1、、制備膠體金的準(zhǔn)備（一）玻璃器皿的清潔制備膠體金的成功與失敗除試劑因素以外玻璃器皿清潔是非常關(guān)鍵的一步。如果玻璃器皿內(nèi) 不干凈或者有灰塵落入就會(huì)干擾膠體金顆粒的生成，形成的顆粒大小不一，顏色微紅、無(wú)色 或混濁不透明。我們的經(jīng)驗(yàn)是制備膠體金的所有玻璃器皿先用自來(lái)水把玻璃器皿上的灰塵流 水沖洗干凈，加入清潔液（重鉻酸鉀1000g，加入濃硫酸2500ml，加蒸餾水至10000ml）浸 泡24h，自來(lái)水洗凈清潔液，然后每個(gè)玻璃器皿用洗潔劑洗34次，自來(lái)水沖洗掉洗潔劑， 用蒸餾水洗34次，再用雙蒸水把每個(gè)器皿洗34次，烤箱干燥后備用。通過(guò)此方法的處 理玻璃器皿不需要硅化處理，而直接制備膠體金。也可用已經(jīng)

2、制備的膠體金溶液，用同等大 不顆粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后棄去，再用雙蒸水洗凈，即可使用，這 樣效果更好，因?yàn)闇p少了金顆粒的吸附作用。（二）試劑的配制要求按照Frens法還可以制備出其它不同顆粒大小的膠體金出來(lái)。許多研究證明用該法制備膠體 金時(shí)金顆粒的大小是檸檬酸三鈉用量的函數(shù)，基本的規(guī)律是檸檬酸三鈉用量多，膠體金顆粒 直徑小，檸檬酸三鈉用量越少，腔體金顆粒直徑越大。（1）所有配制試劑的容器均按以上要求酸處理洗凈，配制試劑用雙蒸餾水或三蒸餾水。（2）氯化金（HauCl4水溶液的配制：將lg的氯化金一次溶解于雙蒸水中配成1%的水溶液。 放在4”c冰箱內(nèi)保存長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月至1年左右，仍

3、保持穩(wěn)定。（3）白磷或黃磷乙醚溶液的配制：白磷在空氣中易燃燒，要格外小心操作。把白磷在雙蒸 水中切成小塊，放在濾紙上吸于水份后，迅速放入已準(zhǔn)備好的乙醚中去，輕輕搖動(dòng)，等完全 溶解后即得飽和溶液。儲(chǔ)藏于棕色密閉瓶?jī)?nèi)，放在陰涼處保存。檸檬酸三鈉還原法(Frens 1973 )此方法是由Frens在1973年創(chuàng)立的，制備程 序很簡(jiǎn)單，膠體金的顆粒大小較一致，廣為采用。該法一般先將0.01%的HAuCl4 溶液加熱至沸騰，迅速加入一定量1%檸檬酸三鈉水溶液，開(kāi)始有些藍(lán)色，然后 淺藍(lán)、藍(lán)色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸710min出現(xiàn)透明的橙紅色。各種顆粒的 膠體金制備詳見(jiàn)表5-2。表5-2檸檬酸三鈉用量與膠體

4、金顆粒直徑的關(guān)系0.01%的 HAuCl4（ml）1%檸檬酸三鈉(ml)直徑(ml)1005.010.01004.015.01001.525.01001.050.01000.7560.01000.6070.01000.4298.01000.32147.01000.25160溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子。目前常用的還原劑有：白磷、乙醇、過(guò)氧 化氫、硼氫化鈉、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等，下面分別介紹制備不同大小顆粒的膠體金 溶液。二、制備膠體金的方法和步驟窄長(zhǎng)型膜，依靈敏度及流速的要求,選用孔徑不同的合適的膜.自下端至上端(由左至右)由:樣品墊(sample pad)載有固相標(biāo)記配體

5、(抗體或抗原)的玻璃纖維素膜條或聚酯膜條(conjugate release membrane)合適孔徑的硝酸纖維素膜條(噴涂有顯示陽(yáng)性結(jié)果的捕捉分析物的配體線，和陰性對(duì)照 組線)(ni-trocellulose memtrane)吸水墊(absorbent pad)等四部分銜接固定在不干擾免疫反應(yīng)和流速的簿塑料背板上 (back sheet)膠體金快速斑點(diǎn)結(jié)合免疫分析隨著免疫分析日益廣泛應(yīng)用于以臨床為主以及非臨床領(lǐng)域的診斷工業(yè)(diagnostic industry)，免疫分析向兩個(gè)方向發(fā)展：一類為全自動(dòng)化的免疫分析；另一類為以硝酸纖維 膜為載體的快速免疫分析。前者需要價(jià)格昂貴的全自動(dòng)儀器及

