1、不同血液保存方法對 RNA1取的影響一、引言探索血液 RNA 保存方法的必要性全血作為較易獲取的人體標(biāo)本，特別適用于實(shí)驗(yàn)室和臨床檢測。高質(zhì)量的RNA可以滿足 RT-PCR qRT-PCR Northern blot、基因表達(dá)譜、轉(zhuǎn)錄組測序、核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)和陣列分析等生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)的研究需求1 。但由于 RNA 自身結(jié)構(gòu)為單鏈狀態(tài)，極不穩(wěn)定，同時(shí)廣泛分布的RNase 時(shí)刻發(fā)揮著降解RNA 的功能，其活性難以被抑制，因此使得從全血中提取RNA 以及對 RNA 的保存相對困難。常見的血液RNA 保存方法第一種為分離白膜層2，加入RNAlater 保護(hù)劑凍存-80 。此種方法為目前樣本庫常用的血液RN

2、A 保存方法，采血后需在常溫保存 4 小時(shí)內(nèi)完成白膜層分離，或在采血2 小時(shí)內(nèi)放入4 冰箱保存，24 小時(shí)內(nèi) 4 低溫分離，將分離獲得的白膜層用 RNAlater 保護(hù)劑保存， RNAlater 的主要作用為提供高鹽環(huán)境使細(xì)胞脫水，抑制核酸酶活性。此種方法的優(yōu)勢在于可將全血中大部分對于提取RNA無用的成分去除，縮減了樣本的體積，更加便于保存。但此種方法的弊端在于，首先分離白膜層的過程較為繁瑣，需要多次離心，在臨床醫(yī)院或臨時(shí)的采血點(diǎn)往往難以實(shí)施，其次高鹽脫水后的細(xì)胞復(fù)性困難，提取RNA 的難度增加，且高鹽組分不易去除，提取的 RNA 純度不高，最后血液在分離白膜層過程中，會有部分白細(xì)胞及RNA

3、組分缺失。第二種為專用的靜脈真空采血管，其中添加了特殊的試劑，可以保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的 RNA ，防止降解，但此方法核酸得率偏低，需大量血液來支撐下游實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容縱向地比較了兩種血液保存方式下， RNA 保存效果的對比；并探索了在不同保存溫度及不同保存時(shí)間下， RNA 的保存效果。希望本文可為廣大的科研同胞們提供幫助。二、材料和方法標(biāo)本來源本組血液樣品均采自同一志愿者，采用標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺技術(shù)，一次性使用真空 采血管EDTA Na2 5 ml （購于江蘇康捷醫(yī)療器械有限公司）采集靜脈血，全部標(biāo) 本白細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍為3.16 1033.25 103。方法白膜層分離采集3管新鮮血液，每管5ml,采血后1

4、0 min內(nèi)3,000 rpm離心10min,吸 棄血漿，加入和血漿等體積的 PBS緩沖液，顛倒混勻。取15 ml離心管，加入 7.5 ml Ficoll-paqueTM PLUS lymphocyte isolation sterile solution （購于 GE 公司， Lot.10244745）,吸取采血管中血細(xì)月fi加入分離液中分層，2,000 rpm離心20min。 吸棄上層PBS,移液器吸取白膜層轉(zhuǎn)移至5 ml離心管中，加入PBS吹打混勻， 2,000 rpm離心10min,棄上清。加入400 l PBS緩沖液重懸，然后分別緩慢加 入不同RNA保護(hù)液。Q 組：力口入 1.2 m

5、l RNAlater RNA Stabilization Reagent （購于 Qi*n 公司， Lot.15*995 ）;A 組：加入 1.2 ml A*on RNAlater Solution （購于英 * 基，Lot.00*70 ）； B 組：加入 1.2 ml RNAfixer 保存液（購于 Bioteke 公司,Cat. RP1302）。將三管樣品均凍存于-80C保存。白膜層RNA提取（沉淀法）取200 l保存的白膜層，加2 ml RL裂解液，渦旋混勻30 s,室溫裂解15min； 加入300 l氯仿，渦旋混勻10s,室溫放置3 min； 12,000 rpm離心10min,吸 取

