1、關于病毒抗原與抗體檢測技術第一張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月一、抗原抗體反應特異性高可逆氫鍵、范德華力、靜電吸引力可見抗原-抗體比例適宜，復合物相成團第二張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月二、影響反應的因素電解質pH7時，適當電解質使其結合可見凝集團或沉淀溫度 37溫度升高，反應加快 56酸堿度 pH68接近等電點時易出現假陽性第三張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月第一節 免疫熒光技術Immunofluorescence assay IFA能解決：是什么 在哪里 有多少熒光激發光譜發射光譜熒光效率熒光壽命熒光猝滅熒光偏振第四張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月

2、第一節 免疫熒光技術熒光物質熒光物質最大吸收光譜最大發射光譜應用異硫氰酸熒光素 (FITC)490495nm520530nm （黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測定四乙基羅丹明 (RB200)570575nm595600nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明 (TRITC)550nm620nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標記FAT藻紅蛋白（PE）490-560nm595nm（紅色）雙標記FAT、流式細胞術7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（藍色）雙標記或多標記FATEu3+螯合物340nm613nm時間分辨熒光免疫測定第五張，PPT共七十九頁，創作于202

3、2年6月二、免疫熒光試驗（一）原理用熒光標記物標記病毒抗原或抗體，作為分子探針，檢查細胞或組織內相應的病毒抗體或抗原。熒光標記物受激發光照射后發光，用熒光顯微鏡觀察，可確定病毒種類、定位、定量。第六張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月二、免疫熒光試驗（二）類型熒光抗體法熒光抗原法免疫細胞（組織）化學技術第七張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月二、免疫熒光試驗（三）方法制備標本制備熒光抗體熒光抗體染色熒光顯微鏡檢查第八張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月二、免疫熒光試驗1.制作病毒染色標本培養敏感細胞（細胞爬片） 種毒 固定、干燥丙酮第九張，PPT共七十九頁，創作于2022年6

4、月二、免疫熒光試驗1.制作病毒染色標本 臨床樣本（非固型組織） 涂片 固定、干燥第十張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月二、免疫熒光試驗1.制作病毒染色標本 尸檢樣品（35mm） 脫水脫色 冰凍切片 印片 石蠟固定、脫蠟 丙酮固定、干燥第十一張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月二、免疫熒光試驗2.熒光抗體制備制備抗體用高純度病毒免疫動物獲取血清，分離IgG，提純 家兔、綿羊、山羊 高特異性 高親和力第十二張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月二、免疫熒光試驗2.熒光抗體制備標記熒光素 共價鍵結合抗體+熒光素 4持續攪拌數小時純化（離心、透析、過濾）第十三張，PPT共七十九頁，創

5、作于2022年6月二、免疫熒光試驗3.鑒定制成的熒光抗體 以FITC為例熒光（F）蛋白（P）結合率調整制備液至A280mm=1 2.87A495mm A280mm-0.35A495mm比值越大，抗體結合熒光素越多F/P=第十四張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月二、免疫熒光試驗3.鑒定制成的熒光抗體測定抗體效價：雙向免疫擴散試驗抗體特異性：吸收試驗、抑制試驗抗體特異性染色滴度：倍比稀釋第十五張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月二、免疫熒光試驗4.熒光抗體染色直接法第十六張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月二、免疫熒光試驗4.熒光抗體染色間接法第十七張，PPT共七十九頁，創作于

6、2022年6月二、免疫熒光試驗4.熒光抗體染色補體法熒光標記抗補體抗體 雙標記法兩種熒光素抗體檢測兩種抗原第十八張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月二、免疫熒光試驗5.設立對照 區分特異性和非特異性染色標本自發熒光對照熒光抗體對照陽性抗原對照阻斷試驗第十九張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月三、免疫熒光顯微鏡技術熒光顯微鏡利用一定波長的激發光對樣品進行激發，產生一定波長的熒光，對樣品結構或其組分進行定性、定位、定量觀察檢測。 第二十張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月三、免疫熒光顯微鏡技術光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素燈 濾光片：隔熱、激發和吸收濾光片光路：透射光、落射光聚光器：

7、明視野、暗視野和相差熒光聚光器鏡頭：消色差鏡頭 第二十一張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月三、免疫熒光顯微鏡技術透射光：照明光線從標本下經聚光器透過標本進入物鏡。落射光：照明光線從標本上經垂直照明器落射到標本，經標本反射進入物鏡。第二十二張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月四、時間分辯免疫熒光技術Time-resolved fluoroimmunoassay TR-FIA（一）原理自發熒光壽命短:1ns10ns鑭系元素壽命長:10s1000s短壽命熒光完全衰變后再測定鑭系元素特異熒光銪Ed3+ 锝Tb3+ 釤Sm3+鏑Dy3+第二十三張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月四、