6、與儀器嚴(yán)格配套的各種試劑 盒，目前只能在醫(yī)療及檢測(cè)中心應(yīng)用，雖也能較快速給出結(jié)果，但仍需一定時(shí)間，不適合遠(yuǎn) 離醫(yī)療及檢測(cè)中心的地區(qū)，更不能用于“患者床旁檢驗(yàn)”(real time clinical decision) 和普查的需要，在酶免疫分析的基礎(chǔ)上，主要以硝酸纖維素膜為載體的快速診斷方法迅速和 廣泛地發(fā)展起來(lái)。這類方法目前在文獻(xiàn)及市場(chǎng)上的命名還很不統(tǒng)一。它實(shí)際上屬于快速斑點(diǎn) 免疫結(jié)合分析(dot immunobinding assay, DIBA)，始于80年代。現(xiàn)介紹如下：1兩種模式1.1班點(diǎn)免疫滲濾分析(dot immunofiltrtion assay, DIFA)免疫反應(yīng)是通過(guò)垂直

7、穿透固定有配體的硝酸纖維素膜而進(jìn)行的(flow through type)。1.2 斑點(diǎn)免疫層析分析(dot immunochro-matography assay ,DICA) 分析原理與 DIFA 相同，只是反應(yīng)液體的流動(dòng)不是直向的穿透流動(dòng)，而是層析作用的橫向流動(dòng)lateral flow type)，在1990年開(kāi)始應(yīng)用。兩種類型快速免疫分析比較見(jiàn)表。表 免疫滲濾分析和免疫層析分析的比較免疫滲濾分析(穿透濾過(guò)型)免疫層析分析(橫向流動(dòng)型)硝酸纖維素 膜的種類及 形式組成方 式為圓片膜孔徑 較簡(jiǎn)單，由載有配體(抗體或抗 原)的硝酸纖維素膜片及底層 的吸水墊料組成為窄長(zhǎng)型膜，依靈敏度及流速的要

8、求，選 用孔徑不同的合適的膜.自下端至上端 (由左至右)由：樣品墊(sample pad)載有固相標(biāo)記配體(抗體或抗原)的玻 璃纖維素膜條或聚酯膜條(conjugate release membrane)合適孔徑的硝酸纖維素膜條(噴涂有 顯示陽(yáng)性結(jié)果的捕捉分析物的配體 線,和陰性對(duì)照組線)(ni-trocellulose memtrane)吸水墊(absorbent pad)等四部分銜 接固定在不干擾免疫反應(yīng)和流速的簿塑料背板上（back sheet）標(biāo)記配體的 形式為液相形式根據(jù)需要及可能可設(shè)計(jì)同時(shí)大多數(shù)為固相形式多功能性測(cè)定一種以上分析物加樣、洗 滌、加標(biāo)記同左操作步驟配體及洗滌等步驟大多

9、數(shù)只有加樣一個(gè)步驟注：以上標(biāo)記配體均為膠體金或硒標(biāo)記、分散型染料標(biāo)記等。如為酶標(biāo)記則二者都必須 增加“加顯色底物”的步驟2標(biāo)記物的種類標(biāo)記物包括、膠體金屬（膠體金，膠體硒）、分散型染料（disperse dyes）和染料標(biāo) 記的微球（latex particles）等，標(biāo)記物各有優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)以下的標(biāo)準(zhǔn)選擇，如：靈敏 度，所需要的顏色，分析的模式和操作步驟，制備、保證重復(fù)性、急定性及規(guī)模及的難易程 度和重復(fù)性，以及標(biāo)記物所需配體量等。其中酶雖然有高靈敏度，重復(fù)性好及標(biāo)記物易規(guī)模 化等優(yōu)點(diǎn)，但它需要洗滌，加底物等步驟，需要反應(yīng)的時(shí)間也長(zhǎng)些，對(duì)技術(shù)也有一些要求， 故未能作為快速診斷的主要標(biāo)記物（1

10、985年最初的免疫滲濾分析是以酶作為標(biāo)記物）。目 前應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記物為膠體金，包括：膠體金免疫滲濾分析（gold immumofiltraition assay GIFA）或滴金免疫分析和膠體金免疫層析分析（gold immunochromatography assay , GICA）。由于GICA更簡(jiǎn)便快速，已成為目前最主要的快速免疫分析方法之一。3原理膠體金免疫滲濾分析（GIFA）原理與操作步驟基本與ELISA相同：加樣品于固定有配體 （抗體或抗原，此處以抗體為例，下同）的硝酸纖維素膜上，通過(guò)滲濾在膜中形成抗體抗 原復(fù)合物，洗滌滲濾后，再加液體的膠體金標(biāo)記抗體。當(dāng)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，在膜上固定

