1、第34章DNA的復制和修復12分子生物學的中心法則(central dogma) DNA RNA 蛋白質復制轉錄翻譯逆轉錄RNA復制3一、DNA復制 （一）半保留復制（semiconservative replication） 模板原則特點親代DNA雙鏈，每股鏈都可作為模板按堿基配對原則指導新鏈合成合成的兩個子代DNA分子堿基順序與親代分子完全一樣一條鏈來自于親代的DNA鏈，另一條鏈是新合成的鏈4親代DNA子代子代半保留復制新鏈5Old strandNew strandThe hypothesis ofsemiconservativereplication proposed by Watson

2、 and Crickin 1953.6Radioisotope labelingand density gradientcentrifugation clearlydistinguishes replications ofsemiconservative from conservative.（1958）78910A electron micrograph of the replicationintermediate of a plasmid DNA: -shaped structures were observed; no single strandedDNA is visible.No co

3、mplete unwinding of the two parental strands occurred before the daughter strands are synthesized11（二）半不連續復制 （semidiscontinuous replication）1、 體內僅存在5 3的DNA聚合酶2、 前導鏈與隨從鏈（崗崎片段）12553355335533 前導鏈隨從鏈崗崎片段半不連續復制13前導鏈（leading strand）： DNA復制時，一股以3 5方向的母鏈作為模板，新合成的鏈以5 3方向連續合成的鏈稱為前導鏈。（復制方向與解鏈方向一致）14隨從鏈（lagging

4、 strand): DNA復制時，一股以5 3方向的母鏈作為模板，新合成鏈沿5 3合成1000-2000個核苷酸不連續的小片段稱為隨從鏈。（復制方向與解鏈方向相反)崗崎片段（Okazaki）崗崎片段由DNA連接酶連成一條完整的新鏈15 DNA半不連續復制： 3 5方向母鏈為模板，新鏈5 3方向連續合成5 3方向母鏈為模板，新鏈5 3方向合成許多不連續的片段（崗崎片段）這種復制方式稱之為半不連續復制。16（三）RNA引物DNA聚合酶不能催化兩個游離dNTP在DNA模板上聚合需要具3-OH的引物引物最后被DNA聚合酶除去、補滿，再由連接酶連接RNA聚合酶能催化兩個游離NTP在DNA模板上聚合減少突

5、變，提高DNA復制的真實性1755335533 前導鏈隨從鏈崗崎片段RNA引物3-OH18嚴格的堿基配對規律RNA引物聚合酶的選擇作用復制時有即時的校讀功能 3 5外切酶功能DNA損傷的修復機制（四）復制的真實性19(五）參與DNA復制的酶類和蛋白質dNTPMg+3-OH引物DNA模板酶和蛋白質因子DNA鏈合成的條件：20DNA聚合酶/解旋酶單鏈結合蛋白(SSB）拓撲異構酶/引發體DNA連接酶酶和蛋白質因子2122231、DNA的聚合反應24252、大腸桿菌DNA聚合酶（原核生物）3,5-磷酸二酯鍵35圖12-4包括5種DNA聚合酶: pol、26DNA聚合酶多功能酶 5 3外切酶 3 5外切

6、酶 5 3聚合酶單鏈多肽（Zn2+） 大小二個片段切除RNA引物 填補空缺 損傷后修復DNA聚合酶多功能酶 5 3聚合酶 3 5外切酶 不對稱二聚體單體1-前導鏈/單體2-隨從鏈DNA復制的主要酶 高續進性 高聚合酶活性 高產物真實性2728 3 5 5 3 外切酶 聚合酶NC 5 3外切酶小片段35KD大片段（ klenow片段）68KD切除RNA引物損傷修復校讀功能（常用的工具酶）（1）、DNA聚合酶（DNA Polymerase） Kornberg酶、DNA指導的DNA聚合酶 （DNA-Directed DNA Polymerase, DDDP）聚合功能29Large（Klenow）fr