8、時間分辯免疫熒光技術（二）方法類型雙抗體夾心法固相抗體和Eu3+標記抗體與待檢抗原結合，形成固相抗體-待檢抗原-Eu3+標記抗體復合物，酸性增強液下，Eu3+解離，340nm激發光下發射613nm熒光。第二十四張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月四、時間分辯免疫熒光技術（二）方法類型固相抗體競爭法 待檢抗原和Eu3+標記抗原與固相抗體競爭結合,溫育洗滌后在固相中加入熒光增強液,測定熒光強度，熒光強度與待檢抗原含量成反比。固相抗原競爭法 待檢抗原和固相抗原競爭結合定量的Eu3+標記抗體，溫育洗滌后在固相中加入熒光增強液,測定熒光強度，熒光強度與待檢抗原含量成反比。第二十五張，PPT共七十九

9、頁，創作于2022年6月第二節 酶免疫技術Enzyme immunoassay抗原抗體反應特異性酶高效催化反應專一性 第二十六張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月第二節 酶免疫技術酶 底 物顯色反應 測定波長 辣根過氧化物酶HRP 鄰苯二胺OPD四甲替聯苯胺TMB氨基水楊酸鄰聯苯甲胺2,2-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽 橘紅色黃色棕色蘭色藍綠色492460449425642堿性磷酸酯酶 AP4-硝基酚磷酸鹽(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽 黃色紅色 400500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭 黃色深藍色 405420 -半乳糖苷酶

10、 甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG) 熒光黃色 360,450420 第二十七張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月第二節 酶免疫技術酶標記戊二醛交聯法過碘酸氧化法醛基酶蛋白質HRP過碘酸鹽HRP醛基第二十八張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月第二節 酶免疫技術固相載體塑料制品微粒膜載體 NC膜、尼龍膜第二十九張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月第二節 酶免疫技術包被與封閉包被適宜濃度蛋白質封閉二次包被填補空隙 小牛血清第三十張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月二、酶聯免疫吸附試驗Enzyme-linked immunosorbent assay E

11、LISA酶標記抗體（抗原）與待測抗原（抗體）發生特異性反應，加入酶底物，通過酶對底物的顯色反應，對待測抗原（抗體）進行定位、定性或定量分析。第三十一張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月第三十二張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月間接法檢測抗體+固相抗原 標本 酶標抗體 底物 顯色第三十三張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月雙抗體夾心法檢測抗原+固相抗體 標本 酶標抗體 底物 顯色第三十四張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月競爭法可檢測抗原、抗體YYY+YYY+YYY參考管酶標抗原YYY+YYY+YYY待測管酶標抗原抗原第三十五張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月捕

12、獲法檢測IgM抗體+抗IgM 標本 抗原 酶標抗體 顯色 （含IgM）+第三十六張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月三、免疫酶染色試驗Immunoenzymatic staining test IEST酶標抗體（抗原）抗原（抗體）復合物 底物 有色底物第三十七張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月三、免疫酶染色試驗細胞免疫酶染色均相酶免疫測定無需分離游離與結合的酶標記物酶標記物結合后改變酶活性非均相酶免疫測定需分離游離與結合的酶標記物液相：用二抗或沉淀去除游離酶標記物固相：ELISA第三十八張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月第三節 放射免疫技術Radioimmunoassay

13、 RIA利用放射性核素靈敏精確性與抗原抗體反應特異性相結合進行定量分析放射免疫核素標記抗原與未標記抗原競爭性結合特異性抗體免疫放射核素標記抗體結合待測抗原R.S. Yalow第三十九張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月第三節 放射免疫技術125I、131I、3H、14C標記純化鑒定放射性免疫活性第四十張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月第三節 放射免疫技術第四十一張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月第三節 放射免疫技術放射免疫競爭法第四十二張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月+BoundFreeAgAb6/8=0.754/8=0.52/8=0.251/8=0.125B/

14、B+F第四十三張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月第三節 放射免疫技術放射免疫以未結合的Ag*為F，Ag*Ab復合物為B，則B/F或B/(BF)與Ag的量變存在著函數關系劑量反應曲線 第四十四張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月第四節 血清學試驗中和試驗血凝/血凝抑制試驗補體結合試驗第四十五張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月一、中和試驗neutralization test 體外將病毒與特異性抗體混合并發生反應，再將混合物接種至敏感的宿主體內，然后測定殘存病毒感染力的方法。 中和抗體第四十六張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月一、中和試驗（一）原理中和抗體存在使病毒不

