1、第12章納米生物醫學傳感原理與應用12.1 引言納米技術（nanotechnology or nanotechnique）包括納米材料、納米器件、納米結構設計和加工組裝、納米機器以及相應的檢測表征技術和方法，因此“納米”（nano-）不僅僅局限于狹義的空間尺度上的意義，而是一種全新的思維方式和認識方法、研究手段和應用技術。生命過程動態生化信息的獲取與解析，是認識生命現象和規律（包括生理、病理、藥理等）以及疾病診斷和預后等的基礎。由于生命過程研究的特殊性，需要發展能適應生物活體微區、原位、實空分辨、動態、超靈敏（單分子）分析的新原理和新方法。納米科技的興起為更好地獲取生化信息特別是動態過程生化信

2、息展露出誘人的發展前景。利用納米粒子尺寸遠遠小于組成生命體的基本構造單元細胞的特點，借助納米粒子標記的生物探針并結合其它示蹤技術如熒光標記技術或酶標技術等，可望將研究的“觸角”深入小到細胞甚至亞細胞層次，實現原位、實時、高選擇性研究單個細胞生命過程的目的，為生命過程研究和重大疾病早期診斷提供適用的新方法。納米材料和技術應用于生物傳感和醫學檢測與診斷領域，盡管才十來年的歷史，但已取得了許多令人鼓舞的成就。隨著掃描探針顯微鏡（Scanning Probe Microscope, SPM），如掃描隧道顯微鏡（Scanning Tunneling Microscope, STM）、原子力顯微鏡（Ato

3、mic force Microscope, AFM）、掃描近場光學顯微鏡（Scanning near-field optic microscope, SNOM）等一系列高新科技儀器方法的應用，使得采用納米技術的納米生物醫學傳感技術近年來發展非常迅速，人們在納米尺度甚至單細胞內單分子水平上獲取生命過程生物化學信息已成現實。納米生物醫學傳感技術已成為納米科技領域最引人注目的、最有生命力的發展方向之一。12.2 生物傳感原理與器件 生物傳感原理生物化學傳感技術是生物醫學領域中主要的分析檢測技術之一，是利用生物分子極強的特異性識別的原理進行生物組分（包括核酸、蛋白質、酶、糖類、各種生物活性小分子、甚至

4、細胞、組織等）以及能被生物組分識別的無機物的檢測分析的技術?；谏锓肿幼R別原理所設計制作的檢測器件即生物傳感器，是能選擇性、連續可逆感受并傳遞、處理生物化學信息的系統裝置。例如，葡萄糖傳感器便是利用葡萄糖氧化酶（GOD）能從含有多種糖分子的混合溶液中，高選擇性地識別出其中的葡萄糖分子并將其氧化成葡萄糖酸內酯，其識別反應信息通過換能器轉換成可測量的物理信號而進行分析檢測。 生物傳感器基本構成傳統的生物傳感器一般由感受器（Receptor）、換能器 (Transducer) 和檢測器 (Detector)三部分組成。圖12-1給出電化學生物傳感器的示意圖。試 樣(生物分子識別組分)感受器生化信息

5、換能器(電極)電信號（電流、電勢、電導）導）檢 測 器處理結果顯示圖12-1 電化學生物傳感器示意圖1感受器，又稱敏感器或分子識別元件，其主要功能是進行生物化學分子識別。分子識別（Molecular recognition）基于分子間的特異相互作用，其作用力主要有氫鍵、靜電、疏水等類型。分子識別過程有時僅借助一種作用力，有時是多種作用力協同作用的綜合結果，往往具有很高的選擇性，猶如鑰匙與鎖的匹配關系。具有分子識別功能的生物組分構成感受器的核心或關鍵部分，通常要求其具有很高的靈敏度和選擇性。常見的生物功能組分有生物酶、組織、抗原、抗體、結合蛋白質、植物凝血素、激素受體、微生物和DNA等。表12-

6、1列舉了常用的幾種生物分子識別物質。表12-1 幾種常用的生物分子識別物質1分子識別元件生物活性材料酶膜全細胞膜組織膜細胞器膜免疫功能膜DNA探針各種酶類細菌，真菌，動植物細胞動植物組織切片線粒體，葉綠體抗體，抗原，酶標抗原等特定基因或其部分序列2換能器的主要功能是將感受器感受到的生物化學信息轉換成易檢測的物理化學信號，如光、電、磁、熱和濃度等。表12-2列舉了一些生物化學信息所需對應選擇的換能器的種類。值得一提的是納米技術給生物傳感器分子識別信息的高效轉換檢測開辟了新的發展空間。許多基于納米放大技術的生物傳感器已見報道2-8，相關內容隨后將作進一步的介紹。表12-2 生物化學信息和換能器的選

7、擇1生化信息換能器的選擇離子活度變化質子活度變化氣體分壓變化熱效應光效應色效應質量變化電荷密度變化溶液密度變化離子選擇性電極，阻抗計離子選擇性電極，場效應晶體管氣敏電極，場效應晶體管熱敏元件光纖、光敏管、熒光計光纖、光敏管壓電元件阻抗針、導納、場效應晶體管表面等離子共振3檢測器，將得到的物理化學信號進行檢測、記錄處理和顯示結果?？傊?，生物傳感器就是利用生物功能組分與被測物特異性結合所給出的生物化學信息，通過換能器轉換并由檢測器處理和顯示，來對被測物進行分析檢測。傳感器的性能主要取決于感受器的選擇性、可逆性、穩定性，換能器的靈敏度以及響應時間，檢測器的信號采集、處理能力等。 生物傳感器分類生物傳

8、感器的種類有很多，分類方法也各不相同1。若按生物分子識別組分的不同可分為：酶傳感器、組織傳感器、免疫傳感器、微生物傳感器、基因傳感器等等。酶傳感器：其原理是利用酶在生化反應中特殊的催化作用，將糖類、醇類和有機酸類等迅速氧化或分解，所產生的變化轉換成光、電等信號，進行檢測分析。各種酶傳感器已達幾十種。表12-3列舉出其中的幾種。表12-3 幾種酶傳感器測定對象酶檢測電極葡萄糖尿素尿酸乳酸膽固醇中性脂質青霉素苦杏仁苷硝基化合物亞硝基化合物葡萄糖氧化酶尿酶尿酸酶乳酸氧化酶膽固醇氧化酶蛋白脂酶青霉素酶苦杏仁苷酶硝基還原酶-亞硝基還原酶亞硝基還原酶O2, H2O2, I2, pHNH3, CO2, pH

