1、靶向肝脾巨噬細胞治療血小板減少性紫癜的實驗研究【關鍵詞】免疫性血小板減少性紫癜二氯亞甲基二膦酸鹽明膠微粒巨噬細胞experientalstudyfrthrbytpenipurpuratherapybytargetingarphagesinliverandspleendepartentfnulearediine,ruijinhspital,theshanghaijiatnguniversity,shanghai200025,hina;keylabratry,divisinfeduatinnpreparatinandappliatinfsuperfineaterials,huadngunivers

2、ityfsieneandengineering,shanghai200237,hinakeyrdsiunethrbytpenipurpura;dihlrethylenediphsphnate;gelatinpartile;arphage;targetingtherapyjexpheatl2022;15(1):103-107主要試劑細胞株和實驗動物ra264.7巨噬細胞株為中國科學院上海細胞生物所保存株。sd大鼠、新西蘭大白兔購自上海第二醫科大學附屬瑞金醫院動物房。明膠微粒對藥物的包封、肝脾靶向性和生物相容性研究在我科實驗室進展，載藥l2dp量為5g/g明膠微粒。巨噬細胞的tt試驗細胞培養巨噬細

3、胞株ra264.7常規復蘇后以含10%fs的de培養液于37、5%2中孵育24小時。移去培養液及未貼壁細胞，再參加培養液繼續孵育至細胞長滿培養皿底。以0.25%胰酶+edta消化30秒，制成細胞懸液傳代，至細胞長滿培養皿底后再次制成細胞懸液進展tt試驗。細胞抑制率=對照組d值-干預因素組d值/對照組d值100%。兔抗鼠血小板血清的制備別離血小板sd大鼠乙醚麻醉，腹主動脈取血，全血與抗凝劑3.8%檸檬酸鈉之比為91。室溫，125g離心10分鐘，無菌下移取上層富血小板血漿2000g離心20分鐘，移除上層血漿；沉淀的血小板以0.05l/lph7.4的pbs洗滌2次，生理鹽水懸浮，取少許稀釋后計數。免

4、疫用sd大鼠血小板耳緣靜脈注射免疫新西蘭大白兔，每只約1109個血小板，分別在首次免疫后的第15、30、40天時重復免疫1次。提取抗血小板血清末次免疫后10天，5%巴比妥麻醉，頸動脈插管預先以肝素潮濕管壁取血。兔的全血于室溫下放置1小時后移至4冰箱過夜，然后4、2000g離心20分鐘，然后于無菌條件下移取上層血清分裝，-20凍存備用。itp模型的建立7，8為了防止所使用的igg聚合引起部分阻塞，采用未經處理的兔抗鼠血小板血清代替純化抗體建立itp模型。單次不同劑量注射抗血小板血清50、100、150、200、300l，以sd大鼠血清稀釋至500l后靜脈注射，每組5只，另取5只靜脈注射普通兔血清

5、500l為對照。分別于注射前0小時、注射后4、24、48、72、96小時取血進展血小板、白細胞和紅細胞計數。屢次同一劑量注射鑒于150l組的血小板計數于靜脈注射后4小時降至最低為38.84.8109/l圖1，且不至引起實驗動物死亡。取sd大鼠5只，每24小時重復靜脈注射抗血小板血清150l，在一樣的時間點取血進展血小板計數。出血時間測定抗血小板血清注射后24小時在sd大鼠的尾巴上，用無菌刀片切出深約3與尾靜脈平行的創口注意避開能目睹的靜脈，每隔30秒用濾紙吸去出血直到出血完全停頓，記錄這期間的時間。上述各組分別在首次計數后24、48、72、96小時取血進展血小板計數，并在24小時按前述方法測定

