1、1高效液相色譜法分類和應用2經典液相色譜法為基礎，引入氣相色譜法的理論和實驗技術，高壓輸送流動相，高效固定相及高靈敏度檢測器，現代液相色譜分析方法。 3與經典液相色譜法相比 顆粒極細（一般為10m以下）、規則均勻的固定相，(鍵合相)傳質阻抗小，柱效高，分離效率高；高壓輸液泵輸送流動相，流速快，分析速度快；高靈敏度檢測器，靈敏度大大提高。紫外檢測器最小檢測限可達109g，而熒光檢測器最小檢測限可達1012g。 4與氣相色譜法相比不受試樣的揮發性和熱穩定性的限制，應用范圍廣；可選用各種溶劑作為流動相，對分離的選擇性有很大作用，選擇性高；一般在室溫條件下進行分離，不需要高柱溫。 5第一節 高效液相色

2、譜法的主要類型和原理 一、主要類型四類基本類型色譜法 分配色譜法（partition chromatography）吸附色譜法（adsorption chromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）6第一節 高效液相色譜法的主要類型和原理 一、主要類型四類基本類型色譜法 分配色譜法（partition chromatography）吸附色譜法（adsorption chromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）化學鍵合相色譜法7其他色譜類型親合色譜法（affinity chromatography；AC）手性色譜法（chiral c

3、hromatography；CC）膠束色譜法（micellar chromatography；MC）電色譜法（electrochromatography；EC）8二、化學鍵合相色譜法 以化學鍵合相為固定相的色譜法，簡稱鍵合相色譜法(bonded phase chromatography；BPC)化學鍵合相：采用化學反應的方法將官能團鍵合在載體表面所形成的固定相 9優點：固定相的均一性和穩定性好，在使用過程中不易流失，使用周期長；柱效高；重現性好；能使用的流動相和鍵合相的種類多，分離的選擇性高正相（normal phase，NP）和反相（reversed phase，RP）鍵合相色譜法：根據化學

4、鍵合相與流動相極性的相對強弱10（一）正相鍵合相色譜法 固定相：極性鍵合相如氰基（CN）、氨基（NH2）或二羥基鍵合硅膠。（經典：水飽和的硅膠） 流動相：非極性或弱極性溶劑加極性調整劑如烷烴加醇類。（與水不混溶的溶劑）適用范圍：溶于有機溶劑的極性至中等極性的分子型化合物如一些在硅膠柱上分離的物質11正相鍵合相色譜法分離機制？分配：把有機鍵合層作為一個液膜看待，溶質在兩相的溶解吸附：溶質與鍵合極性基團間的誘導、氫鍵和定向作用分離選擇性：極性強的組分k大，后洗脫出柱。流動相的極性增強，洗脫能力增加，使組分k減小，tR 減小。12（二）反相鍵合相色譜法固定相：非極性鍵合相如十八烷基硅烷（C18，OD

5、S）、辛烷基（C8）鍵合硅膠 流動相：水為基礎溶劑，加入一定量與水混溶的極性調整劑常用甲醇水、乙腈水等應用：最廣。非極性至中等極性的組分，（還有有機酸、堿及鹽等） 13保留機制疏溶劑理論（solvophobic theory）溶質的保留主要是溶質分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質分子與鍵合相的烴基發生疏水締合。不是溶質分子與鍵合相間的色散力，14反相鍵合相色譜法保留行為的主要影響因素1、溶質的分子結構（極性） 極性越弱，疏水性越強，k越大，tR也越大。同系物碳數越多，極性越弱，k越大； 引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。2、固定相鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長而增加，溶質的k也增大。硅膠

6、表面鍵合烷基的濃度越大，則溶質的k越大。 15反相鍵合相色譜法保留行為的主要影響因素3、流動相極性越強，洗脫能力越弱，使溶質的k越大溶劑種類：水為弱溶劑，醇為強溶劑溶劑比例：水的比例增加，使k增大中性鹽的加入：使中性溶質的k增大pH：影響弱酸、弱減的離解流動相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱堿k變小。16離子抑制色譜法（ion suppression chromatography；ISC ）用少量弱酸、弱堿或緩沖溶液，調節流動相的pH，抑制有機弱酸、弱堿的離解，增加疏水締合作用，使k變大。適用于3pKa7的弱酸、7pKa8的弱堿反相鍵合相色譜法17把離子對試劑加入到含水流動相中，組分離子在