7、agment of DNA pol 303132DNA pol 合成速度太慢持續合成能力低影響DNA復制的基因突變與DNA pol 無關僅參與局部修復，不是真正的復制酶33（2）、DNA聚合酶全酶（DNA Polymerase holoenzyme）10種亞基組成，含鋅2 (4個)DNA聚合酶全酶核心聚合酶連接兩個核心聚合酶夾鉗裝置復合體星環狀,容納DNA雙鏈34Sliding clamp subunits聚合酶活性聚合酶活性3 5 外切活性 復合物，促進亞基結合于DNADNA pol III （復制酶） 無5-3 外切酶活性 組成核心酶促進核心酶形成二聚體組裝2 353637真核細胞的DNA

8、聚合酶五種DNA 聚合酶DNA聚合酶和PCNADNA聚合酶DNA聚合酶、引物的合成前導鏈、隨從鏈合成參與線粒體DNA的合成參與DNA的修復增殖細胞核抗原（ 類似于亞基）38（3）、DNA聚合酶、DNA聚合酶 5 3聚合酶活性 3 5外切酶活性 DNA聚合酶和(1999年以后發現） DNA受嚴重損傷時誘導產生 跨越受損部位 使復制缺乏準確性（修復酶）393、DNA解旋酶及SSBDNA解旋酶（helicase）單鏈結合蛋白 (SSB） 解開DNA雙鏈每對堿基消耗2個ATP維持單鏈狀態 使其不受核酸酶水解避免單鏈DNA自身發夾螺旋形成使前端螺旋易解開大腸桿菌SSB與DNA結合具有協同效應404、DN

9、A拓撲異構酶Linking number兩條鏈的互繞數414243444546474849含拓撲異構酶（及H1） 與DNA復制及轉錄有關50拓撲異構酶/ （topoisomerase） 拓撲異構酶/ 旋轉酶 （gyrase）切斷DNA雙螺旋中一股，張力下降后封閉消除負超螺旋不需能量切斷DNA雙鏈引入負超螺旋需ATP供能（1）、大腸桿菌的拓撲異構酶51磷酸二酯鍵的轉移52535455拓撲異構酶拓撲異構酶 類型 ：切斷DNA雙螺旋中一股；不需能量拓撲異構酶/消除正/負超螺旋消除負超螺旋消除正/負超螺旋不能導入負超螺旋（2）、真核細胞的拓撲異構酶565、引物酶和引發體DNA聚合酶只能在模板鏈的指令下

10、，在引物（通常RNA）3-OH添加新核苷酸功能，沒有從頭合成活力；引物酶合成一小段RNA，作為DNA合成的引物；必須與幾種輔助蛋白組裝成引發體，才有合成引物的活性。 如：DnaA、DnaB、DnaC、DonaT、PriA、PriB、PriC等57586、DNA連接酶催化二段DNA鏈之間3,5 磷酸二酯鍵的形成3OH553 OO- P O O-有缺口的DNA鏈DNA連接酶ATPAMP+PPi OO P O O-53缺口封閉59哺乳動物：ATP供能， 大腸桿菌：NAD供能， 都需要Mg2+606162缺口填補:連接雙股DNA分子中一鏈的切口雙鏈DNA分子中雙鏈的切口不能連接二分子單鏈DNA 63（

11、1）崗崎片段之間的連接（2）DNA損傷修復中的連接（3）一種重要的工具酶: 限制性內切酶切割后形成的粘性末端 或平頭末端的連接應用:6465（三）DNA復制的過程(起始、延伸、終止） 確定復制的起始點解開雙鏈DNA,提供單鏈DNA模板形成復制叉DNA合成的起始和延長形成帶有新合成的DNA片段的復制泡復制的終止66原核生物雙向復制（型復制）特定起始點：oriC真核生物多個復制單位（復制泡）（復制起始點+復制叉）多個起始點1、復制的起始67大腸桿菌復制起始點oriC的結構（1）9個核苷酸的重復序列4個（2）13個核苷酸的重復序列3個68形成起始復合物類組蛋白69 DNA的甲基化與復制的發動有關Or