11、有抗體 -抗原-膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物而呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。膠體金免疫層析分析CICA原理與GIFA相同， 只是操作步驟有所不同，如反應(yīng)液體流動(dòng)方向由垂直滲濾改為橫向?qū)游隽鲃?dòng)（見(jiàn)表）：樣品 加樣品墊（1）上，樣品向吸水墊（4）方向流動(dòng)，途徑載有固相膠體金標(biāo)記抗體膜（2）后， 將金標(biāo)記物完全復(fù)溶，抗原與金標(biāo)記抗體形成金標(biāo)記抗體-抗原復(fù)合物，繼續(xù)向前流動(dòng)至硝 酸纖維素膜條（3）上，固定有捕捉抗原的抗體線處。當(dāng)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，金標(biāo)記抗體抗原復(fù) 合物上，就會(huì)形成金標(biāo)記抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物，呈現(xiàn)紅色陽(yáng)性條帶；如樣品中無(wú)抗原， 則不被捕獲，就不顯色，則結(jié)果為陰性。多余的游離金標(biāo)記抗體繼續(xù)前移至固定有抗金標(biāo)記

12、體二抗處，被固定呈現(xiàn)紅色的陰性對(duì)照。GICA與GIFA不同之處在于后者只是單一的免疫層 析條，不需要其它試劑，一步操作。二者與ELISA不同處是反應(yīng)時(shí)間大大縮短，僅需要數(shù)分 鐘就完成了 ELISA需數(shù)小時(shí)才能顯示的結(jié)果。因?yàn)樵贕IFA和GICA中，高濃度的抗體集中固 定在纖維素的微孔中，待測(cè)抗原在滲濾或?qū)游鰰r(shí)，流經(jīng)微孔與固定的高濃度抗體緊密接觸， 很快完成免疫結(jié)合反應(yīng)。這就是以膜為基礎(chǔ)的膠體金快速免疫結(jié)合分析中的免疫濃縮作用 （immunoconcentraiton）。在ELISA中，待測(cè)抗原要在液相中經(jīng)過(guò)擴(kuò)散作用，逐漸與吸附 在固相表面的抗體結(jié)合。同時(shí)，標(biāo)記抗體也需要同樣的擴(kuò)散結(jié)合過(guò)程形成抗

13、體-抗原-標(biāo)記抗 體復(fù)合物，故需時(shí)間較長(zhǎng)。4膠體金塊快速免疫結(jié)合分析的應(yīng)用應(yīng)用領(lǐng)域很廣，可分為臨床應(yīng)用與非臨床應(yīng)用兩類。目前應(yīng)用多以前者為主。4.1臨床應(yīng)用 已應(yīng)用于臨床的很多領(lǐng)域。由于目前它還是定性分析，故主要用以檢測(cè) 正常體認(rèn)中不存在的生物活性物質(zhì)（如傳染病的抗原及抗體），以及正常情況下體液中含量 很低而在某些疾病中升高的生物活性物質(zhì)。隨著技術(shù)的進(jìn)展，對(duì)某些可確定診斷的、有正常 上限值（cutoff）的生物活性物質(zhì)也可進(jìn)行檢測(cè)。下面列出國(guó)內(nèi)外已應(yīng)用的項(xiàng)目。傳染病（1）各種病毒的相應(yīng)抗原及抗體：各種病毒性肝炎、巨細(xì)胞病毒抗體， 單純皰疹病毒抗體，風(fēng)疹病毒抗體，腎綜合癥出血熱抗體，登革熱病毒抗

14、體及輪狀病毒等;（2）性病：愛(ài)滋病病毒抗體，梅青螺旋體抗體，淋球菌及泌尿生殖系統(tǒng)的衣原體等；（3） 細(xì)菌：結(jié)核桿菌抗體，A族乙型溶血鏈球菌、沙門氏菌、幽門螺旋桿菌抗體等；（4）寄生 蟲(chóng)：瘧原蟲(chóng)，血吸蟲(chóng)抗體，包囊蟲(chóng)抗體，弓形蟲(chóng)抗體等。激素目前用于生殖標(biāo)志物，主要有診斷早早孕的人絨毛膜促性腺激素（HCG） 和檢測(cè)排卵的促黃體生成素（LH）和促卵泡激素（FSH）等。心血管病急性心肌梗死的標(biāo)志物，包括肌酸激酶的同工酶CK-MB，肌紅蛋白， 肌鈣蛋白-T及脂肪酸結(jié)合蛋白質(zhì)（PABP）等。還有與心血管疾病有重要關(guān)系的D-二聚體 （D-dimer）的檢測(cè)。腫瘤包括對(duì)腫瘤進(jìn)行篩查和早期診斷有意義的腫瘤標(biāo)志物，