6、水相，加入等體積異丙醇，-20C沉淀至少2h,若出現(xiàn)渾濁，加入DEPC水配 制的50%異丙醇，直至混濁消失；4C, 12,000 rpm離心15min,小心棄上清； 加入1 ml 75%乙醇漂洗2次；30 l RNase-free H2O溶解。白膜層RNA提取（離心柱法）嚴(yán)格按照試劑盒操作說明操作，所用試劑盒為：血液（液體樣本）總 RNA快速提取試劑盒（離心柱型）（購于 BioTeke,Cat.RP4001);動物組織總RNA提取試劑盒（離心柱型）（購于Tiangen, Lot.P4920）。血液RNA保存管提取RNA采集新鮮全血，30 min內(nèi)轉(zhuǎn)移2.5 ml至10 ml血液RNA保存管（購

7、于 BioTeke, Cat. ST1001）中，渦旋混勻30s,室溫放置10 min,而后轉(zhuǎn)移至不同 條件保存。提取時(shí)取1.6 ml液體，恢復(fù)室溫，放置10分鐘，加入200 l氯仿， 渦旋混勻10s,室溫放置3 min； 4 C 12,000 rpm離心10min,吸取水相，加入 等體積70%乙醇，混勻，將混合液加入 RA柱，12,000 rpm離心1 min,棄濾液； 加入500 l去蛋白液RE, 4 C 12,000 rpm離心1 min,棄濾液；加入700 l漂 洗液RW,4c 12,000 rpm離心1 min,棄濾液；力口入500 l漂洗液RW,4c 12,000 rpm離心1 m

8、in,棄濾液；4C 12,000 rpm離心2 min；將吸附柱RA插入新的1.5 ml 離心管，加入 30 l RNase-free H2O 溶解 3 min； 12,000 rpm 離心 1min。RNA質(zhì)量檢測采用超微量紫外分光光度計(jì)測定紫外 260nm處吸光度值計(jì)算RNA濃度， A260/A280和A260/230比值判斷提取純度。電泳時(shí)取5 l核酸，采用UltraPower 核酸染料點(diǎn)染，2%瓊脂糖凝膠，150V電壓條件下電泳15min拍照，曝光時(shí)間 2s。三、結(jié)果與分析分離白膜層法RNA保存結(jié)果與分析表1.沉淀法提取RNAlater保存的白膜層RNA濃度結(jié)果Abs260Abs280

9、Abs230260/230260/280樣品濃度 樣品類型樣品編號(ng/l)B0.3750.2251.7450.211.6715.0RNAQ0.2770.1731.0770.261.611.1RNAA0.6260.4162.4150.261.5125.0RNA表2. BioTeke離心柱法提取RNAlater保存的白膜層RNA濃度結(jié)果組別Abs260Abs280Abs230260/230樣品濃度260/280(ng/ l)樣品類型B0.3640.2080.9250.391.7514.5RNAQ0.3120.1640.2681.171.912.5RNAA0.350.1940.4460.781.

10、8114.0RNA表3.Tiagen離心柱法提取RNAlater保存的白膜層RNA濃度結(jié)果Abs260Abs280Abs230260/230260/280樣品濃度 樣品類型樣品編號(ng/l)B0.2720.1510.5950.461.810.9RNAQ0.3290.1664.3390.081.9813.2RNAA0.2920.1470.9170.321.9911.7RNA分析：全血經(jīng)分離白膜層后，采用 BioTeke、Q及A三家品牌的RNAlater 保存液保存后，分別采用了沉淀法及離心柱法（兩種品牌）提取 RNA,均未能 成功提取RNA。表現(xiàn)在兩方面，一是 OD260/230比值嚴(yán)重偏低，