12、ic中含11個GATCDam甲基化酶使A上N6甲基化（親代）半甲基化的Oric可與細胞膜結合70 原核生物雙向復制（型復制）71真核生物復制泡（復制起始點+復制叉）7273DNA雙鏈復制起始點 dnaAdnaB/dnaCDNA雙鏈解開成單鏈DNASSB引物酶RNA引物/3-OHDNA聚合酶dNTP和3-OH形成3，5磷酸二酯鍵解旋酶SSBSSB3355引發體解旋酶拓撲異構酶74（1）.DNA聚合酶的作用（2）.前導鏈合成1000-2000個核苷酸后，（3）.隨從鏈開始合成，崗崎片段的長度 為1000-2000個（大腸桿菌） （4）.Pol為不對稱二聚體： 一個作用于前導鏈 另一個作用于隨從鏈(

13、loop)2、復制的延伸75后滯鏈中引物不斷被合成76777879808182383843、復制的終止去除RNA引物補充空缺連接 DNA聚合酶的小片段 5 3外切酶DNA聚合酶的大片段 3 5外切酶 5 3聚合酶DNA連接酶853553868788（七）真核細胞端粒DNA的復制真核生物的線性染色體DNA 每復制一次，子鏈5有缺失末端有特殊序列-端粒特征: 由數百個串聯重復的6核苷酸組成人:5-AGGGTTAGGGTT-3端粒能穩定染色體1.端粒(telomere)89二十世紀三十年代，遺傳學家Barbava McClintock和Hermann J.Muller發現，染色體的末端有一種能穩定染

14、色體結構和功能的特殊成分。如缺少染色體間會互相粘連、出現結構變化或其它錯誤行為，以致影響染色體的生存和正確復制并進一步威脅到細胞的存亡。“端粒”（telomere）90 希臘語末端“telos”和部分“meros” 端粒 telomere 端粒帽 染色體 端粒帽911978年首次發現四膜蟲端粒的分子組成： 端粒 染色體DNA 端粒n（CCCCAA）n（GGGGTT）35（TTGGGG）n（AACCCC）nn（CCCTAA）n（GGGATT）35（TTAGGG）n（AATCCC）n人端粒的分子組成：92線形DNA復制末端問題933553RNA引物水解端粒 染色體DNA 端粒94 組成蛋白質(DN

15、A聚合酶)+RNA(合成端粒DNA的模板)唯一攜帶RNA模板的逆轉錄酶人端粒酶:模板(RNA-端粒酶):3-CAAUCCCAAUC-5合成(DNA): 5-AGGGTT-3端粒酶和衰老、腫瘤有關2.端粒酶（telomerase)95DNA末端1.RNA和DNA單鏈互補序列識別結合2.以RNA為模板 的逆轉錄過程3.再發動新一輪的合成延長,合成較長的重復序列3.端粒酶的作用機制3、端粒酶的作用機制96TTGGGGTTGGGGTTGGGG55TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC 35oH35CCAACCCC35TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC2.聚合 1. 結合

16、3.移位 爬行模式端粒酶的功能TTGGGGTTGGGGCCAACCCC97末端補齊機制：5GGGGTT（GGGGTT）n端粒酶535DNA聚合酶9899100以延長的DNA單鏈為模板,3-OH為引物合成富含C的互補鏈101 端粒帽 染色體DNA 端粒帽n（CCCCAA） （TTGGGG）nn（GGGGTT） （AACCCC）n35端粒結合蛋白保護端粒不受核酸酶或化學修飾的作用一般是緊密的非共價鍵結合102人類纖毛蟲類103哺乳動物中端粒末端形成大的環狀結構,環狀DNA+蛋白質 保護染色體末端的穩定端粒的環狀結構104端粒酶與細胞存亡端粒酶端粒 端粒酶催化端粒不斷延長，從而抵消因染色體復制、細胞