15、如前列腺特異抗 原（PSA），AFP，CEA，CA125及CA15-3，以及對(duì)腸道腫瘤篩查有重要意義的大便潛血免疫 檢測(cè)（FOB）等。自家免疫病 抗雙鏈DNA抗體和診斷甲狀腺自家免疫病的甲狀腺過(guò)氧化物酶 （TPO）抗體。毒品檢測(cè)尿液中的可卡因、大麻、嗎啡、海洛因、苯丙胺等。國(guó)外報(bào)道有可 同時(shí)測(cè)7種毒品的GICA。其它檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白，半定量檢測(cè)血清a-脂蛋白。4.2非臨床應(yīng)用可用于食品檢測(cè)，環(huán)境污染，生物沾染，還可用于生物戰(zhàn)劑的快速檢 測(cè)，獸醫(yī)學(xué)及法醫(yī)學(xué)等方面檢測(cè)。5制作及操作中需注意的問(wèn)題以GICA為例，它將幾種組分優(yōu)化組合成一個(gè)整體的免疫層析分析條，許多條件及條件 的組合都會(huì)影響到它的質(zhì)量

16、，包括：（1）硝酸纖維素膜的性能和質(zhì)量，膜孔徑大小及均一性，選定膜孔徑的適宜性，結(jié)合配 體（抗原或抗體）容量的大小，非特異吸附性能，親水性及液體的流動(dòng)性和流動(dòng)速 度的均一性等；（2）捕捉配體的量及質(zhì)量（配體的純度，親和力及滴度）及在膜上配體的包被量和均一 性。配體劃線位置的固定一致性；（3）固相金標(biāo)記膜中的膠體金和配體的含量和比度，條間的均一性，固相標(biāo)記物的穩(wěn)定 性，復(fù)溶性，復(fù)溶速度及流動(dòng)性，所含緩沖物質(zhì)的種類及有效促溶劑的使用等；各種膜，甚至包括樣品墊是否經(jīng)過(guò)預(yù)期處理以減少非特異吸附。以上條件都可以綜合影響膠體免疫層析的質(zhì)量控制，主要包括：靈敏度，陰陽(yáng)性界限值 （cutoff）的準(zhǔn)確性和一致

17、性及層析條間的重復(fù)性等。）（1）靈敏度：因測(cè)定主要針對(duì)正常人體液中不存在或含量很低的生物活性物質(zhì)的定性結(jié)果。高靈敏度及其重復(fù)性是最重要的質(zhì)量控制指標(biāo)。為此，生產(chǎn)廠家在保證分析條的各種優(yōu)化條 件外，還應(yīng)提供能確證靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)品，供操作者檢驗(yàn)其靈敏度和重復(fù)性。另外，還應(yīng)配有 相應(yīng)的陽(yáng)性及陰性對(duì)照血清以供對(duì)照之用。(2)陰陽(yáng)性界限值的準(zhǔn)確性和重復(fù)性：避免發(fā)生假陰性人假陽(yáng)性結(jié)果，保證結(jié)果的正確。 生產(chǎn)廠家應(yīng)提供確定界限值的標(biāo)準(zhǔn)品，最好還要提供低于或高于界限值的標(biāo)準(zhǔn)品(注明濃 度)，以供使用者對(duì)結(jié)果的判斷。6應(yīng)用的重點(diǎn)和展望臨床應(yīng)用的重點(diǎn)應(yīng)放在：(1)急需快速診斷以便進(jìn)行治療的急重癥，如協(xié)助確診急性心肌

18、 梗死的急性心梗標(biāo)志物就是很好的例子。有普查意義的檢查和流行病學(xué)調(diào)查：如各種傳染病(病毒性肝炎，艾滋病，性病及其它各種流行病)流行病調(diào)查；某些腫瘤(如前列腺癌，結(jié) 腸癌，肝癌，乳腺癌)的普查及預(yù)防檢查；圍產(chǎn)期的健康普查等。它可以作為快速的初篩普 查手段，對(duì)陽(yáng)性和可疑的結(jié)果再進(jìn)一步做更細(xì)的可靠的檢查。今后的發(fā)展：(1)全面提高質(zhì)量。突出質(zhì)量控制的保證，為進(jìn)一步發(fā)展打好基礎(chǔ)。提高檢測(cè)的靈敏度。目前檢測(cè)的靈敏度都低于相應(yīng)的定量免疫分析，應(yīng)盡量縮小差 距。除使用各種優(yōu)質(zhì)的原料，如膜條，高純度高親和力的配體(特別是配伍好的優(yōu)質(zhì)單 抗)，優(yōu)質(zhì)高比度的標(biāo)記配體以及先進(jìn)的工藝外，還應(yīng)引進(jìn)信號(hào)放大系統(tǒng)，例如生物