9、O2O2O2, H2O2pHpHCN-NH+4NH3組織傳感器：它直接利用天然動植物組織和器官中的酶，本質上也是酶傳感器。這些酶處于組織器官的天然環境中，非常穩定。所制備傳感器不僅取材容易，價格低廉，而且穩定性好，使用壽命更長。表12-4中列舉出幾種組織傳感器。表12-4 幾種組織傳感器9測定對象組織檢測電極谷氨酰胺腺苷AMP鳥嘌呤過氧化氫谷氨酸多巴胺丙酮酸尿素尿酸磷酸根/氟根酷氨酸半胱氨酸豬腎鼠小腸粘膜細胞兔肉兔肝，鼠腦牛肝，萵苣子，土豆黃瓜香焦，雞腎稻谷杰克豆，大豆魚肝土豆/葡萄糖氧化酶甜菜黃瓜葉NH3NH3NH3NH3O2CO2NH3CO2NH3，CO2NH3O2O2NH3微生物傳感器：

10、它們可分為兩種類型：一是利用微生物所含酶的催化作用，稱為酶源型；另一類是利用好氧微生物在同化底物時的耗氧呼吸作用，稱為呼吸型。表12-5列舉出幾種微生物傳感器。免疫傳感器：它利用抗原-抗體之間的高選擇性分子識別進行抗體或抗原分析。例如人絨毛膜促性腺激素（HCG）傳感器、-甲胎蛋白（AFP）免疫傳感器等?；騻鞲衅鳎菏且环N常用的DNA檢測技術，其工作原理很簡單：將單鏈DNA（ssDNA）探針固定在載體表面，基于DNA的堿基配對原理與互補的靶序列雜交，再利用各種換能器放大雜交信號進行基因的檢測分析10。若按換能方式，生物傳感器主要可分為電化學生物傳感器（Electrochmical biosens

11、or）、光學生物傳感器(Optical biosensor)、熱生物傳感器（Thermal biosensor）、壓電生物傳感器（Piezoelectric biosensor）等幾大類。電化學生物傳感器建立在電化學與電測量技術基礎之上，并將生物化學信息以電勢、電流和電導等電學參量表達出來，主要有電位型和電流型；光學生物傳感器則是建立在光譜化學與光學測量技術基礎之上，并將生物化學信息以光強或特征光譜表達出來；熱生物傳感器基于生物化學反應所伴隨的熱效應的測量；壓電生物傳感器則基于壓電晶體振蕩頻率隨分子識別過程的質量變化而改變的原理進行傳感。表12-5 幾種微生物傳感器9測定對象微生物檢測電極葡萄

12、糖同化糖乙酸氨甲醇制霉菌素變異原亞硝酸鹽維生素B12甲烷BOD維生素B1甲酸頭孢菌素煙酸谷氨酸賴氨酸尿酸L-天冬氨酸熒光假單胞菌乳酸發酵短桿菌蕓苔絲孢酵母硝化菌未鑒定菌蕓苔絲孢酵母枯草桿菌硝化桿菌大腸桿菌鞭毛甲基單胞菌絲孢酵母，地衣芽孢桿菌發酵乳桿菌酪酸梭菌費氏檸檬酸細菌阿拉伯糖乳桿菌大腸桿菌大腸桿菌芽孢桿菌大腸桿菌O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2O2燃料電池燃料電池pHpHCO2CO2O2NH3若按生物分子識別組分與被測物的結合性質，生物傳感器又可分為催化型生物傳感器和親和型生物傳感器兩大類9。前者利用酶的選擇性和催化性，如酶傳感器，組織傳感器，微生物傳感器等，它檢測的是整個反應動力

13、學的總效應；后者則利用分子間的特異親和性，如免疫傳感器，受體傳感器，基因傳感器等，它檢測的是反應熱力學平衡的結果。催化型生物傳感器是生物傳感器早期發展的切入點，而親和型生物傳感器則是生物傳感器今后的發展方向。不同的生物識別組分與不同的換能器組合，則構成不同類型的生物傳感器。12.2.4 生物傳感器的特點生物傳感器具有選擇性強、靈敏度高、分析檢測速度快、儀器設備簡單、操作使用方便、費用低廉等主要特點，因而廣泛應用于生物化學分析、醫學檢測與診斷、司法醫學，以及環境監測、衛生監督、生物醫藥和食品質量檢驗與控制、生產在線監控等許多領域。主要分析對象包括糖類、有機酸、氨基酸、核酸、蛋白質、抗原、抗體、激

14、素、細胞、細菌、病毒、毒素以及環境污染物質等。其不足之處表現在重現性和穩定性較差，特別是長期存放的穩定性是使用中所面臨的主要問題。 分子識別組分固定化方法固定化是指將分子識別組分通過吸附、鍵合等方法固定在換能器表面，并保持其生物活性和穩定性，其主要目的是使分子識別組分在保持其生物功能的前提下，與換能器組裝成傳感器的探頭。分子識別組分的固定化方法較多，主要有如下幾種11：(1) 共價鍵合法生物分子識別組分與換能器（如電極）表面通過化學鍵結合而固定化。共價鍵合法一般分兩步進行。第一步是換能器表面的活化預處理，以引入活性鍵合基團；第二步是進行表面化學連接，通過共價鍵合反應把經過修飾的分子識別組分固定

15、到換能器表面。有時，根據具體情況還需采用逐步反應方法將換能器表面的鍵合位點延伸，然后再將識別組分共價固定。圖12-2給出一種共價鍵合固定方法的實例。圖12-2 DNA探針在換能器表面的一種共價鍵合固定化方法一般來說，共價鍵合固定化方法得到的分子識別敏感層較穩定，傳感器使用壽命較長、重現性較好。缺點是，一些活化劑、交聯劑往往難于得到，價格昂貴。另外，表面鍵合反應的產率有時較低，得到的分子識別敏感層的覆蓋度較小，降低傳感器的靈敏度。(2) 吸附法將分子識別組分吸附在換能器或修飾過的換能器表面；或者先吸附在分子篩等無機載體材料上，再固定到換能器表面。吸附法操作簡單、方便，但活性組分常常易因吸附不牢固