11、說明其中有大 量鹽分的殘留，二是得率極低，三種方法的平均得率依次為1.02 g/ml、0.82 g/ml 及0.72 g/ml （表13）。因此，全血經(jīng)分離白膜層后，RNA提取效果不好。保存管法（Bioteke） RNA保存結(jié)果與分析表4.血液RNA保存管在不同溫度下保存3天后提取結(jié)果編號保存溫度Abs260Abs280Abs230260/230260/280樣品濃度樣品舊(ng/ l)125 C2.6761.3673.5510.751.96107.0RNA225 C3.3581.7883.1161.081.88134.3RNA34C2.9521.5923.210.921.85118.1RNA

12、44C2.811.3981.7181.642.01112.4RNA5-20 C3.7512.0013.3431.121.87150.0RNA6-20 C3.0291.5832.5641.181.91121.1RNA78-80 C-80 C2.6643:7661.2932.0681.22744552.17052.06182106.61506RNARNA12345678iss *圖1.血液RNA保存管在不同溫度下保存3天后提取結(jié)果電泳圖表5.血液RNA保存管在不同溫度下保存7天后提取結(jié)果編保存Abs260Abs280Abs230260/230260/280樣品濃度樣品號溫度(ng/ l)回125

13、C3.9892.0712.0521.941.93159.6RNA225 C2.8551.4211.4421.982.01114.2RNA34 c2.9621.5041.8771.581.97118.5RNA44 c3.0481.5441.6351.861.97121.9RNA5-20 C2.4211.2171.5421.571.9996.8RNA6-20 C2.3131.1571.2881.8292.5RNA7-80 C2.7551.4682 8250 981 881102RNA8-80 C3.0091.5532.6921.121.94120.4RNA1 2 3 4 5 6 782SS1SS

14、圖2.血液RNA保存管在不同溫度下保存7天后提取結(jié)果電泳圖表6.血液RNA保存管在不同溫度下保存一年后提取結(jié)果編縣保存260/230樣品濃度汨即Abs260Abs280Abs230260/280(ng/ D樣品類型5-20 C3.0441.5832.3471.31.92121.8RNA6-20 C2.8891.4661.7891.611.97115.5RNA78-80 C-80C2.739-376641.4181.9431.8413:271.49-1121.93-19109.6146BRNARNA567828S 18S 圖3.血液RNA保存管在不同溫度下保存一年后提取結(jié)果電泳圖分析：樣本經(jīng)Bi

15、oteke血液RNA保存管保存3天時(shí)，25 C、4 C、-20 C 和-80 C保存條件下的RNA得率無明顯的差異，平均為8.75 g/ml;保存7天的 結(jié)果RNA平均得率為9.82 g/ml, 25 C的血液開始降解；-20 C- -80 C保存1 年血液RNA無明顯降解（表46,圖13）。因此，全血經(jīng)Bioteke血液RNA保 存管保存后，效果優(yōu)。四、討論血液中核酸絕大部分存在于白細(xì)胞當(dāng)中，而白細(xì)胞僅占血液成分1%左右，并且血液中含有豐富的 RNA 酶，這就使得血液的保存以及RNA 提取變得十分棘手。通過本文實(shí)驗(yàn)，采用淋巴細(xì)胞分離液分離白膜層后，提取RNA 效果較差。分析原因可能是RNAlater 本身為高鹽溶液，其本身會造成白細(xì)胞失水皺縮，導(dǎo)致復(fù)性困難。采用 Bioteke 血液 RNA 保存管保存血液，其3 天、7 天、 1 年的平均得率為9.33ug/ml ， Bioteke 核酸得率約為市面上常用的 D 公司 Blood RNA Tube 采血 管的 7.8倍。此外全血采集后直接凍存-80 也可作為一種保存血液的方式，已有研究表明，盡管低溫可以抑制酶的活性，但即使在-20 C甚至-80 C中，RNase還可以緩慢發(fā)揮功能， -80 保存一周的 RNA 濃度和純度與新鮮全血