19、素 -鏈親和素系統(tǒng)，用鏈親和素作為膜上的捕捉配體，分別用生物素化和膠體金標(biāo)記的配 伍良好的優(yōu)質(zhì)的特異性單抗與分析物形成免疫復(fù)合物。應(yīng)用鏈親和素與生物素結(jié)合的四 價(jià)性及極高的親和常數(shù)，可明顯提高靈敏度。此外，鏈親和素-生物素系統(tǒng)還可以作為 一種通用的分析系統(tǒng)，檢測(cè)不同的抗原。由于鏈親和素價(jià)格較貴，也可用高質(zhì)量的抗生 物素抗體作為通用的檢測(cè)系統(tǒng)。實(shí)現(xiàn)半定量和定量化。可通過(guò)精確控制膜上捕捉配體的量，使用多條平行捕捉配 體線的方法，通過(guò)顯色條帶的數(shù)目，判斷分析物的濃度區(qū)間，得到半定量的結(jié)果；應(yīng) 用反射的光密度計(jì)測(cè)量顯色帶或斑點(diǎn)的顏色強(qiáng)度，換算成濃度值，實(shí)現(xiàn)定量的估算。德 國(guó)寶靈曼生產(chǎn)的肌鈣蛋白-T及相

20、應(yīng)的測(cè)量?jī)x(strip reader)即可顯示出免疫層析條 上肌觸目驚心蛋白-T的量。香港研制的FABP膠體金免疫滲濾分析也配有定量分析儀， 可進(jìn)行定量測(cè)定。二者均成為患者床旁診斷急性心肌梗死的快速靈敏方法。檢測(cè)多種分析物。同一個(gè)膜上可同時(shí)測(cè)定幾種有相關(guān)意義的分析物，如乙型肝炎不 同的抗原及抗體。國(guó)外已有同時(shí)測(cè)幾種心梗標(biāo)志物及測(cè)定多種毒品的膠體金免疫分析。建立檢測(cè)全血的方法。主要針對(duì)急重癥快速診斷之用，以減少分離血清的音間。德 國(guó)寶靈曼生產(chǎn)的人肌鈣蛋白GICA便采用全血檢測(cè)方法。檢測(cè)全血的方法對(duì)自檢，患者 床旁檢查和邊遠(yuǎn)地區(qū)的普查都有實(shí)際應(yīng)用意義。免疫膠體金的制備及其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用周友泉斑

21、竹膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。近年已在各種生物學(xué)研究中廣泛使用。在臨床使用的免疫印跡技術(shù)幾乎都使用其標(biāo)記。同時(shí)在流式、電鏡、免疫、分子生物學(xué)以至生物芯片中都可能例用到。1971年Faulk和Taytor將膠體金引人免疫化學(xué)，此后免疫膠體金技術(shù)作為 一種新的免疫學(xué)方法，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。目前在醫(yī)學(xué)檢 驗(yàn)中的應(yīng)用主要是免疫層析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金滲濾法 (Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于檢測(cè) HBsAg、HCG 和抗雙鏈。 NA抗體等，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。免疫

22、膠體金技術(shù)的基本原理氯金酸(HAuCl4 )在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù) 電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標(biāo) 記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。吸附機(jī)理可 能是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié) 合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金 顆粒。這種球形的粒子對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、免 疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共 價(jià)結(jié)合，因而在基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)中成為非常有用的工具。免疫金標(biāo)記技術(shù)(Im

23、munogold labelling techique)主要利用了金顆粒具有 高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo) 記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或 半定量的快速免疫檢測(cè)方法中，這一反應(yīng)也可以通過(guò)銀顆粒的沉積被放大，稱之 為免疫金銀染色。膠體金的制備方法膠體金的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、 白磷、硼氫化鈉等。下面介紹最常用的制備方法及注意事項(xiàng)。1、玻璃容器的清潔：玻璃表面少量的污染會(huì)干擾膠體金顆粒的生成，一切 玻璃容器應(yīng)絕對(duì)清潔，用前經(jīng)過(guò)酸洗、硅化。硅化過(guò)程一般是將玻璃容器浸泡于 5%二氯二