16、而在使用中流失，導致傳感器的穩定性、重現性較差。在某些情況下，生物組分的活性會因吸附變性而喪失。(3) 包埋法將分子識別組分包埋在高分子材料中，制備成敏感膜，再與換能器結合。包埋法得到的分子識別敏感層的微觀結構往往難于控制，導致不同批次傳感器的一致性較差，由于敏感膜一般較厚，致使傳感器的響應時間較長。但包埋法簡便易行，生物分子識別組分的活性往往能得到很好的保持。(4) 自組裝法基于分子自組作用，在換能器表面自然形成高度有序單分子層的方法稱為自組裝法（SAM法）。SAM 法制備分子識別敏感層時多利用巰基衍生的生物活性分子，通過其巰基與金表面的強烈相互作用而固定在以金為基底的換能器表面。圖12-3

17、 給出自組裝法制備DNA敏感層的實例。Bard等12,13通過-SH在金表面的自組裝和有序地吸附、反應(圖12-3a)，制備出一層有序的直鏈烷基雙膦酸鋁膜，膜中含有金屬中心離子Al3+，能與帶負電的DNA鏈產生很強的靜電相互作用，從而將單鏈DNA（ssDNA）或雙鏈DNA（dsDNA）固定于電極表面，得到DNA傳感器(圖12-3b)。圖12-3 自組裝法制備DNA傳感器SAM法得到的分子識別敏感層的表面結構高度有序、可控，有利于識別分子生物活性的保持。但巰基衍生的生物活性分子的制備較難，另外，巰基的長期存放穩定性不是太好，致使傳感器的性能在使用中會有所下降?？傊?，上述不同固定化方法各有其優缺點

18、，使用時應視不同的具體情況而定。采用不同固定化方法得到的分子識別敏感層/換能器界面，將直接影響生物傳感器的性能與使用壽命。固定化技術作為生物傳感器設計與制作中最關鍵的技術之一應予以足夠重視。 基因檢測原理與標記方法1990年10月1日，美國向全世界宣布開始實施人類基因組計劃（Human Genome Project, HGP），旨在發現人類所有的全部基因及其堿基對序列，以及它們在染色體上的確切位置、結構、表達調控方式以及變異，最終完全破譯人類全部的遺傳密碼信息。這是繼“曼哈頓”原子能計劃和“阿波羅（Apollo）”登月計劃之后，人類歷史上的又一宏偉科學工程和歷史壯舉14。經過短短10年的卓越努

19、力，提前5年基本完成原定于2005年10月完成的工作，并于2000年6月26日由美、日、英、法、德和我國科學家聯合向全世界公布了人類基因組工作草圖。人類基因組大約由3109個脫氧核苷酸對（堿基對）組成，其中約有2%的DNA為基因編碼序列，共編碼約46萬個基因。人類基因遺傳密碼的基本破譯，使人類第一次在分子水平上對自我有了進一步深入的認識，為揭開人類自身的生、老、病、死奧秘奠定了基礎，并為在基因水平上診斷、治療和預防疾病，有效延長人類壽命和提高生活質量創造了條件。繪制人類基因組工作草圖是一項十分復雜的系統工程，成千上萬具有不同學科背景的科學家參與了這一偉大工程?；驕y序，毫無疑問離不開基因檢測技

20、術，包括相應的標記技術。下面將對基因檢測原理與標記方法作一簡要介紹。1. 基因檢測原理1953年Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結構模型，即DNA分子是由腺嘌呤核苷酸（A）、鳥嘌呤核苷酸（G）、胞嘧啶核苷酸（C）和胸腺嘧啶核苷酸（T）四種核苷酸按一定的順序排列而成，呈雙螺旋結構（如圖12-4 (a) 所示）。通常，一段含特定遺傳信息的DNA序列稱為基因?；騻鬟f著支配生命活動的指令，一切生命活動（繁衍、進化、死亡等）均直接或間接地在基因控制之下。因此，研究各種生命現象的底蘊和機制時必然要在基因這一層次上尋找其原因，基因研究已融入生命科學的每一個分支學科，成為現代生命科學研究的核心內容

21、。因此，基因檢測也成為生物醫學傳感技術領域的重要研究內容?；驒z測一般采用直接測序或雜交檢測。直接測序采用在分子生物學中廣泛使用的Sanger發明的雙脫氧鏈終止法，其可靠性非常高，但較繁瑣或設備昂貴。對于一般的基因檢測來說，雜交法簡單、方便，也可達到相應的要求，基因傳感器（或DNA傳感器）即是基于雜交法。盡管基因雜交檢測的具體方式不盡相同，但其基本原理是相同的，即堿基配對（互補）原理，即AT，CG配對結合, 如圖12-4(b)所示。雜交時，探針與靶序列之間通過Waston-Crick氫鍵形成雙螺旋結構，由于這種雙螺旋結構的形成（分子識別）具有極高的選擇性，因此探針DNA能在含有多種非互補序列的

22、混合物中識別出靶序列。大溝小溝10343.4HOC在磷酸酯鍵中C和N在堿基中PCC、N還原部位氧化部位圖12-4 （a） DNA雙螺旋結構 （b） 堿基配對（互補）根據檢測核酸的種類和手段不同，核酸分子雜交檢測可分為原位雜交（In situ hybridiztion）、斑點雜交（Dot hybridiztion）、Southerm雜交、Northerm雜交15等方法。根據反應介質差別又可分為：待測核酸序列與探針均游離在溶液中進行的液（均）相雜交和將待測核酸序列結合到固相載體上與游離在溶液中的探針分子進行雜交的固相（多相）雜交。 基因傳感器一般采用固定核酸探針檢測溶液中游離的待測核酸序列的固相雜

