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。由于操作原因，提取的質(zhì)粒可有三種結(jié)構(gòu)：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。 返回目錄原理示意圖 返回目錄 返回原理三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 （一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺、臺式離心機(jī)、高壓滅菌鍋（二）材料：含pUC18（或其他）質(zhì)粒的大腸桿菌、（三）試劑： LB培養(yǎng)基（液體、固體）溶液I溶液II溶液IIITE(pH8.0)器材1. 恒溫?fù)u床2. 超凈工作臺3. 離心機(jī)4. 電泳

4、儀和電泳槽5. 玻璃器皿與耗材 量筒、三角瓶、平皿; EP管(1.5ml, 0.5ml); 槍頭(1ml, 0.2ml, 10l); 牛皮紙、紗布、牙簽等返回目錄試劑1. LB培養(yǎng)基 detail2. 溶液 I detail3. 溶液 detail4. 溶液III detail5. TE(pH8.0) detail 返回目錄 LB培養(yǎng)基 back 配制1升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水中加入：細(xì)菌培養(yǎng)基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone) 10g細(xì)菌培養(yǎng)基用酵母提取物(bacto-yeast extract) 5gNaCl10g搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，5mol/L NaOH(約0.2

5、ml)調(diào)節(jié)pH值至7.0,加入去離子水至總體積為1L，15 lbf/in2(1.034105Pa)高壓下蒸汽滅菌20分鐘。溶液 I back50 mmol/L 葡萄糖25 mmol/L TrisCl (pH8.0)10 mmol/L EDTA (pH8.0)在10 lbf/in2(6.895104Pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘，保存于4。 作用：分散細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活溶液 II back0.2 mol/ L NaOH(從5mol/L貯存液中現(xiàn)用稀釋)1% SDS作用：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。溶液 III back5mol/L 乙酸鉀60ml冰乙酸11.5ml水28

6、.5ml所配成的溶液中鉀的濃度為3mol/L，乙酸根的濃度為5mol/L。作用：酸性條件下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白-SDS線性DNA沉淀，K可中和DNA0.5 mol/L EDTA (pH8.0)在800ml 水中加入 186.1g EDTA-Na2H2O，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0 (約20g NaOH顆粒)，然后定容至1 L，分裝后高壓滅菌。1 mol/L TrisCl (pH8.0)在800ml 水中加入 121.1g Tris-base，溶解后加濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0 ，定容至1 L，分裝后高壓滅菌。TE(pH8.0) back10 mmol/L

7、 TrisCl (pH8.0)1 mmol/L EDTA (pH8.0)作用：穩(wěn)定四、實(shí)驗(yàn)步驟接含pUC18(或pET21a)質(zhì)粒的單菌落于3ml LB Amp+液體培養(yǎng)基中370C，190rpm振蕩培養(yǎng)過夜取1.5 ml菌液入1.5ml的離心管中 6000rpm、離心2min，棄上清，收集菌體100uL溶液I懸浮菌體（充分振蕩），室溫（或冰浴）10min加入200uL溶液II（輕輕混勻），冰上靜置5min裂解菌體加入150uL溶液III（輕輕混勻），冰上靜置15min質(zhì)粒DNA復(fù)性12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管上清加等體積的酚：氯仿：異戊醇（振蕩混勻）12000rp

8、m，離心15min，取上清記錄體積到一新管（可省略）上清加等體積的氯仿：異戊醇（振蕩混勻）12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管上清加2倍體積的無水乙醇（充分混勻），冰浴 30min12000rpm，離心15min沉淀用75%乙醇1mL洗滌兩次（輕彈混勻、離心）12000rpm，離心10min晾干沉淀沉淀用20ul TE溶解，-200C保存四操作步驟挑選一個單菌落，接種到含適當(dāng)抗生素的3ml LB培養(yǎng)液中，37振蕩培養(yǎng)1416小時。取1.2 ml菌液，12,000rpm離心1分鐘，收集菌體。加入溶液I 100l，渦旋振蕩充分懸浮、分散混勻 (重懸細(xì)胞)。加入200l溶液(現(xiàn)配