17、分裂導致的DNA縮短，使得染色體DNA完好無損，細胞能夠順利地分裂繁殖。105 正常細胞：細胞分裂細胞分裂 衰老死亡 細胞年輕化 端粒酶 重新引入抗衰老10655端粒消耗端粒維持細胞衰老細胞永生化染色體DNA端粒端粒107DNA修復的基礎： 一條鏈有損傷 修復酶切除 以未損傷的鏈為模板 合成原來相同的序列二、DNA的損傷修復108109（一）造成損傷的原因自發因素物理因素化學因素紫外線損傷（共軛雙鍵）電離輻射損傷（X線/線）亞硝酸鹽 C U5-溴尿嘧啶 5-BU A 氮芥類 烷化劑羥胺 C- A GG羥胺110DNA復制時堿基的錯誤配對罕見態堿基引起T-G、A-C錯配N H NN H NNNN

18、NNNNNO H OO H NHO H OO H NHCH3CH3 烯醇式T酮式G酮式T烯醇式GT-G錯配DNA自發損傷111C-A錯配NH NN H N HN HNH HNH NHNNNNNNNNOO亞氨基式C亞氨基式A 氨基式A氨基式C112 環出效應引起堿基錯配新合成鏈 TGGC TGGCA TGGCAATG 模板鏈 ACCGATAG ACCGTAG ACCGATAGAl l l l l l l l l l l l l l l l l 環出效應引起堿基缺失或插入新合成鏈 TTTT TTTT TTTTGAC 模板鏈 AAAAACTG AAAACTG AAAACTGl l l l l l l

19、 l l l l l l l lAA 新合成鏈 TTTT TTT TTTTTGAC 模板鏈 AAAAACTG AAAACTG AAAAACTGTT l l l l l l l l l l l l l l l113114115116117118羥胺（hydroxylamine，HA） 使C的化學成分發生改變，不能與G配對，而與A互補。經兩次復制后，C-G對變換成T-A對。119（二）修復機制1、光修復 （低等生物）不需光復活酶需光復活酶（photoreactivation repair）嘧啶單體 嘧啶二聚體嘧啶單體 嘧啶二聚體 光復活酶（+） 藍光280nm239nm120光復活/光修復光復活酶

20、識別TT 與之形成復合物吸收光能使TT解開成為單體酶從復合物中釋放僅作用于UV形成的產物121 O6甲基鳥嘌呤直接被修復1221949年A.凱爾納偶然發現灰色鏈絲菌等微生物經紫外線(UV)照射后如果立即暴露在可見光下則可減少死亡。此后在大量的微生物實驗中都發現了這種現象，并證明這是許多種微生物固有的DNA損傷修復功能,并把這一修復功能稱為光復活。1958年R.L.希爾證明即使不經可見光的照射，大腸桿菌也能修復它的由紫外線所造成的DNA損傷，而后又證明其他微生物也有這種功能,當時就把這種修復功能稱為暗復活或暗修復。此后發現暗修復普遍地存在于原核生物、低等真核生物、高等真核生物的兩棲類乃至哺乳動物

21、中，并證實暗修復包括切除修復和復制后修復兩種。1968年美國學者J.E.克利弗首先發現人類中的常染色體隱性遺傳的光化癌變疾病著色性干皮病(XP)是由基因突變造成的 DNA損傷切除修復功能的缺陷引起的。這一發現為惡性腫瘤的發生機理提供了一個重要的分子生物學證據,也使DNA損傷修復的研究進入了醫學領域。123光復活酶已在細菌、酵母菌、原生動物、藻類、蛙、鳥類、哺乳動物中的有袋類和高等哺乳類及人類的淋巴細胞和皮膚成纖維細胞中發現。這種修復功能雖然普遍存在，但主要是低等生物的一種修復方式，隨著生物的進化，它所起的作用也隨之削弱。 124（1） 特異核酸內切酶切除 DNA聚合酶填補、修復 DNA連接酶連