23、交方法。順便提一下，除核酸分子的雜交外，還有以抗原抗體、受體配體特異性結合反應為特征的Western雜交。目前，在基因傳感器中，所謂的“三明治型（夾心式）”雜交檢測的模式得到較普遍應用。具體做法是，將序列A（稱為捕獲探針）固定到換能器表面后，利用與B序列（待測序列）一端互補的探針序列C（稱為檢測探針）進行檢測。圖12-5 “三明治型（夾心式）”雜交檢測基于雜交原理的基因堿基錯配、基因缺失、變異等的檢測在遺傳學、免疫學、醫學生理學、病理學和藥理學等生物醫學領域具有重要的意義。2基因檢測的標記方法標記技術是將生物分子識別信息轉換為潛在可測信號的技術，是生物醫學傳感技術中常用的重要支撐技術。由于生物

24、分子特異性結合（識別）時，所產生的信號通常很微弱，因此需要用一些活性物質（稱為標記物）來標記，以使信號放大，提高檢測靈敏度，使待測物在很低的濃度下也能檢測出來。生物學上早期的基因檢測標記方法是放射法。標記物按其是否具有放射性可分為：放射性標記物與非放射性標記物兩大類。前者主要有：32P、33P、35S、3H、131I、135I、14C等；后者主要有：熒光素、生物素、酶、地高辛、銪離子、聯吡啶合釕、二茂鐵等。放射性標記法的主要特點是：檢測靈敏度高，可檢測到10-14g10-18g被測物，常用來跟蹤雜交過程。其主要缺點是有放射性，對生物體系有損害，并造成環境污染。因而正逐漸被非放射性標記法所取代。

25、非放射性標記法是近年來迅速發展的一類標記方法，主要包括發光標記法、酶標記法和電活性物種標記法等幾種。通?；騻鞲衅鞑捎玫臉擞浄椒榉欠派浞?。(1) 電活性物種標記法電活性物種標記法是電化學基因傳感技術中常用方法。由于雜交過程的物理化學信號很弱，通常需要加入合適的雜交指示劑，進行信號的轉換和放大，以便分析檢測。電活性雜交指示劑（Hybridiazation indicator）是一類能與單鏈DNA和雙鏈DNA以不同方式相互結合的化合物。雜交指示劑與DNA分子的非共價結合主要有三種基本模式16： = 1 * GB3 靜電結合，即電活性雜交指示劑通過非特異性的相互作用結合于帶負電荷的DNA鏈的外部。

26、 = 2 * GB3 嵌插結合，即在堿基對之間嵌入平面的或幾乎平面的電活性的芳香環系統。嵌插結合的作用力來自芳環的離域體系與堿基的體系間的-相互作用及疏水相互作用。而對于一些含有龐大取代基的分子，如吡啶環取代的卟啉分子在與DNA作用時，吡啶環取代基會盡量旋轉以保持與母環的共平面，從而形成良好的堆積形狀與DNA堿基嵌合。 = 3 * GB3 溝結合，即電活性雜交指示劑與DNA的大溝或小溝的堿基對邊緣直接發生相互作用。在雜交指示劑的供體基團與小溝中A的N3或T的O2這些受體間常常有氫鍵形成。除了利用非共價結合的電活性雜交指示劑轉換DNA分子雜交識別信息外，在電化學基因傳感器中，還常常采用電活性基團

27、共價鍵合標記靶序列，或者引入另一標記有電活性基團（如二茂鐵）的檢測探針并采用“夾心式”檢測模式來轉換分子雜交信息，從而檢測靶基因（靶序列）。圖12-6是二茂鐵標記的檢測探針“夾心”法檢測模式的示意圖17。采用電活性雜交指示劑標記，其操作較簡便，但靈敏度一般較低。電活性基團共價鍵合標記的靈敏度較高，但是，其探針難于合成，費用昂貴。電極表面捕獲探針靶基因檢測探針圖12-6 采用電活性基團共價鍵合標記探針的“夾心式”檢測模式(2) 發光標記法發光標記法主要包括熒光標記、化學發光標記、生物發光標記、電致化學發光標記等。常用的發光標記物和標記法如表12-6所列。表12-6 幾種發光標記物18標記物檢測限

28、(amol)檢測方法標記物檢測限(amol)檢測方法FluoresceinCoumarinPhycoerythrinEuropium chelatePhthalocyanine compounds(PB630、PB670、PB710)CdSe/ZnS0.10.010.040.0010.10.0010.010.0010.01FFFFFFAcridinium esterAcridinium ThioesterPhenanthridinium esterLucifirinAlkaline phosphatase-d-Galacto-sidase0.030.0030.010.0010.000010.0

29、002CLCLCLBLBLBL注：F：熒光法；CL：化學發光法；BL：生物發光法。雖然發光標記生物傳感器的靈敏度較高，但是選擇性、穩定性和重現性較差，探針或靶序列標記反應較復雜費時，價格也很昂貴。(3) 酶標記法一般是將酶標記在靶DNA上，直接通過與換能器表面的捕獲探針雜交檢測；也可用酶標記檢測探針，采用“夾心式”雜交模式檢測（如圖12-5）。Zhou等19將光纖末端用氨基硅烷化試劑處理后，利用戊二醛交聯固定NH2-ssDNA；氨基衍生的靶序列也通過戊二醛交聯而標記上辣根過氧化物酶(HRP)，HRP催化H2O2-魯米諾體系發光而進行檢測。Peltier等20制備了一種夾心式酶標化學發光基因傳感

30、器。固定序列通過一端連有的毛地黃素而固定在吸附了抗毛地黃素的載體上，探針序列的一端則連有生物素，可結合堿性磷酸酶AP標記的抗生物素蛋白，AP可催化5-(2,4-二氟苯基)水楊酸磷酸酯水解產生5-(2,4-二氟苯基)水楊酸，再與Tb3+-EDTA形成三元熒光化合物。此法也可將生物素/抗生物素蛋白用于固定寡聚核苷酸，毛地黃素/抗毛地黃素用于連接探針序列與AP。Ma等21通過HS-ssDNA在Au表面形成自組裝膜而將探針固定，與生物素修飾的靶序列雜交后，通過生物素結合AP標記的抗生物素蛋白，3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷酰氧基)苯基-1,2-氧雜環丁烷（AMPPD）是AP的直接化學