7、流動相中與離子對試劑的反離子（counter ion）生成中性離子對，增加溶質與非極性固定相的作用，使k增加，改善分離效果。 （三）反相離子對色譜法 paired ionchromatography；PIC ion pair chromatography；IPC18反相離子對色譜法離子對模型33+()+3s3(+固定相+()+B)+B + H+BHRSONaRSO + Na+BHRSORSO)BH離子對mB+ABAmA(s流動相通式19影響容量因子的因素離子對試劑的種類和濃度：碳鏈長度增加，溶質的k增大；在一定范圍內試劑的濃度升高，溶質的k增大 流動相的pH：有利于組分和離子對試劑離子化時（離

8、子對的形成），組分的k值最大固定相 、流動相性質（同一般RP-HPLC）。 20適用范圍：有機酸、堿、鹽，離子型和非離子型化合物的混合物。分析酸類或帶負電荷物質：用季銨鹽，如四丁基銨磷酸鹽（TBA）和溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）等分析堿類或帶正電荷的物質：用烷基磺酸鹽或硫酸鹽，如正戊烷基磺酸鈉（PICB5）、正己烷基磺酸鈉（PICB6）、 適用范圍和離子對試劑的選擇21第二節高效液相色譜法的固定相和流動相及其選擇固定相應符合下列要求：顆粒細且均勻；傳質快；機械強度高，能耐高壓；化學穩定性好，不與流動相發生化學反應。22一、化學鍵合相色譜法的固定相（一）鍵合相的種類 非極性鍵合相 ：非極性烴

9、基，如C18C8C1與苯基等鍵合在硅膠表面；用于反相色譜；長鏈烷基可使溶質的k增大，選擇性改善，載樣量提高，穩定性更好。23鍵合相的種類弱極性鍵合相： 醚基和二羥基等鍵合相用于反相或正相色譜極性鍵合相：常用氨基氰基鍵合相（氰乙硅烷基Si(CH2)2CN)鍵合硅膠一般用于正相色譜 特殊用途的鍵合相24（二）鍵合相的性質和特點 鍵合反應硅氧烷（SiOSiC）型：氯硅烷與硅膠進行硅烷化反應 如：YWGC18H37，無定形硅膠YWG上鍵合了十八硅烷基；Spherisorb ODS，球形硅膠Spherisorb 上鍵合了ODS。 25鍵合相的性質和特點鍵合相的性質含碳量：含碳的百分數 覆蓋度 ：已反應的

10、硅醇基數目占硅膠表面硅醇基總數的比例 封尾（end-capping）：在鍵合反應后，用三甲基氯硅烷等進行鈍化處理，減少殘余硅醇基。 26鍵合相的特點使用過程中不流失；化學穩定性好；適于梯度洗脫；載樣量大 注意：流動相的pH一般應在3-8，否則會引起硅膠溶解；(也有適用寬pH范圍的鍵合相)。 鍵合相的性質和特點27二、化學鍵合相色譜法的流動相 對流動相的要求：與固定相不發生化學反應。對試樣有適宜的溶解度。使k在110范圍內，與檢測器相適應。例如用紫外檢測器時，選用截止波長小于檢測波長的溶劑。純度高，粘度小。低粘度流動相如甲醇乙腈等可以降低柱壓，提高柱效。 28（一）流動相對分離的影響n由色譜柱（

11、固定相）性能決定，主要受溶劑種類的影響，k受溶劑配比的影響。 29（二）流動相的強度和選擇性溶劑的極性（強度）正相色譜：溶劑極性越強，洗脫能力越強 反相色譜：極性弱的溶劑洗脫能力強 溶劑的選擇性不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，故選擇性不同 混合溶劑（二元或多元流動相）30三、分離條件的選擇 （一）HPLC中的速率理論渦流擴散A=2dp 球形、小粒度、均勻（RSD5%）固定相，勻漿高壓填充，以降低A?？v向擴散=2Dm 可以忽略。因為Dl很小，室溫操作，且U大于U最佳，31HPLC中的速率理論傳質阻抗固定相傳質阻抗CS可以忽略 ，因df極小流動相傳質阻抗Cm 要求： dp小，Dm大32靜態流動