24、甲硅烷的氧仿溶液中1分鐘，室溫干燥后蒸餾水沖洗，再干燥備用。 專用的清潔器皿以第一次生成的膠體金穩(wěn)定其表面，棄去后以雙蒸餾水淋洗，可 代替硅化處理。2、試劑、水質(zhì)和環(huán)境：氯金酸極易吸潮，對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，不能使 用金屬藥匙，避免接觸天平稱盤。其1%水溶液在4。可穩(wěn)定數(shù)月不變。實(shí)驗(yàn)用 水一般用雙蒸餾水。實(shí)驗(yàn)室中的塵粒要盡量減少，否則實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將缺乏重復(fù)性。金顆粒容易吸附于電極上使之堵塞，故不能用pH電極測(cè)定金溶液的pH值。 為了使溶液pH值不發(fā)生改變，應(yīng)選用緩沖容量足夠大的緩沖系統(tǒng)，一般采用檸 檬酸磷酸鹽(pH3 5.8)、Tris-HCL (pH5.8 8.3)和硼酸氫氧化鈉(pH8.5

25、10.3) 等緩沖系統(tǒng)。但應(yīng)注意不應(yīng)使緩沖液濃度過(guò)高而使金溶膠自凝。3、檸檬酸三鈉還原法制備金溶膠：取0.01 %氯金酸水溶液100ml加熱至沸，攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入1%檸檬酸三鈉 水溶液0.7ml ,金黃色的氯金酸水溶液在2分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸15分 鐘，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積，如此制備的金溶膠其可見(jiàn)光區(qū)最高吸收峰在 535nm ,A1cm/535=1.12。金溶膠的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關(guān)，一 旦顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變異，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的顯著的顏色變化， 這就是金溶膠用于免疫沉淀或稱免疫凝集試驗(yàn)的基礎(chǔ)。金溶膠顆粒的直徑和制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉量是密切相關(guān)的，保持其他

26、條 件恒定，僅改變加入的檸檬酸三鈉量，可制得不同顏色的金溶膠，也就是不同粒 徑的金溶膠，見(jiàn)附表。附表100 ml氯金酸中檸檬酸三鈉的加入量對(duì)金溶膠粒徑的影響1%檸檬酸三鈉ml 0.300.450.701.001.502.00金溶膠顏色藍(lán)灰紫灰紫紅紅橙紅橙吸收峰(nm)220240535525522518徑粒(nm)14797.571.5412 4.5154、檸檬酸三鈉-鞣酸混合還原劑：用此混合還原劑可以得到比較滿意的金 溶膠，操作方法如下：取4ml 1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H2O)，加入0 5ml 1%鞣酸，0 5ml 25mmo/L K2CO2 (體積與鞣酸加入量相等)，以雙蒸

27、餾 水補(bǔ)至溶液最終體積為20ml，加熱至60C取1ml 1%的HAuCl4，加于79ml 雙蒸餾水中，水浴加熱至60C，然后迅速將上述檸檬酸-鞣酸溶液加入，于此 溫度下保持一定時(shí)間，待溶液顏色變成深紅色(約需0.5 1小時(shí))后，將溶液加 熱至沸騰，保持沸騰5分鐘即可。改變鞣酸的加入量，制得的膠體顆粒大小不同。5、白磷還原法：在120ml雙蒸餾水中加入1.5ml 1%氯金酸和1.4ml0.1mol/L K2CO3，然后加入1ml五分之一飽和度的白磷乙醚溶液，混勻后室溫 放置15分鐘，在回流下煮沸直至紅褐色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。此法制得的膠體金直徑 約6nm，并有很好的均勻度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般實(shí)

28、驗(yàn)室不宜采用。要得到大小更均勻的膠體金顆粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度離心，經(jīng)分級(jí) 后制得膠體金顆粒直徑的變異系數(shù)（CV）可小于15%。免疫膠體金制備1、蛋白質(zhì)的處理：由于鹽類成分能影響金溶膠對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，并可使溶 膠聚沉，故致敏前應(yīng)先對(duì)低離子強(qiáng)度的水透析。必須注意，蛋白質(zhì)溶液應(yīng)絕對(duì)澄 清無(wú)細(xì)小微粒，否則應(yīng)先用微孔濾膜或超速離心除去。一般情況下應(yīng)避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在，因?yàn)樗鼈兌伎晌接陬w粒表 面而減弱膠體金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附。2、蛋白質(zhì)最適用量的選擇：將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)儲(chǔ)存液作系列稀釋后，分別取 0.1ml（含蛋白質(zhì)540ug）加到1ml膠體金溶液中，另設(shè)一管不加蛋白質(zhì)的對(duì)照 管，5分鐘