31、發光底物，AP可以切割AMPPD的磷酸基團使AMPPD分解發光從而進行檢測。聚丙烯酰胺（PAA）-聚1-乙烯基咪唑（PVI）-鋨（Os）聚合膜具有電化學活性，Heller等22,23先在玻碳電極上電沉積一層PAA-PVI-Os氧化還原膜，其中部分丙烯酰胺已經預先轉化成丙烯酰肼，單鏈寡聚核苷酸5端的磷酸基團與水溶性碳二亞胺（EDC）反應活化后通過電泳接近電極表面，與電極上氧化-還原膜的酰肼的NH2反應而固定在膜上。靶ssDNA一端標記有辣根過氧化物酶（HRP）或大豆過氧化物酶（SBP），HRP和SBP均可催化H2O2的還原，探針與靶序列雜交后，通過H2O2還原電流檢測靶序列。氧化還原膜充當電子中

32、繼體，酶活性中心與聚合膜上能隨意移動的含Os(I/II)的支鏈發生碰撞而傳遞電子。此種傳感器可分辨出18個堿基中含一個錯配堿基的寡聚核苷酸?？梢姡笜擞浖夹g總是與催化發光、催化電化學檢測、催化顯色等方法耦合聯用，達到高靈敏度檢測基因的目的。由于可很方便地增大催化反應的底物濃度，所以檢測靈敏度可大幅度地提高。應該指出，選擇何種標記物和標記方法需要綜合考慮檢測的目的與要求、特異性、靈敏度、標記和檢測的難易程度等多種因素。理想的標記方法不會改變探針分子的理化特性，不影響探針分子與靶分子的特異結合，同時檢測方法要靈敏、特異和簡便。12.3 納米技術與生物傳感在生物醫學領域，常常要求進行實時（Real

33、time）、動態（Dynamic）、活體（In vivo）和原位(In situ)分析檢測，而傳統的生物傳感技術受到一定的局限。隨著現代電子技術、生物技術、特別是納米技術的迅速發展，生物醫學傳感技術領域也日新月異，相繼涌現出如納米生物傳感器、納米生物探針、生物芯片等許多新的技術和方法。納米材料和技術的引入，為研制靈敏度高、選擇性好、使用壽命長、尺寸小的生物傳感器件創造了新的機遇。例如，利用納米粒的小尺寸可制備納米生物探針及器件，實時、動態探測單細胞中單分子的運動規律及生化反應性能。利用半導體納米晶粒的量子尺寸效應和表面效應制備的量子點可作為新型的熒光標記物，用于生物醫學分析。利用納米粒子的表面

34、效應可對DNA雜交信息進行放大，制備出目視化基因診斷芯片。采用納米結構設計與加工技術可研制出微米級甚至納米級、具有多功能的仿生傳感系統。顯然，納米技術在生物醫學傳感技術領域的應用前景是毋庸置疑的。納米標記和放大技術應用于單分子、單細胞原位、實時、動態分析將是最具吸引力和發展潛力的前沿領域。生物醫學納米技術不僅可為基礎生物學和基礎醫學研究提供新手段，而且還將在疾病早期診斷研究中發揮巨大作用。這是一個令人神往的嶄新領域。1 相關納米粒合成與制備ZnSCdSe用于生物傳感器的納米材料主要是納米粒（簡稱納粒）24。它們大體可分為3種類型：單一納粒溶膠，如金、銀、鉑、二氧化硅、二氧化鈦等納粒溶膠；復合納

35、米粒, 它們由單一納粒溶膠復（混）合而成，如Au-Ag、Au-SiO2、Pt-SiO2等；核/殼型結構（Core-shell type）納粒，其特點是多層復合結構。內層（核）多為如熒光染料、半導體量子點、磁性材料、金屬材料、藥物和生物活性分子；外層（殼）多為 金、銀、二氧化硅等無機材料和多糖、蛋白質等生物高分子材料，如圖12-7所示。核/殼型納粒制備所涉及的關鍵技術主要有：核/殼型納米顆粒的成核技術、包殼技術、表面生物分子固定化修飾技術，以及納米顆粒操縱技術等。多層結構具有多種功能。通常，-為改善納米粒子的性能、滿足不同的需要，必須對其表面進行適當的化學和生物功能化修飾。常用的生物功能化修飾劑

36、有酶、核酸、抗體、激素等。圖12-7 蛋白質修飾的ZnS包CdSe核-殼型納米粒子結構示意圖25納米粒合成方法有很多，如反相膠束法、水熱法、溶膠-凝膠法等。其中反相膠束法是最常用的一種方法。反相膠束法利用微乳液（Microemulsion）或稱反相膠束（Reversed micelle）或微反應器（Microreactor）所提供的微小反應空間（場所）來合成制備納米粒。微乳液是兩種互不相溶液體在表面活性劑作用下形成的熱力學穩定的、各向同性、外觀透明或半透明、粒徑1nm100nm的分散體系。在微乳體系中，用來制備納米粒的一般是W/O型體系，該體系一般由有機溶劑、水溶液、表面活性劑、助表面活性劑4

37、種組分組成26。油包水（W/O）微乳液的“水池”（Water pool）或稱液滴（Droplet）為納米級空間，以此空間為反應場合可以合成1nm100nm的納米粒子，故稱為反相膠束微反應器（Reversed micelle microreactor）或納米反應器（namoreactor）。水核半徑與體系中水和表面活性劑的濃度及種類有直接關系，若令=H2O/表面活性劑，則由微乳法制備的納米粒的尺寸主要由值的大小決定。由于微乳液屬熱力學穩定體系，在一定條件下膠束具有保持特定穩定小尺寸的特性（即自組裝特性），即使破裂也能重新組合，這類似于生物細胞的一些功能如自組織性、自復制性，因此又將其稱為智能微反

38、應器（Intelligent microreactor）。反相膠束微反應器制備納米粒有如下特點27：由于反應物是以高度分散狀態供給的，可防止反應物局部過飽和現象，從而使微粒的成核及長大過程能均勻進行，且可通過調節影響微反應器的外界因素而制備出較理想的單分散納粒；另外，生成的納?？稍凇八亍敝斜３址€定狀態，不會引起不必要的凝聚，使所制備的納粒可穩定長期保存。再就微反應器本身而言，通過控制膠束及“水池”的形態、結構、極性、疏水性、粘度、酸度等，可望從分子規模來控制納粒的大小、形態、結構乃至物體特異性。以下僅就生物傳感中常用的幾種納粒的合成作簡要介紹。1納米金常用的單一納米粒子有Au、Ag、TiO2