15、能吸附和穿入宿主細胞，使病毒失去感染力。當病毒與抗體混合后，接種敏感宿主細胞再觀察敏感宿主的情況，即觀察殘存的病毒對宿主的感染力。第四十七張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月一、中和試驗（二）方法步驟病毒-已知滴度，并有感染力測滴度：細胞培養，將病毒10倍稀釋接種敏感細胞或動物，觀察CPE或動物感染情況，確定滴定終點以CCID50或LD50表示標準病毒試驗濃度：100 CCID50/單位體積或100 LD50/單位體積第四十八張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月一、中和試驗抗體用細胞培養法測病毒抗體的滴度：將倍比稀釋的病毒抗血清液與等量的標準病毒液混合，接種敏感細胞，觀察CPE。病

16、毒抗體滴度的確定：抗血清保護細胞免受病毒感染的最高稀釋倍數的倒數。抗體滴度的含義：抑制CPE的最高稀釋倍數的抗血清中，每單位體積含一個抗體單位。第四十九張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月一、中和試驗舉例如觀察結果是1：10至1：320抗血清均能抑制病毒的CPE，也就是當抗血清稀釋到320倍時，0.1ml抗血清含有1個抗體單位。請問：1：160及1：40含有幾個抗體單位？標準抗體濃度為20個抗體單位/0.1ml第五十張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月一、中和試驗宿主細胞培養:觀察CPE和空斑（最理想和常用）雞胚：觀察雞胚的死亡（流感）、絨毛尿囊腔上痘瘡及血凝現象（天花、牛痘、HS

17、V）動物（小白鼠）:成年和幼鼠易感，如乙腦病毒、森林腦炎病毒第五十一張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月一、中和試驗（二）方法步驟固定血清稀釋抗病毒法檢測病毒及其滴度固定病毒稀釋抗血清法檢測血清效價第五十二張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月一、中和試驗（二）方法步驟固定血清稀釋病毒法 用中和試驗方法鑒定病毒時，將不同稀釋倍數的病毒與標準的抗血清(20個抗體單位/單位體積)混合、孵育，使二者充分反應，然后將混合液接種到敏感宿主體內，觀察試驗結果。 第五十三張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月固定血清稀釋病毒法試驗材料宿主:敏感細胞和動物、雞胚標準抗病毒血清(20個抗體單位/0

18、.1ml)病毒分離物試驗步驟不同濃度病毒液與等量的抗病毒血清混合細胞培養液倍比稀釋病毒不同濃度病毒液與等量陰性血清混合接種細胞, 設正常細胞對照，CO2孵箱觀察CPE中和試驗病毒CCID50：當抗血清組的CCID50與陰性組之差的對數大于2,才說明中和試驗陽性。第五十四張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月固定血清稀釋病毒法 陰性血清病毒CCID50的計算病毒稀釋度CPE孔數/接種孔數 累計數CPE數 存活數CPE陽性比例CPE陽性率（）10-45/510 010/10100.010-54/5 5 1 5/683.010-61/5 1 5 1/617.010-70/5 0 100/10 0

19、第五十五張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月固定血清稀釋病毒法距離比例（大于50%的CPE陽性率50%）/（大于50%的CPE陽性率小于50%的CPE陽性率）（8350）/（8317）0.5lgCCID50=大于50%的CPE陽性率血清稀釋度的對數+距離比例稀釋系數的對數=lg10-5+0.5 lg0.1=-5.5,其反對數是10-5.5.陰性血清組的病毒CCID50為10-5.5/0.1ml。第五十六張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月固定血清稀釋病毒法 陽性血清病毒CCID50的計算病毒稀釋度CPE孔數/接種孔數 累計數CPE數 存活數CPE陽性比例CPE陽性率（）10-25/

20、510 010/10100.010-33/55 25/771.010-42/52 52/729.010-50/5 0 100/10 0第五十七張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月固定血清稀釋病毒法距離比例（大于50%的CPE陽性率50%）/（大于50%的CPE陽性率小于50%的CPE陽性率） （7150）/（7129）0.5大于50%的CPE陽性率血清稀釋度的對數+距離比例稀釋系數的對數=lg10-3+0.5 lg0.1=-3.5,其反對數是10-3.5。陽性血清組的病毒CCID50為10-3.5/0.1ml。 因抗血清組的CCID50為10-3.5，陰性血清組的病毒CCID50為10-

21、5.5,所以10-3.5-10-5.5=2,表明分離的病毒是與中和抗體相對應的病毒。第五十八張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月一、中和試驗（二）方法步驟固定病毒稀釋血清法 用于血清抗體滴度的測量。用已知病毒檢測位置抗體滴度。 100 CCID50/單位體積的病毒+連續倍比稀釋血清孵育1h接種敏感宿主觀察不同稀釋度的血清保護宿主感染病毒的情況第五十九張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月固定病毒稀釋血清法試驗材料:敏感宿主標準滴定的病毒100CCID50/0.1ml急性期或恢復期血清試驗步驟細胞培養液倍比稀釋急性或恢復期血清取不同稀釋濃度血清與標準病毒混合并37孵育1h取混合液0.2

