1、5.1 DNA的粗提取與鑒定廣東省惠州市田家炳中學第一部分：預習完成相關基礎知識一、基礎知識（一）提取DNA的方法1.提取生物大分子的基本思路 選用一定的物理或化學方法，分離具有不同物理或化學性質的生物大分子2.提取DNA的基本思路提取DNA，去除其他成分;利用DNA與RNA、蛋白質和脂質等;在物理和化學性質方面的差異 DNA的溶解性DNA和蛋白質等成分,在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同利用這一特點，選擇適當的鹽濃度,就能使DNA充分溶解，而使雜質沉淀；或者讓其他成分溶解,DNA析出3.DNA等大分子的理化性質DNA不溶于酒精溶液，但細胞中某些蛋白質則溶于酒精。將DNA與蛋白質進一步分離。

2、 DNA不溶于酒精溶液 DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性 蛋白酶水解蛋白質， 對DNA沒有影響 高 溫大多數蛋白質不能忍受6080 而DNA在80以上才會變性 洗滌劑溶解細胞膜，去除脂質和蛋白質 但對DNA沒有影響1、試劑：（二）DNA的鑒定條件：二苯胺沸水浴條件下，DNA遇二苯胺被染成藍色沸水浴現象：甲基綠 （綠色）想一想 必修1還有什么可鑒定DNA？第二部分：實驗操作（一）實驗材料的選取（二）破碎細胞，獲取含DNA的濾液（三）除去濾液中的雜質(純化)（四） DNA的析出與鑒定二、實驗設計視頻播放難點：實驗操作過程（一）實驗材料的選取 1、材料：魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動物的紅細胞

3、、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養基中培養的大腸桿菌。（從中選取23種實驗材料） 2、原則：選用DNA含量相對較高、容易提取的生物組織。雞血3、合適的材料： 從核DNA數目來看，豬38條，雞78條，哺乳動物血0條，獼猴桃58條，洋蔥16條，豌豆14條，菠菜12條，大腸桿菌1條。鳥類的血細胞核大，DNA多不需要破除細胞壁哺乳動物的血細胞無細胞核及細胞器。液體培養基中的大腸桿菌的DNA量較少。（二）破碎細胞，獲取含DNA的濾液1、動物細胞容易破碎雞血細胞溶液：加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液想一想：為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分

4、大量進入血細胞，使血細胞脹裂；加上攪拌作用，加速雞血細胞細胞膜、核膜破裂，從而釋放出DNA經研磨可破碎細胞壁，使細胞核內的DNA釋放。若研磨不充分，會使提取的DNA量變少，導致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。 想一想：研磨的目的是什么，如果研磨不充分，會對實驗結果產生怎樣的影響？1. DNA的溶解性（三）除去濾液中的雜質 方案一、在濾液中加入NaCl，使NaCl溶液濃度為2mol/L，過濾除去不溶的雜質，再加入蒸餾水，調節NaCl溶液濃度為0.14mol/L，析出DNA，過濾除去溶液中的雜質，在用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。 為什么反復地溶解與析出DNA，能夠去除雜質答：

5、用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽溶液中不能溶解的雜質；用低鹽溶液使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質。因此，通過反復溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質（四） DNA的析出與鑒定 與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液(體積分數95)，靜置23min，溶液中會出現白色絲狀物 粗提取DNA 用璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水1、DNA的析出1. DNA的溶解性2. DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性（三）除去濾液中的雜質討論：方案二與方案三的原理有什么不同？方案二：利用蛋白酶分解雜質蛋白，使提取的DNA 與蛋白質分開；方案三：利用DNA和蛋白質對高溫耐

6、受性的不同， 使蛋白質變性，與DNA分離（四） DNA的析出與鑒定與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液(體積分數95)，靜置23min，溶液中會出現白色絲狀物 粗提取DNA用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水1、DNA的析出2. DNA的鑒定 二苯胺 向兩支試管中分別加入 2mol/L NaCl 溶液5ml 其中一支試管中加入DNA絲狀物 各加入二苯胺試劑4ml 混勻后，置于沸水浴中加熱5min 待冷卻后，比較兩只試管中溶液的顏色變化 觀察現象：溶解絲狀物的溶液變為藍色實驗操作4、課前準備雞血細胞液取質量濃度為01g/ml的檸檬酸納溶液（抗凝劑）100ml，置于500ml燒杯中。

7、注入新鮮的雞血（約180ml），同時用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸納溶液充分混合，以免凝血。將燒杯中的血液置于冰箱內，精置一天，使血細胞自行沉淀。（也可以將血液倒入離心管內，用1000r/min（轉每分）的離心機離心2min，血細胞沉淀于離心管底部。實驗時。用吸管除去離心管上部的澄清液，就可以得到雞血細胞液。）過程檸檬酸鈉作用防止血液凝固作用機理檸檬酸鈉能與血漿中的Ca2+發生反應，生成檸檬酸鈣絡合物，血漿中游離的Ca2+大大減少，血液就不會凝固雞血細胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細胞液注意事項討論：提取雞血中