39、、SiO2等，其中Au納粒最常用。金納粒具有制備簡單、粒徑均勻、化學性質穩定、親和力強、生物相容性好、易于生物分子固定修飾等特點，因而廣泛應用于納米生物傳感器。其合成和制備的具體方法有許多, 其中主要有：反相膠束法、水相合成法、晶種合成法等。（1）反相膠束法28：以正辛烷作油相，十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）作表面活性劑，正丁醇作助表面活性劑。取正辛烷10mL，CTAB 1.2g，三次蒸餾水1mL?；旌暇鶆蚝?，滴加正丁醇至反應體系透明，即可制得反相膠束。一份反相膠束中為0.1mol/L HAuCl4水溶液；另一份反相膠束中為0.6mol/L NaBH4水溶液。將兩份反相膠束迅速混合，常溫下磁

40、力攪拌2h即可制得金黃色透明狀的納米金溶膠。納米金粒的直徑（D）大小主要取決于反相膠束中水與表面活性劑的量的比值H2O/CTAB，因而可據此調控納米顆粒的大小。（2）水相合成法29-31：所有的玻璃器皿均用王水處理，水沖洗后再用三次蒸餾水清洗，烘干備用。HAuCl4、檸檬酸鈉及其它溶液均用三次蒸餾水配制，并經0.8 m的濾膜（Gelman Scientific）過濾。 在帶有冷凝管的1 L圓底燒瓶中，加入500mL 1mmol/L的HAuCl4,強力攪拌并加熱至滾沸，快速加入50mL 38.8mmol/L的檸檬酸鈉，溶液由淺黃色變為紅色，繼續保持沸騰10min，然后移開加熱源，繼續攪拌15mi

41、n，在溶液冷卻到室溫后，經0.8m濾膜過濾，即得納米金。其粒徑大約為（132）nm。 在帶有冷凝管的1 L圓底燒瓶中，加入500mL 0.01%的HAuCl4，強力攪拌并加熱至沸，再加入7.5mL 1%的檸檬酸鈉，在25秒之內溶液變為藍色，70秒之后又變為紫紅色；繼續沸騰10min，移走加熱源，再繼續攪拌15min，在溶液冷卻到室溫后，經0.8m濾膜過濾，即得納米金。其粒徑為（185）nm。納米金的粒徑可由加入的檸檬酸鈉的量進行調節。（3）晶種合成法32,33：2.6nm膠體金的制備：室溫下2023，將1mL 1%的HAuCL4加入到90mL水中，攪拌1min，再加入2mL 38.3mmol/

42、L檸檬酸鈉。1min之后，再加入1mL含0.075% NaBH4的38.8mmol/L的檸檬酸鈉。再攪拌5min，即得2.6nm的膠體金。在4 黑暗處保存。 將0.01%的HAuCl4溶液加熱至沸，攪拌下加入38.8mmol/L檸檬酸鈉的同時加入一定量的上面制備的2.6nm的膠體金作為“晶種”。加熱沸騰15min，之后繼續攪拌10min，制備得到納米金。通過改變加入“晶種”的量，可以得到不同粒徑大小的納米金。比利時的De Mey博士等人利用乙醚的黃磷飽和溶液、抗壞血酸或者檸檬酸鈉將氯金酸（HAuCl4）水溶液還原，制備金納米粒，粒徑的尺寸范圍是3nm40nm。另外，利用反應物的光分解或鏈鎖反應

43、特性也可以制備納米粒，如用光照射HAuCl4微乳液，發生分解反應得到金納粒產物。2. 復合納米粒它們是由不同的元素或化合物構成的納米粒?，F列舉幾種復合納米粒的制備方法。（1）ZnS: Mn納米粒34：取適量的表面活性劑（S-80、T-60），正己醇和汽油，攪拌均勻，制得微乳液體系。充分攪拌，并向微乳液體系中滴加適當濃度的乙酸鋅、乙酸錳、硫化鈉水溶液，室溫反應30min，制得ZnS: Mn納粒的粒徑約為3nm5nm。（2）Ni-Fe復合物納粒35應用W/O型微乳液法制備納米級超細鐵-鎳復合物。將含0.056mol/L FeCl2, 0.20mol/L NiCl2, 0.05mol/L DBS,

44、0.5mol/L水與45mL異戊醇和15mL正庚烷混合，電磁攪拌數分鐘，得A液；將0.513mol/L NaBH4與25mL異戊醇和15mL正庚烷混合，電磁攪拌數分鐘得B液。然后，將A、B液混合于三口燒瓶中，加10mL二甲苯，于水浴上通N2氣減壓回流1.5h。待二甲苯，水和其它有機物蒸出后，殘余物用水和丙酮多次洗滌，去除懸浮物，剩余物離心分離，于80真空干燥。制得Ni-Fe復合納粒。（3）ZnS:Cu納米粒36將適量的S-80，T-60和正己醇加入到汽油中，電磁攪拌15min，再加入適量的去離子水或水溶液，攪拌30min后可得到穩定的微乳液，體系黃色透明。按100:1的摩爾配比分別將乙酸鋅和乙

45、酸銅水溶液加入到配制好的微乳液體系中，攪拌10min，然后向微乳液中滴加新配制的Na2S水溶液（Zn2+與S2-摩爾比為1:1），在電磁攪拌下反應30min，即可得到ZnS: Cu復合納米粒子的膠束溶液。然后破乳，清洗，真空干燥，可得到ZnS:Cu納粒。XRD表明納粒粒徑為3nm5nm，且為立方晶型結構。3量子點量子點（Quantum Dot, QD）37即半徑小于或接近激子玻爾半徑的半導體納米晶粒。因其特有的量子尺寸效應、表面效應及光學性質，它們在發光材料、光敏傳感器等方面有廣闊的應用前景。尤其是B族與A族元素組成的量子點，簡稱為-型量子點（如CdSe、CdTe等）。它們具有特殊優良的可見光

