1、細胞免疫熒光步驟方法一：1首先需要把細胞養在玻璃片上（懸浮細胞需要用多聚賴氨酸包 被過的玻璃片）然后在4%PFA里面室溫下固定30分鐘，PBS洗兩次，0.1% TX100室溫下作用1 2分鐘使細胞膜通透。接下來進行熒光標記，需要在一個大的容器（面積大，扁平狀的，比如大的培養皿）里面，放一張用水打濕的濾紙，以保持濕度。4 剪一片合適大小的para film,在上面滴上稀釋在1%BSA/TB. S中的一抗（稀釋倍數依具體抗體而定），每個玻璃片3 0ul 足夠，把玻璃片蓋在上面（細胞面朝下），室溫下孵育3 0分鐘， 然后在PBS里洗三次。5.接下來二抗孵育步驟同上。6 最后，在載玻片加上mounti

2、ng medium（大約每個玻璃片加10u. 1）,把玻璃片放上去（細胞面朝下），37度30分鐘，然后就 可以在熒光顯微鏡下觀察了。7.抗體很重要，不能有非特異性結合。你可以先做WB檢測一下 你的抗體，看看有沒有雜帶。8 雙標的話，可以把兩個一抗一起加或者分別標記兩次（可以都試一下看看那種方法合適）。如果一個抗體需要二抗，一個是 直接熒光標記的，可以把熒光標記的那個和另外一個的二抗一 起加。方法二：1選取一抗時要來源于兩種不同的動物，我用的是來源于rabb it和rat的抗體,二抗則是不同熒光信號標記 的，我用的是donkey anti rabbi tFITC （綠）和 do n key an

3、ti- r at- Tex Red （紅）。我的做法是兩種一抗同時孵育，然后兩種二抗同時孵育.抗體濃 度、孵育時間要仔細摸索，我感覺一抗4度孵育過 夜比較好， 背景比較清晰。我的陽性對照用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和 大鼠的IgG,熒光標記物對照是PBS+熒光標記物。封閉血清與二抗來源動物一致，我用的是10%的正常donkey 血清.其余步驟同一般免疫熒光單標操作.方法三：1.片子的制作：可以做細胞爬片，細胞甩片，還有直接在2 4 wel1 /12well/ 9 6w e ll中直接染色2細胞爬片的制作：直接購買公司的已經處理過的細胞爬片，要 是自己制作的話，就用無菌的蓋玻片用多聚

4、賴氨酸處理后讓 細胞自己爬片細胞甩片:需要甩片機將細胞懸液均勻甩到玻片上。其實小的we 1 l的話，可以直接拿來染色，沒問題的。5固定:用PBS洗去培養液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲 醛;酒精.。）固定細胞。&內源性過氧化物酶處理，3%過氧化氫處理細胞（選作，二抗連 HRP得必做，其他的如做免疫熒光染色不用做）.7通透（胞漿蛋白和細胞核蛋白需要做;細胞膜蛋白不需要做），一 般選用TritonX10。來做細胞通透，濃度和時間需要摸索， 一般是0。15%，處理時間為1-30分鐘，級個別需要到1 2 小時。8.封閉:洗去通透液，用二抗同源的血清約10%的濃度in PBS 中封閉半小時，也可以

5、選用510%脫脂奶粉。封閉結束后 千萬不要洗,直接上一抗。9 一抗：具體你想做什么樣的蛋白，咨詢抗體公司如Santa cru .ze,Abc am,s igma.o.選取具體的抗體，但是一抗的稀釋濃 度也是要摸索，抗體稀釋液可以購買抗體公司現成的，對于 新手還是挺好的。時間一般是4度過夜或者37度1小時。一 抗最好還是選用外國抗體公司的抗體。感謝聆聽10.洗去一抗。11上二抗,二抗一般抗體公司會給你推薦的，你在其中選上一個 就行了，自己選國產的也行,就是選在哪個動物體內做的一抗, 二抗就選抗那個動物的就行了。二抗的濃度也是需要摸索的， 抗體稀釋液和一抗相同就行了。二抗的時間一般是37度半小 時