8、的DNA時，為什么除去血液中的上清液？答：血液分為兩部分，一部分是血漿，一部分是血細胞，離心后除去的上清液是血漿5、方法步驟 將制備好的雞血細胞液5 mL10mL，注入到50 mL燒杯中。向燒杯中加入蒸餾水20 mL，同時用玻璃棒充分攪拌5 min，使血細胞加速破裂。然后，用放有紗布的漏斗將血細胞液過濾至500mL。取其濾液。提取雞血細胞的細胞核物質血漿血細胞紅細胞白細胞血小板討論：答：讓細胞內濃度大于周圍溶液的濃度，細胞會吸水以至脹破（1）為什么要加入蒸餾水？加入蒸餾水后細胞會有什么變化？（2）用玻璃棒攪拌有什么意義？答：用玻璃棒攪拌可以加速血細胞和細胞核的破裂。注意應沿一個方向快速攪拌，但

9、也不能太快太猛，防止打碎DNA（3）濾去的是什么物質？得到的是什么？答：過濾將濾去的是細胞膜和核膜等物質；得到的是與蛋白質等物質結合在一起的DNA溶解細胞核內的DNA將氯化鈉的物質的量濃度為 2 mol的溶40mL加入到濾液中，并用玻璃棒沿一個方向攪拌1min，使其混合均勻，這時DNA在溶液中呈溶解狀態沿燒杯內壁緩緩加入蒸餾水，同時用玻璃棒不停地輕輕攪拌，這時燒杯中有絲狀物出現，注意觀察絲狀物呈什么顏色。繼續加入蒸餾水，溶液中出現的粘稠物會越來越多。當粘稠物不再增加時停止加入蒸餾水（這時溶液中氯化鈉的物質的量濃度相當于0.14 molL）析出含DNA的粘稠物討論：加入蒸餾水的目的？降低NaCl

10、溶液濃度到使DNA溶解度最低點，使DNA從NaCl溶液中析出將溶液中的DNA與其他雜質分離，這一步驟是實驗成敗的關鍵。實驗中應該緩慢貼壁加入蒸餾水，并輕輕地沿一個方向不停地均勻攪拌，以利于DNA分子的附著和纏繞注意事項：濾取含DNA的粘稠物用放有多層紗布的漏斗，過濾步驟3中的溶液至 500mL的燒杯中，含 DNA的粘稠物被留在紗布上將DNA的粘稠物再溶解取 1個 50 mL燒杯，向燒杯內注入氯化鈉的物質的量濃度為 2 molL的溶液 20mL。用鈍頭鑷子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中，用玻璃擇不停地攪拌，使粘稠物盡可能多地溶解于溶液中過濾含有DNA的氯化鈉溶液取1個100 mL燒杯，用放有兩

11、層紗布的漏斗過濾步驟5中的溶液。取其濾液，DNA溶于濾液中提取含雜質較少的DNA在上述濾過的溶液中，加入冷卻的、酒精的體積分數為 95的溶液 50mL（使用冷卻的酒精，對DNA的凝集效果較佳），并用玻璃棒攪拌，溶液中會出現含雜質較少的絲狀物。用玻璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。這種絲狀物的主要成分就是DNA答：因為DNA不溶于冷酒精，而其他物質可以溶解在酒精中，使含雜質較少的DNA絲狀物可以析出,懸浮于溶液中討論：（2）觀察絲狀物呈什么顏色？答：白色（1）為什么要加50mL的冷酒精？取兩支20 mL的試管，各加入氯化鈉的物質的量濃度為0015 molL的溶液5 mL，將絲狀物放入其中

12、一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4mlL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱 5 min，待試管冷卻后，觀察并且比較兩支試管中溶液顏色的變化 DNA的鑒定討論：答：有絲狀物的試管變成藍色，另一試管還是原來顏色（2）這一鑒定結果說明什么問題？（1）比較兩個試管中溶液的顏色有什么不同？答：提取出的絲狀物是DNA（3） DNA的直徑約為2010-10 m，實驗中出現的絲狀物的粗細是否表示1個DNA分子直徑的大??？答： DNA分子直徑只有2 nm。絲狀物是多個DNA子聚在一起形成的 八個步驟1.制備雞血細胞液，提取雞血細胞核物質2.溶解細胞核內DNA3.析出D

13、NA粘稠物4.濾取DNA粘稠物5.將DNA粘稠物再溶解6.過濾含DNA的NaCL溶液7.提取含雜質少的DNA8.DNA的鑒定方法步驟 加入物質 目的 1.制備雞血細胞液 檸檬酸鈉溶液 1.提取雞血細胞細胞核物質 20 m1蒸餾水 幻燈片 18 2.溶解細胞核內的DNA 2 m1L的NaCI溶液40mL 幻燈片 18 3.析出含DNA的黏稠物 蒸餾水 4.濾取含DNA的黏稠物 5.將DNA的黏稠物再溶解 2 molL的NaCl溶液20 mL 6.過濾含DNA的NaCl溶液 7.提取含有雜質較少的DNA 冷卻的95的酒精50 mL 幻燈片 18 A:(1)向試管中加入0.015 molL的NaCl