46、區熒光發射性質，因而有望成為一類新型的生化探針和生物傳感器。-量子點的合成方法很多，根據所采用原料和工藝不同，大致可分為無機合成路線和金屬-有機物合成路線。制備過程中產物的形成又可以分為快速成核和緩慢生長兩個步驟，其中生長過程經歷奧斯特瓦斯特成熟過程，即不穩定的小晶體逐漸溶解，并在較大的、更穩定的晶體上重結晶。常用的制備方法有溶膠-凝膠法、反相膠束法、水熱法、模板法等。下面僅就幾種重要的量子點的制備作簡要介紹。（1）單一量子點CdS和ZnS量子點： La Mer等38首先提出無機物常規加熱沉淀法制備CdS，后來，Brus和Rossetti等39,40進一步發展了該方法。如用CdSO4和(NH4

47、)2S反應，通過改變合成條件，可以可控地合成不同粒徑的CdS量子點39。正確地選擇溶劑、pH、溫度和鈍化試劑，可降低量子點的溶解度；調節pH值可改變成核作用的動力學；嚴格分離快速成核作用和慢的生長過程，可提高樣品的單分散性；使用介電常數較低的試劑或共聚物穩定劑，可提高膠體的穩定性。Rossetti等40在-77的低溫條件下，利用靜電雙層膜的斥力作用停止附聚，得到了粒徑約3nm的CdS立方晶體和小于2.0nm的ZnS立方晶體。盡管該方法合成CdS是非常有效的，但是一些重要的量子點，如CdSe等不易被合成，而且，由于產物一般為膠體狀，在較高的溫度下不是很穩定?！岸ㄓ蚰０搴铣伞笔羌{米材料合成中普遍采

48、用的方法。該方法利用那些能夠提供明顯空腔的材料，如沸石、分子篩、膠束、聚合物等作合成模板，其空腔被用作納米尺度的反應室，同時空腔大小起控制粒徑作用41-45。Herron等41采用定域模板合成法，在沸石里進行從Na+到Cd2+的離子交換，然后，接觸H2S氣體，合成了CdS量子點?？刂奇k的用量，可以得到不同粒徑的產物。利用層狀Zr(O3PCH2CH2CO2H)2的層間空腔，也可以制備一系列ME(M=Cd，Zn，Pb；E=S，Se等)量子點43。以聚合物為模板的組裝法是制備IIVI型量子點及其摻雜納米材料（如CdS:Mn，ZnS:Mn，ZnS:Tb）的一種常用方法。聚合物可分為兩類46：一類僅作為

49、分散劑，不含有效的官能團，在合成過程中不與納粒相互作用，如磺化聚苯乙烯（BSS）；另一類則含有效的官能團如巰基，一般將合成后的納粒分散在這類聚合物中，利用納粒表面與聚合物巰基的鍵連作用，使納粒受到保護，如聚4-苯酚-4-羥基硫酚。這類聚合物只起到后期修飾作用而不能控制納粒的尺寸。嚴純華研究組46合成了聚苯乙烯-順丁烯二酸酐（PSM），利用它在水溶液中可水解成二酸，從而具有配合能力的特性，作為CdS和ZnS等納粒的制備模板。金屬離子通過PSM的離子交換作用和螯合作用分散在其中，引入S2-離子，即可在原位形成嵌在聚合物中的硫化物半導體納粒。同理可制備CdS:Mn，ZnS:Mn和ZnS:Tb等摻雜納

50、粒。與其他制備方法相比，聚合物的保護和限制作用可明顯提高納粒的穩定性。具體制備方法是： 合成PSM，將23.6g (0.24mol) 順丁烯二酸酐、236mL甲苯在氮氣保護下水浴加熱溶解，用滴液漏斗滴入25g苯乙烯（0.24mol）、0.05g偶氮雙異丁腈（AIBN）（0.1%）和100mL甲苯的混合溶液，在348K350K反應2h2.5h。得到聚合物PSM。過濾，濾餅用石油醚洗滌2次，用熱水洗滌2次，在真空烘箱中313K干燥至恒重，得到42g PSM，產率86.4%。 制備PSM-CdS, PSM-ZnS及其摻雜納粒。將1.0g新制的PSM和1.1g醋酸鋅Zn(Ac)2加水混合，電磁攪拌72

51、h。酸酐水解產生2個相鄰羧基與Zn2+螯合配位，Zn2+均勻分布在聚合物中形成PSM-Zn。過濾，用水洗滌濾餅，干燥后以ICP確定所含Zn2+量。ICP結果表明，改變所用醋酸鋅溶液的濃度和反應時間可得到不同Zn2+含量的PSM-Zn溶液。 稱取計算量的PSM-Zn的固體，溶解于10.0mL二甲亞砜（DMSO）中，使25mL的反應體系中Zn2+的濃度為510-4mol/L，加入不同體積的水，待混合物冷卻至室溫，攪拌下慢慢滴入Na2S的水溶液，得到均勻嵌于PSM的ZnS納粒（PSM-ZnS）。以Cd2+離子代替Zn2+離子，重復上述步驟可以得到CdS納粒（PSM-CdS）。將Cd(Ac)2和MnC

52、l2水溶液，以及Zn(Ac)2和MnCl2水溶液各按100:5摩爾比混合之后再分別以PSM浸泡、攪拌72h，可得到PSM-CdMn, PSM-ZnMn。經溶解、攪拌、加入一定濃度的Na2S水溶液后，得到均勻分散于PSM的CdS:Mn (PSM-CdS:Mn), ZnS:Mn (PSM-ZnS:Mn)納粒，其制備條件與PSM-ZnS的相同。Wang等42用乙烯/甲基丙烯酸共聚物作模板，改變Pb2+的濃度，得到1.3nm12.5nm粒徑范圍的PbS。另一類可用作量子點合成的特殊而很有意義的模板是樹狀高聚物。Crooks等44用帶羥基末端的不同大小的樹狀聚氨基胺（PAMAM）作模板合成了由模板包封的