12、相傳質阻抗：由于部分流動相在固定相微孔內的滯留靜態流動相傳質阻抗系數Csm Csm dp2， Csm 1/Dm，而DmT/ 要求: 固定相dp2、 流動相都小HPLC中的速率理論33H=A+Cmu+Csmu 原因：化學鍵合相，液體流動相結果：HPLC的實驗條件應該是：小粒度、均勻的球形化學鍵合相；低粘度流動相，流速不宜過快；柱溫適當。 HPLC中的速率理論34（二）正相鍵合相色譜法的分離條件 固定相極性鍵合相如氰基、氨基鍵合相等 流動相烷烴加適量極性調節劑35（三）反相鍵合相色譜法的分離條件固定相非極性鍵合相如ODS流動相以水為基礎溶劑，加入甲醇、乙腈等極性調節劑弱酸、弱堿或緩沖鹽作為離子抑制

13、劑加入0.1%1%的醋酸鹽、磷酸鹽可減少殘余硅醇基的作用 36（四）反相離子對色譜法的分離條件 固定相 盡可能選擇表面覆蓋度高且疏水性強的非極性鍵合相，離子對試劑 離子對試劑所帶的電荷應與試樣離子的電荷相反 流動相pH使試樣組分與離子對試劑全部離子化有機溶劑及其濃度 同一般HPLC 37第三節高效液相色譜儀組成輸液系統進樣系統色譜柱系統檢測系統數據記錄處理系統 38一、輸液系統高壓輸液泵恒流泵：在輸送流動相過程中流量恒定。常用柱塞往復泵雙泵：為了克服流量的脈動。 有串聯式和并聯式39輸液系統輸液泵應具備的性能：流量精度高且穩定流量范圍寬能在高壓下連續工作液缸容積小密封性能好，耐腐蝕 40輸液系

14、統輸液泵操作注意事項：防止固體微粒進入泵體流動相不應含有腐蝕性物質防止溶劑瓶內的流動相被用完不超過規定的最高壓力流動相一般應該先脫氣41二、分離和進樣系統 進樣器進樣閥（六通閥）、自動進樣裝置色譜柱（column） 由柱管和固定相組成分析柱、制備柱 性能評價 H、n、fs、k和的重復性，或R。 42三、檢測系統（一）檢測器(detector)的主要性能要求：靈敏度（sensitivity）高（檢測限低）噪音（noise）低線性范圍（linear range）寬重復性（repeatability）好適用范圍廣（通用型、專屬型） 43（二）紫外檢測器(ultraviolet detector) 檢

15、測原理：朗伯比爾 (Lambert-Beer) 定律，響應信號（吸光度）與濃度成正比A=Cl特點：靈敏度較高（10-610-9 g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩定性好，適于梯度，不破壞樣品，應用廣（分析、制備）。局限：只能檢測有紫外吸收的物質，流動相的截止波長應小于檢測波長。 專屬型、濃度型檢測器44紫外檢測器固定波長檢測器 ：254nm可變波長檢測器：光源：氘燈（和鎢燈）， 200400（800）nm，單色器，流通池（試樣），光電管光路系統和紫外分光光度計相似 光電二極管陣列檢測器 (photodiode array detector； PDAD)：一系列光電二極管，一個二極管對應接受光譜上約1nm譜帶寬的單色光 45紫外檢測器光電二極管陣列檢測器工作原理：復光通過流通池，再進入單色器，分光后照射在二極管陣列裝置上，同時獲得各波長的信號強度，即獲得組分的吸收光譜。獲得三維光譜色譜圖。用途：吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積用于定量,判斷峰純度。 46紫外檢測器47（三）熒光檢測器(fluorescence detector；FD)檢測原理：化合物受紫外