14、溶液5mL (2)加入DNA (3)4 mL二苯胺試劑 8.DNA的鑒定 B:(1)向試管中加入0.015molL 的NaCl溶液5mL (2)4 mL二苯胺試劑 加入檸檬酸鈉溶液的目的是防止血凝固加速血細胞破裂 溶解DNA 使2mol/L的NaCl溶液稀釋至0.14mol/L使得DNA最大限度地釋出 使含DNA的黏稠物被留在紗布上使含DNA的黏稠物盡可能多的溶解于溶液中除去含DNA的濾液中的雜質提取DNA A出現藍色 B無變化觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質較多；二苯胺鑒定出現藍色說明實驗基本成功，如果不呈現藍色，可能所提取的DNA含量低，或是實驗操作中出現錯誤

15、，需要重新制備四、課題成果評價（一）是否提取出了DNA本實驗提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質（二）分析DNA中的雜質（三）不同實驗方法的比較對于不同的實驗方法，本課題可以采用分組的方法進行研究。首先選取不同的實驗材料，其次同種材料還可以采用不同方法，從多方面比較實驗結果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺顯色的深淺等，看看哪種實驗材料、哪種提取方法的效果更好答：整個實驗共“兩次蒸餾水，三次過濾，兩次析出，六次攪拌”6、討論：兩次蒸餾水第一次：細胞吸水脹破 第二次：使 DNA黏稠物析出（1）此實驗過程中有幾次使用蒸餾水？幾次過濾，幾次析出，幾次攪拌？分別在哪一步？過濾時使用的

16、紗布層數與需用濾液或黏稠物有關，第二次要用其濾出的黏稠物有關，所以要使用多層紗布，第一次和第三次均要用其濾液，使用的紗布為12層三次過濾第一次： DNA存在于濾液里 第二次： DNA被留在紗布上 第三次： DNA存在于濾液里兩次析出第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液含雜質多第二次：用冷卻的95的酒精課后思考：六次攪拌？其中除最后一次外，其余均要朝一個方向攪拌，要保證得到完整的DNA，在攪動還要輕緩。玻璃棒不要直插燒杯底部，以免弄破燒杯。1、在制備雞血細胞液的過程中，加入檸檬酸鈉的目的是（ ）A .防止凝血 B. 加快DNA析出C .加快DNA溶解 D.加速凝血練一練A 2、DNA的溶

17、解度最低時，NaCl的物質的量濃度為（ ）A 2mol/l B 0.1mol/l C 0.14mol/l D 0.015mol/l3、在向溶解DNA的NaCl溶液中，不斷加入蒸餾水的目的是（ ）A 加快DNA溶解的速度B 加快溶解雜質的速度C 減小DNA的溶解度，加快DNA析出D減小雜質的溶解度，加快雜質的析出C C 4、向溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中不斷加入蒸餾水,在這個過程中DNA的溶解度變化情況分別是A 減小;減小 B 增大;增大C 先減小后增大 D增大; 減小5、欲使溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中的DNA析出，最有效的辦法是A 加蒸餾水 B 加礦泉水C 加清水 D

18、 加生理鹽水6、與析出DNA粘稠物有關的敘述，不正確的是A 操作時緩慢滴加蒸餾水，降低DNA的溶解度B 操作時用玻棒輕緩攪拌以保證DNA分子的完整C 加蒸餾水可以同時降低DNA和蛋白質的溶解度D 當絲狀粘稠物不再增加時，NaCl溶液的濃度可以認為是0.14mol/L7、你能采用其他方法對DNA進行鑒定嗎？用甲基綠染液。結果絲狀呈現綠色。8、DNA遇二苯胺會染成（沸水?。〢 硅紅色 B 紅色 C 紫色 D 藍色D 討論：方案二與方案三的原理有什么不同？ 方案二：利用蛋白酶分解雜質蛋白，使提取的DNA與蛋白質分開； 方案三：利用DNA和蛋白質對高溫耐受性的不同，使蛋白質變性，與DNA分離 方案二、

19、直接在濾液中加入嫩肉粉，反應1015分鐘。 方案三、將濾液放在60750C的恒溫水浴箱中保溫1015分鐘。2、DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性練習1、請解釋提取DNA的實驗操作中主要的步驟的目的。答：提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會由于實驗過程中或多或少的損失而造成檢測的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實驗成功與否的關鍵，要盡可能使細胞內的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據DNA的溶解特性、對酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質分開；最后一步是對DNA進行鑒定，這是對整個實驗的結果的檢測。2、你認為從細胞中提取某種特定的蛋白質與提取DNA一樣容易嗎？答：提取蛋白質比提取DNA的難度大。這是因為，與DNA相比，蛋白質對溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質的空間結構