53、CdS量子點（DE-CdS）。合成過程中，模板既是納米反應器又是產物的穩定劑，模板的大小影響量子點的大小，進而影響量子點的光譜性質，并且，模板表面大量的功能基團使產物幾乎可溶于任何溶劑，還可以與生物配體、DNA等目標物直接結合。Murphy等45研究了用4.0代樹狀PAMAM為模板進行DE-CdS納米團的合成，先在N2氣氛10下配制1.1410-4mol/L的PAMAM甲醇溶液，將62mg Cd(NO3)2.4H2O、15mg NaS分別溶解于兩份100mL甲醇，制得Cd2+，S2-的儲備液，然后在10條件下，將0.5mL等份的Cd2+和S2-的儲備液重復10次加入PAMAM的甲醇溶液中即可得

54、到產物。這種納米團表現出特有的恒定正偏振的藍光發射，以及長達幾個月的穩定性。雖然可以在各種各樣的局限模板里合成一系列納米粒子，但是合成以后，去掉模板或者將納粒從模板中有效分離出來而不影響粒徑、形狀等性質則是一比較麻煩的問題。Zhu等47則采用微波輻射加熱，通過CdCl2或Zn(Ac)2與巰基乙胺在水溶液中快速反應，得到CdS和ZnS量子點。微波輻射加熱具有操作簡單、快速的優點，但是非熱效應、超熱效應等一些還不甚為人們所了解的微波現象，影響產物的均勻性等性質。Steigerwald等48用反向膠束溶液作定域模板，用含Zn2+離子的微乳溶液與(TMS)2S反應，得到了ZnS納米晶粒。利用單一的金屬

55、-E鍵（E=S，Se等）已經存在的前體作反應物可合成II-VI量子點。Trindade和OBrien49,50發現，在三正辛基膦(TOP)中熱分解CdE2CNR1R22，特別是空氣穩定的不對稱基取代物可以有效地進行II-VI量子點的制備。例如，用Cd(S2CNEt2)2(Et為乙基)可以得到CdS量子點。使用單種前體作原料，操作安全、簡便。但是，由于前體均需自己合成，所以要得到產物量子點，需要多步合成，程序比較麻煩。CdSe量子點： 基于B族金屬無機化合物或金屬有機化合物與A族元素有機物之間的反應可制備II-VI量子點。Steigerwald等51將Cd(CH3)2和(TMS)2Se（TMS為

56、三甲基甲硅烷基）（Se也可以換成S和Te合成相應的CdS和CdTe）在不同溶劑中混合制備了CdSe。Murray等52將Cd(CH3)2和TOPSe混合到TOP中，然后快速注入到熱的氧化三正辛基膦(TOPO)溶劑中，這種快速注入使得反應物的濃度突然達到過飽和，因而立即發生成核作用，得到納米顆粒的CdSe，接著經過緩慢的成熟過程和退火處理，再進行粒徑選擇性沉降和分離即可得到表面被TOPO鈍化的高質量的CdSe量子點，量子產率約為10%。通過改變合成溫度，可以控制粒徑（2.4nm23nm），表面的TOPO可以用吡啶、呋喃等代替。類似地，Hines等53還用Zn(CH3)2和TOPOSe為原料制備了

57、ZnSe。盡管用這種裂解方法可以制備高質量、單分散（5%）的II-VI量子點，但是，由于Cd(CH3)2、Zn(CH3)2等金屬有機物劇毒、不穩定、易爆炸，因此，用它們作原料極其危險，需要的設備條件苛刻。Peng等54用CdO代替Cd(CH3)2，采用己基膦酸(HPA)或十四烷基膦酸（TDPA）/TOPO二組分溶劑合成II-VI量子點。例如，他們將0.0514g CdO，0.2232g TDPA和3.7768g TOPO加入到25mL的反應器，然后在氣流中加熱到300320讓CdO熔解，再將溶解于2g TOP的0.0664g Te丸溶液注入反應瓶，接著使溶液保持在250生長以得到所需粒徑的產物

58、CdTe。這種方法使得工業規模的合成成為可能。他們發現在熱的TOPO中，Cd(CH3)2裂解會產生不溶的金屬Cd沉淀，在強的配體，如HPA或TDPA存在且MCd/MHPA或MTDPA1時，Cd(CH3)2立即轉變為Cd-HPA/TDPA復合物，再注入TBPSe（TBP為三丁基膦），可以生成高質量的CdSe納米晶粒。由此，他們推測Cd(CH3)2并不是必須的反應物。實驗結果表明，用CdO作鎘的前體，可以重復性地單罐合成高質量II-VI系列納米粒子，如CdSe、CdTe、CdS等。而且，由于Cd-HPA/TDPA復合物相對較高的穩定性，采用這種方法，最初的成核作用可以推遲到數百秒以后，這就使得該方

59、法在實際操作中有幾點重要的優點：注射溫度可以降低，合成的重復性好；最初的成核作用可以延長，并且CdO既不自燃，也不易爆炸，因此，可以使用大量的反應原料，這就使得工業規模的合成成為可能54。此后，他們又發現Cd(Ac)2、CdCO3等鎘的弱酸鹽都可以用作CdSe合成的優良前體，而硬脂酸（SA）、十二烷酸（LA）等脂肪酸可以用作溶劑。綜合起來，可以得到一系列用于CdSe合成的前體/溶劑組合，如Cd(Ac)2-SA/TOPO、Cd(Ac)2-SA、CdCO3-SA/TOPO、CdO-TDPA/TOPO、CdO-LA/TOPO、Cd(Ac)2-TechTOPO等，其中，Cd(Ac)2和硬脂酸分別是優良

60、的前體和溶劑/配體。但是，用硬脂酸作溶劑時，產物的粒徑較大，且范圍較寬，而膦酸/TOPO、工業純TOPO或分析純 TOPO是進行有嚴格尺寸范圍限制、尤其是小粒徑合成的優良試劑55。例如，他們用Cd(Ac)2/工業純TOPO合成了粒徑大約為3.2nm的CdSe56。由于以上試劑相對安全得多，反應可以不在手套箱中進行，從而大大改進了II-VI量子點的制備條件，簡化了實驗操作。Trindade和OBrien49,50在TOP中熱分解CdSe2CN(CH3)Hex2(Hex為己基)得到了優質的CdSe量子點。CdSe量子點還可以通過Cd(Seph)2(ph為苯基)或Cd(Seph)22Et2PCH2P