29、后加入0.1ml 10%NaCl溶液，混勻后靜置2小時(shí)，不穩(wěn)定的金溶膠 將發(fā)生聚沉，能使膠體金穩(wěn)定的最適蛋白量再加10%即為最佳標(biāo)記蛋白量。3、標(biāo)記：在接近并略為高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的條件下標(biāo)記是比較合適的，在此情 況下蛋白質(zhì)分子在金顆粒表面的吸附量最大。下述標(biāo)記步驟最為常見(jiàn)：用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl調(diào)節(jié)金溶膠至所需pH（標(biāo)記SPA時(shí)調(diào)到 pH6.0）。于100ml金溶膠中加入最佳標(biāo)記量的蛋白質(zhì)溶液（體積為23ml ）,攪拌 23分鐘。加入5ml 1%PEG20000溶液。于10000 100000g離心30 60分鐘（根據(jù)粒徑大小選擇不同離心條件）， 小心吸去上清

30、液（切忌傾倒）。將沉淀懸浮于一定體積含0.20.5mg/ml PEG20000的緩沖液中，離心沉淀 后，再用同一緩沖液恢復(fù)，濃度以A1cm/540nm=1.5左右為宜，以0.5mg/ml 疊氮鈉防腐，置4C保存。包被后的金溶膠也可濃縮后于Sephadex G-200柱進(jìn)行凝膠層析分離純化，以 含0.1 %BSA的緩沖溶液洗脫。通常用IgG包被的金溶膠洗脫液pH為8.2 , 以A蛋白包被的金溶膠洗脫液為pH7.0。以上操作中應(yīng)注意，一切溶液中不應(yīng)含雜質(zhì)微粒，可用高速離心或微孔濾膜預(yù)處 理。膠體金的穩(wěn)定性及免疫膠體金的貯存膠體金具有很高的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，在穩(wěn)定因素不受破壞時(shí)自身凝聚極慢，可 放置數(shù)年

31、不發(fā)生凝聚。影響穩(wěn)定的因素主要有電解質(zhì)、溶膠濃度、溫度、非電解 質(zhì)等。金溶膠必須有少量電解質(zhì)作穩(wěn)定劑，但濃度不宜過(guò)高。高濃度親水性非電解 質(zhì)能剝?nèi)ツz粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物質(zhì)促使溶膠凝聚，但一定 量的高分子物質(zhì)反而可增加溶膠穩(wěn)定性，如蛋白質(zhì)、葡萄糖、PEG20000等的 加入有良好的穩(wěn)定效果。當(dāng)金溶膠吸附蛋白質(zhì)后，溶膠的穩(wěn)定性隨溶液pH而變化，而這種變化又取 決于吸附蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，如ConA，過(guò)氧化物酶等，當(dāng)pH較低時(shí)保持穩(wěn)定， 提高pH則顯得不穩(wěn)定，接近等電點(diǎn)或略高時(shí)又變得穩(wěn)定了。標(biāo)記后的膠體金溶 液可用0.20.5mg/ml PEG20000作為穩(wěn)定劑。在410。貯存數(shù)月有

32、效，不 宜冰凍。貯存中可能會(huì)發(fā)生程度不同的凝聚，可離心除去。免疫膠體金的應(yīng)用1、膠體金在電鏡水平的應(yīng)用膠體金應(yīng)用電鏡水平的研究最早，發(fā)展最快，應(yīng)用最廣泛。其最大優(yōu)點(diǎn)是可 以通過(guò)應(yīng)用不同大小的顆粒或結(jié)合酶標(biāo)進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記。直徑為315nm 膠體金均可用作電鏡水平的標(biāo)記物。315nm的膠體金多用于單一抗原顆粒的 檢測(cè)，而直徑15nm多用于檢測(cè)量較多的感染細(xì)胞。膠體金用于電鏡水平的研究，主要包括：細(xì)胞懸液或單層培養(yǎng)中細(xì)胞表面抗原的觀察。單層培養(yǎng)中細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測(cè)。組織抗原的檢測(cè)。金標(biāo)記在電鏡水平的應(yīng)用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫 負(fù)染色、雙標(biāo)記技術(shù)和原位雜交技術(shù)等。實(shí)驗(yàn)證明，該法

33、樣本用量少、檢測(cè)速度快、對(duì)比明顯、操作簡(jiǎn)單、敏感性和 特異性高，既可用于抗原檢測(cè)，也可用于抗體檢測(cè)，因此，可同時(shí)適用于科研和 診斷。2、膠體金在光鏡水平的應(yīng)用膠體金同樣可用做光鏡水平的標(biāo)記物，取代傳統(tǒng)的熒光素、酶等。各種細(xì)胞 涂片、切片均可應(yīng)用。主要用于：用單克窿抗體或抗血清檢測(cè)細(xì)胞懸液或培養(yǎng) 的單層細(xì)胞的膜表面抗原。檢測(cè)培養(yǎng)的單層細(xì)胞胞內(nèi)抗原，組織中或亞薄切 片中抗原的檢測(cè)。膠體金用于光鏡水平的研究，可以彌補(bǔ)其它標(biāo)記物不可避免的本底過(guò)高和內(nèi) 部酶活性干擾等缺點(diǎn)。3、膠體金在流式細(xì)胞儀中的應(yīng)用：應(yīng)用熒光素標(biāo)記的抗體，通過(guò)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分析細(xì)胞表面抗原，是免疫學(xué) 研究中的重要技術(shù)之一。但由于不同