6、。12底物顯色(選作，二抗連得是酶的必做，按試劑盒的說明書 添加就行了，顯色時間可能需要摸索，以免顯色過度引起假 陽性；二抗連得是熒光報告的不用做)洗去二抗，染核DAP I 或者 Hoechst 染核洗去染核液，加PBS,上鏡觀察。方法四：細胞準備。對單層生長細胞，在傳代培養時,將細胞接種到預先放 置有處理過的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長成單層后取出 蓋玻片,PBS洗兩次;對懸浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS 離心洗滌(1 0 0 0rpm,5min) 2次，用細胞離心甩片機制備細胞 片或直接制備細胞涂片。感謝聆聽(2)固定。根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢后的細 胞可置于含疊

7、氮納的PBS中4C保存3個月。PBS洗滌3X5 min。 通透。使用交聯劑(如多聚甲醛)固定后的細胞，一般需要在加入 抗體孵育前,對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部 位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質.通透的時間一般在 5-1 5 min。通透后用PBS洗滌3X5 min。 封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min。一抗結合。室溫孵育1h或者4C過夜。PBST漂洗3次，每次 沖洗5min.(6)二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h。PB ST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次.封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。方法五：1.

8、漂洗血清蛋白PH7。2-7.4,37度 PBS 2小時.2： 20度甲醇固定2 0分鐘后，自然、干燥10分鐘PBS 洗凈：3 min*31%Tr iton: 25min30min。配成 50ult r iton+ 5 ml p BS5 . PBS 洗凈：2* 5 min6.羊血清封閉：37度,20分鐘7 . 一抗，4度過夜，一般要大于18小時或者3 7度1-2小時4度 PBS 洗凈，3min*5 次二抗37度小于一小時37 度 PBS 洗凈,3*3min 涼干封片（封閉液PH8O5）細胞免疫熒光步驟：1.細胞爬片；首先是玻片的處理，普通的蓋玻片用砂輪劃成自己 要的大小的小方塊，先用洗衣粉洗干凈

9、，用水沖靜烤干，然后泡 酸過夜，撈酸后流水洗凈，烤干，置于器皿中高壓滅菌，然后再 烤箱中大約8小時烤干備用。爬片可以在培養皿 六孔板或24孔板中都可，我選擇在培養皿 中爬。一為節約經費（培養皿可以重復利用）二來覺得培養皿口 大，操作比較方便。培養皿消毒同上，消毒時記得消兩把鑷子 具體操作是：用胰酶消化好細胞，充分吹打，使之成單細胞懸液 （注意：這一點很重要，關系到將來爬出來片子的質量）取出消毒的培養皿，可以先加少量培養基（以使玻片與培養皿緊 密接觸），將玻片小心放入擺放其中,然后將單細胞懸液一滴一滴 的滴到玻片上.最后蓋上培養皿置于37度5%CO2的暖箱中培養, 根據細胞生長狀況,2 4小時或

10、更長時間適時取出爬片。爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒鐘,然后在4%多聚甲 醛中固定15分鐘，然后再用37度去離子水將甲醛沖干凈，注意 手法輕柔，要不然掉片彳艮厲害。同時操作過程中注意玻片的正反 面，要不然真的是前功盡棄。將做好的爬片置于濾紙上晾干，然后用中性樹膠粘在載玻片上。 注意一定要等中性樹膠徹底干了之后才能做后續實驗，要不然玻 片會掉下來的，就又是前功盡棄了 做好的細胞爬片可以放在 -20保存備用，具體能保存多長時間不太清楚，當然盡量早用。2.4%多聚甲醛固定10min （固定細胞器用預冷的70%甲醇+ 3 0% 丙酮）；PBS 漂洗 5min；0.5% Triton穿孔15

11、min （丙酮固定法不用透化處理）；PBS漂洗2次，每次5m in;1%BSA封閉 3 0min;7 .加入1 %BSA稀釋的一抗，于37C雜交2h；PBS漂洗2次，每次5m i n；加入1 %BSA稀釋的二抗，于37C雜交1h;PB S漂洗2次，每次5min；1 1. 5ug/ml DAPI 染色 2min;12。抗淬滅封片劑封片。抗淬滅封片劑：2.5% DABCO （w/v）0mM Tris（pH8。0）90%甘油細胞免疫熒光細胞爬片4%多聚甲醛固定10min（固定細胞器用預冷的70%甲醇+3 0%丙酮）PB S 漂洗 5min0.5% T riton 穿孔 15min（丙酮固定法不用透化處理PBS漂洗2次，每次5min1%BSA 封閉 30min加入1 %BSA稀釋的一抗，于3 7C雜交2hPBS漂洗2次，每次5min加入1 %BSA稀釋的二抗,于