9、)，立即上下顛倒次，室溫放置分鐘（冰浴更佳），直至溶液澄清 (使細(xì)菌裂解、染色體DNA、蛋白質(zhì)變性)。加入溶液III l，輕柔顛倒510次，室溫放置分鐘（冰浴更佳）（利用pH差異，復(fù)性質(zhì)粒DNA）。返回目錄四操作步驟12,000rpm離心10分鐘，沉淀染色體DNA及不溶的變性蛋白。將上清液全部轉(zhuǎn)移到柱子里（注意：不要吸取沉淀，否則會有核污染），室溫放置分鐘（可長可短） 12,000rpm離心1分鐘。取下柱，棄去外收集管中的廢液，放回柱，加入ul Wash Solution, 高速離心分鐘；重復(fù)上述步驟次；取下柱，棄去外收集管中的廢液，放回柱，高速離心分鐘；將柱放入干凈的.mL 離心管中, 向柱

10、膜中央加ul TE（預(yù)熱到）, 室溫放置分鐘，蓋緊管蓋，高速離心分鐘；所得質(zhì)粒即可用于酶切、電泳或放 凍存。返回目錄分次收集4ml菌液離心，留沉淀第二部分瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)知識電泳：泳動速度決定于？ 瓊脂糖凝膠天然瓊脂（Agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（Agarose ，約占80）及瓊脂膠（Agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。瓊脂糖透明無紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。

11、瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍 核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系 不同構(gòu)型DNA的移動速度依次為：共價閉環(huán)超螺旋DNA（cccDNA）直線DNA（LDNA，2條鏈發(fā)生斷裂）開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA（ocDNA，1條鏈發(fā)生斷裂）。 影響遷移率的因素DNA分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、DNA的構(gòu)象、所加電壓（一般5V/cm）、電場方向、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成等。常用染料EB:溴化乙錠（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴鹽EthidiumBromide，EB），EB能插入DNA分子堿基對之間，導(dǎo)致EB與DNA結(jié)合。DNA吸收的260nm的紫外光傳遞給EB，或者結(jié)合的EB本身在30

12、0和360吸收的射線，均可在可見光區(qū)以590波長發(fā)射出來，呈橙紅色。EB染料優(yōu)點(diǎn)：染色操作簡便，快速，室溫下15-20min；不會使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少的DNA即可檢出；可以加到樣品中可膠中。EB是誘變劑，使用時一定要戴手套。 EB廢液要經(jīng)過處理才能丟棄。SYBR:新型低毒，高靈敏度染料，加入樣品中，價格較昂貴。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理 DNA在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。核酸為兩性分子，在pH3.5時，整個分子帶正電,pH8左右時，堿基幾乎不解離，整個分子帶負(fù)電。 在堿性環(huán)境下，相同堿基數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等

13、量的凈負(fù)電荷，能以同樣的速度向正極方向移動。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系，可以近似用于估算分子的大小。可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。共價閉環(huán)超螺旋DNA（cccDNA）直線DNA（LDNA，2條鏈發(fā)生斷裂）開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA（ocDNA，1條鏈發(fā)生斷裂）。 三、儀器、材料與試劑 （一）儀器：穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀（二）材料1.自已提取的質(zhì)粒DNA2.相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品（三）試劑 15 TBE儲液(pH8.0)使用時稀釋 10倍，成0.5TBE （1TBE也可）。 2凝膠加樣緩沖液0.2%溴酚藍(lán)，

14、50%蔗糖 3. 瓊脂糖 4.10mg/ml溴化乙錠溶液（EB），4保存。用時稀釋成5ug/ml的EB。 常用的電泳緩沖液4 保存?zhèn)溆?四操作步驟瓊脂糖（1%）凝膠電泳稱取一定量瓊脂糖凝膠，按1g中100ml的量加入電泳緩沖液，微波爐中加熱約2min，使瓊脂糖溶解；溶液冷至60 ，加入 EB至終濃度為0.5g/ml，混勻，注意戴手套操作；將瓊脂糖倒入電泳板中，使凝膠厚度約為0.3-0.5cm，迅速插上梳子，檢查有無氣泡；待凝膠完全凝固后（約30min），小心取出梳子，將凝膠板置于電泳槽中，加入電泳buffer，讓液面高出膠面1mm；在DNA樣品（ul）中加入1/6 loading buffer，混勻后用移液槍將樣品加入樣品孔中電泳，電壓降選擇為1-5V/cm （長度以兩個電極之間的距離計(jì)算）；根據(jù)指示劑的位置，判斷是否終止電泳;在紫外燈下凝膠成像儀上觀察電泳結(jié)果。返回目錄五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論根據(jù)觀察結(jié)果，繪圖。分析自提質(zhì)粒的情況。 pGFP pBSK M圖1的電泳結(jié)果不是很好，一方面上樣量太大不同構(gòu)象的質(zhì)粒分子沒有分開；另一方面有些樣品RNA去除得不好，在電泳結(jié)果上可以看到大團(tuán)的熒光