22、ml接種細胞,CO2孵箱觀察CPE50血清中和終點：50%細胞不產生細胞病變的血清稀釋度第六十張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月固定病毒稀釋血清法恢復期血清中和病毒的結果血清稀釋度CPE孔數/接種孔數 累計數CPE數 無CPE數CPE陽性比例CPE陽性率（）1：16(10-1.2)0/40 80/80.01：32(10-1.5)1/41 41/520.01：64(10-1.8)3/44 14/580.01：128(10-2.1)4/48 08/8100.0第六十一張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月固定病毒稀釋血清法距離比例（50%小于50%的CPE陽性率）/（大于50%的CPE

23、陽性率小于50%的CPE陽性率）（5020）/（8020）0.550%血清中和終點的范圍:1:32與1:64之間。中和終點濃度=小于50%的CPE陽性率血清稀釋度的對數+距離比例稀釋系數的對數=lg10-1.5+0.5 lg0.5=-1.65,其反對數是1/45即50%血清中和終點為1:45 含義：1:45稀釋度的恢復期血清可保護50%細胞不產生細胞病變效應。第六十二張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月二、血凝/血抑血凝 HA第六十三張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月血凝抑制 HI第六十四張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

24、12血凝試驗 HA試驗方法選擇96孔板（V型）病毒液倍比稀釋稀釋好后加雞紅細胞混勻后20室溫靜置30min+50l PBS吸出一半1:21:221:231:24+100l 病毒液+50l 雞紅細胞吸棄一半第六十五張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月血凝試驗 HA血凝滴度：以出現+的稀釋度的倒數為判定終點,為1個血凝單位。 凝集效價：能使血球產生+凝集的病毒最高稀釋度為病毒的凝集效價，即0.5ml病毒液含1個血凝單位。第六十六張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月三、補體結合試驗補體：正常人和動物血清與組織液中的一組經活化后具有酶活性的蛋白質，輔助抗體介導免疫溶菌和溶血作用。對熱不穩定

25、。 綿羊紅細胞與抗綿羊紅細胞抗體（溶血素）作用形成溶血素致敏的綿羊紅細胞。補體可使這種致敏紅細胞溶解。補體可結合任何病毒抗原抗體復合物第六十七張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月三、補體結合試驗如果反應系統中存在待測的抗體（或抗原），則抗原抗體發生反應后可結合補體；再加入指示系統時，而不出現溶血，是為補體結合試驗陽性。如果反應系統中不存在的待檢的抗體（或抗原），則在液體中仍有游離的補體存在，當加入指示系統時會出現溶血，是為補體結合試驗陰性。第六十八張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月三、補體結合試驗有3個系統：反應系統，即已知的抗原（或抗體）與待測的抗體（或抗原）；補體系統；指示系

26、統，即SRBC與相應溶血素，形成致敏紅細胞。第六十九張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月三、補體結合試驗病毒抗原從組織培養、雞胚和動物試驗中獲得病毒抗原應適當提純，純度愈高，特異性愈強如使用粗制抗原時，須經同樣處理的正常組織作抗原對照，以識別待檢血清中可能存在的、對正常組織成分的非特異性反應第七十張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月三、補體結合試驗抗體免疫用的病毒抗原最好不是同一細胞或動物，以免發生交叉反應血清樣品應加熱滅活處理，消除補體活性和非特異性抗補體活性人和豚鼠滅活溫度為56；家兔和馬滅活溫度為65第七十一張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月三、補體結合試驗補體檢測人

27、和哺乳動物血清應用豚鼠新鮮血清補體臨用前使用1SRBC制備綿羊頸靜脈采血，生理鹽水洗滌溶血素用綿羊紅細胞免疫家兔獲得效價達到1:4000可獲得5630分鐘滅活，加甘油后長期保存稀釋液含鈣鎂離子的生理鹽水，可維持補體的穩定第七十二張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月三、補體結合試驗溶血素的滴定先將溶血素稀釋成1:1001:1000,再依次加入溶血素0.1ml，鈣鎂鹽水0.2ml，1:60補體0.2ml、1綿羊紅細胞0.1ml，混勻后再水浴結果判定：完全溶血的試管液體紅色透明，離心后見少許細胞;不溶血的試管液體混濁，放置后見紅細胞沉淀，上清無色透明溶血素效價的測定;以完全溶血的最高稀釋倍數確定為1個單位本例1個單位的溶血素的效價為1：4000；正式使用2個單位第七十三張，PPT共七十九頁，創作于2022年6月三、補體結合試驗補體的滴定補體不穩定，每次試驗前需滴定管號1：60補體鈣鎂鹽水（ml)2U抗原(ml)1致敏SRBC(ml)結果10.040.260.10.2不溶20.060.240.10.2不溶30.080.220.10.2微溶40.100.200.10.2微溶5