34、熒光素的光譜相互重疊，區(qū)分不同的標(biāo)記困 難，因此必須尋找一種非熒光素標(biāo)記物，用于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。這樣可以同時(shí)進(jìn)行 幾種標(biāo)記。該標(biāo)記物必須能夠改變散射角，膠體金可以明顯地改變紅激光散射角， 因而可以作為流式細(xì)胞儀的標(biāo)記物之一。4、凝集試驗(yàn)：?jiǎn)畏稚⒌拿庖呓鹑苣z呈清澈透明的溶液，其顏色隨溶膠顆粒大小而變化，當(dāng)與相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生專一性反應(yīng)后出現(xiàn)凝聚，溶膠顆粒極度增大，光散射隨之發(fā)生變化，顆粒也會(huì)沉降，溶液的顏色變淡甚至變成無(wú)色，這一 原理可定性或定量地應(yīng)用于免疫反應(yīng)。5、免疫印跡技術(shù)(immunoblotting):免疫印跡是一種較新的免疫化學(xué)技術(shù)。 用聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，得到的區(qū)帶轉(zhuǎn)移至

35、硝酸纖維素膜，然后用 酶免疫法(或免疫熒光、RIA)進(jìn)行定量。免疫膠體金也可用于該法的定量。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜與某特異性的抗體 保溫后，再與經(jīng)葡萄球菌A蛋白致敏的膠體金溫育，徹底洗去多余的膠體金，根 據(jù)膜上膠體金顆粒顏色深淺可測(cè)知樣品中的特異性抗原。利用金顆粒可催化銀離子還原成金屬銀這一原理，采用銀顯影劑增強(qiáng)金顆粒 的可見(jiàn)性，更可大大提高測(cè)定靈敏度，檢測(cè)下限可低至0.1ng，這種免疫金銀染 色法應(yīng)用已日趨廣泛。由于膠體金免疫印跡技術(shù)簡(jiǎn)便、快速，且有相當(dāng)?shù)母叩撵`敏度，在臨床免疫 診斷上有很大的應(yīng)用潛力。6、膠體金在肉眼水平的應(yīng)用膠體金取代傳統(tǒng)三大標(biāo)記物，用于肉眼水平的免疫檢測(cè)中。除了膠體金本身

36、 具有的特點(diǎn)外，還有以下優(yōu)點(diǎn)：試劑和樣本用量極小，樣本量可低至1 2ul ; 不需Y-計(jì)數(shù)器、熒光顯微鏡、酶標(biāo)檢測(cè)儀等貴重儀器，更適于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用； 沒(méi)有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)參與；實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以長(zhǎng)期保存；時(shí)間大大縮短，提高了檢測(cè)速度。金標(biāo)過(guò)程中，無(wú)共價(jià)鍵形成，是一定離子濃 度下的物理吸附。因此幾乎所有的大分子物質(zhì)都可被金標(biāo)記，標(biāo)記后大分子物質(zhì) 活性不發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，膠體金的敏感性可達(dá)到ELISA的水平。而結(jié) 合銀染色時(shí)，檢測(cè)的敏感性更大大提高。膠體金在免疫層析快速診斷技術(shù)中的應(yīng)用免疫層析法（immunochromatography ）是近幾年來(lái)國(guó)外興起的一種快速診斷 技術(shù)，其

37、原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的 硝酸纖維素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜 向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特 異性結(jié)合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn) 特異性的免疫診斷。圖一、左，正現(xiàn)圖 右：縱切圖1 ,吸水靖依 2,固定有披3 - HCG IS 的 NC!膜 3,凍干金標(biāo)記抗皿-HUG瑯璃纖難4. 拔尿踱璃纖錐 5、試劑質(zhì)控旺帶 6、固定的抗H HCT抗體區(qū)若了.岐質(zhì)塑料底板早孕診斷用的免疫層析試紙條（通常又叫尿妊紙條）的裝 配結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖一。裝配方法：在塑料底板上分別將吸尿用玻璃纖維、凍干金標(biāo) 記抗a - HCG玻璃纖維、已固定有抗p-HCG抗體的NC膜及硬質(zhì)吸水濾紙按 圖裝配，配件與塑料底板的