6、出血時間。統計學處理采用sas6.12統計軟件，血小板計數以sd表示，進展t檢驗。結果tt試驗sd大鼠itp模型單次不同劑量注射sd大鼠靜脈注射抗血小板血清后血小板計數的變化見圖1。在50、100、150l劑量組，注射后4小時血小板計數逐漸下降至最低，分別為92.57109/l、61.78.3109/l、38.84.8109/l，其后逐漸上升，至48小時恢復正常程度。對照組的血小板計數未見明顯變化，各組紅細胞和白細胞計數均未見明顯異常變化。此外，200l組中于注射抗血小板血清后4小時內有2只動物死亡，存活的3只鼠4小時血小板計數為14.82.9109/l，300l組動物全部死亡。解剖發現死亡鼠

7、的內臟如肝、脾、肺及心包等存在程度不等的出血點或出血。屢次同一劑量注射150l抗血小板血清每24小時重復靜脈注射后血小板計數的變化見圖2。圖中對照組和單劑量組引用圖1中數據。結果顯示每24小時重復靜脈注射1次150l抗血清，可以使sd大鼠的血小板計數維持在低于50109/l的病理程度與對照組比擬，p0.01。出血時間對照組sd大鼠的出血時間均2分鐘n=5，而實驗組的出血時間均3分鐘n=15，顯示由抗血小板血清靜脈注射引起血小板下降后，也相應的導致出血時間明顯延長p0.01。討論治療itp的靶向藥物輸送方法早在1978年已有報道9，ahn等9使用載有長春堿的血小板作為巨噬細胞的“特洛伊木馬，希望

8、藥物進入細胞后再釋放出來殺死巨噬細胞，但其研究未達預期目的。直到有研究者開展了一種被稱為巨噬細胞“自殺技術的研究方法10，這一itp的治療策略才重新引起了人們的關注。這種方法現已成為研究生理或病理狀態下巨噬細胞功能的常用手段，并開場研究用于治療一些以巨噬細胞為藥物作用靶點的疾病如itp、aids等。建立動物itp模型的方法主要有3類，化學藥物誘導、使用抗血小板抗體單克隆抗體或多克隆抗體制備或使用有自發發生自身免疫性疾病傾向的動物種系7，8，11，12。本實驗使用抗血小板抗體建立sd大鼠itp模型，單次注射一定劑量的抗體所導致的血小板減少僅持續不到24小時，至48小時已恢復正常程度。而通過每24

9、小時重復注射150l抗血小板血清，可以維持血小板計數持續50109/l，出血時間延長到4分鐘正常2分鐘，而紅細胞和白血胞計數未見明顯降低，符合itp的實驗室檢查表現，這說明模型的建立是成功的。但臨床上除兒童itp多表現為急性外，成人itp大多起病緩慢，而通過注射抗體建立模型從病理上看應屬一種急性的疾病發生過程，因此這種動物模型能否反映成人itp的病理特征尚需進一步研究。l2dp是臨床上治療骨質疏松和腫瘤骨轉移的常用藥物，為水溶性，難以通過細胞膜，將其與300-500n的明膠微粒連接，那么可通過肝脾巨噬細胞對明膠微粒的攝取而進入細胞內發揮治療作用。目前藥物的殺傷細胞或抑制細胞活性的機制尚未完全清

10、楚，但現有研究已證實此藥對吞噬細胞巨噬細胞、破骨細胞等有毒性作用13。在以脂質體為載體進展的靶向巨噬細胞的動物研究中，研究者認為它的作用機理是：抑制或干擾細胞的物質代謝如溶酶體酶等的合成與能量代謝形成不能水解的atp類似物；影響單核吞噬細胞分泌細胞因子的種類和量，抑制干細胞的分化和成熟細胞的功能；在體外可誘導腫瘤細胞骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌等和巨噬細胞凋亡等14。但本實驗中l2dp產生療效確實切機制及其對全身免疫功能的影響還有待明確。我們的實驗結果和文獻資料7，8均說明，使用明膠微粒作為l2dp的載體將其定向輸送到肝脾巨噬細胞治療itp是可行的，尤其對急性發作所致血小板迅速下降可能導致的出血有較好的治療與預防作用，同時還可防止常規治療中伴隨的藥物毒副作用較大的缺點。盡管目前的資料尚不能