22、接（2） 人體重要的修復方式 （3）缺乏UV特異核酸內切酶 著色性干皮病2、切除修復（excision repair） 125切除修復發生在復制之前核苷酸切除修復126 dUTP酶可以分解dUTP為dUDP和dUMP胞嘧啶C自發脫氨氧化生成尿嘧啶U尿嘧啶-N-糖苷酶腺嘌呤脫氨成次黃嘌呤次黃嘌呤-N-糖苷酶烷基化修飾的堿基被糖苷酶除去AP位點（apurinic/apyrimidinic site）聚合酶對dTTP和dUTP的分辨能力不高127堿基切除修復 DNA糖苷酶識別切除改變的堿基 核酸內切酶切除磷酸二酯鍵 DNA聚合酶填補 DNA連接酶連接128DNA糖苷酶具特異性識別-DNA中的異常堿基

23、水解-異常堿基與脫氧核糖間糖苷鍵 使其脫落129130DNA堿基的組成為何是“T” ？（1）DNA中的C容易突變成U（2）尿嘧啶DNA糖苷酶識別DNA中的U（3）若DNA中存在U，無法區別突變U和正常U DNA中T的存在增加遺傳信息的穩定性 RNA中的U：數量多/半衰期短/經濟131132133著色性干皮病患者的皮膚部位缺乏核酸內切酶，不能修復被紫外線損傷的皮膚的DNA，因此在日光照射后皮膚容易被紫外線損傷，先是出現皮膚炎癥，繼而可發生皮膚癌。另外，患者還可能同時伴有眼睛和神經的癥狀。 著色性干皮病首先表現為對日光的高度敏感，這個癥狀在出生后不到一歲就可能出現，也就是說患者經輕度日曬后就會皮膚

24、發紅，出現雀斑樣損害，甚至出現水皰，繼而出現皮膚萎縮、變薄、毛細血管擴張、色素沉著和色素脫失、皮膚干燥、脫屑等，日久可引發皮膚的良性或惡性腫瘤，包括皮膚的基底細胞癌、鱗狀細胞癌、黑色素瘤、角化棘皮瘤、血管瘤和血管肉瘤等。腫瘤一般在10歲內出現，大多數患者在20歲前就發展為腫瘤期。134耗能的過程3、錯配修復135136137 CH3 G A T C C T AGGT G A T C53 C T A G35GTCH3 CH3 G A T C C T AGGTMutHMutSMutL切口 CH3 G A T C C T AGGT 5 3CH3 G A T C53 C T A G35TGDNA解鏈酶

25、 核酸外切酶 SSBdNMPs CH3 G A T C C T AGGT 5 3DNA聚合酶 DNA連接酶dNTPs CH3 G A T C C T AGGCDNA錯配修復的模型1381394、重組修復（recombinational repair）140二聚體后起始途徑復制繼續子鏈缺口經重組由母鏈相應片段填補 RecA 蛋白具有交換DNA鏈活力母鏈缺口再合成 二聚體未被去除而是逐漸被稀釋復制后修復1415、易錯修復DNA受到損傷或復制系統受到抑制SOS反應誘導修復系統：避免差錯的修復（error free repair）易錯修復（error prone repair）142SOS反應誘導缺乏

26、校對功能的DNApol、引起校對系統的松懈 RecA基因產物LexA蛋白自身水解（蛋白酶活性被激活）SOS系統開放：修復系統的酶表達 LexA基因表達也增加使SOS反應可迅速逆轉143SOS反應 SOS基因紫外線激活Rec ALex A阻遏蛋白 與DNA 損傷修復有關的酶和蛋白質基因表達Lex A阻遏蛋白操縱序列DNA144145146（一）突變的類型點突變類型結果轉換-同型堿基顛換-異型堿基啟動子/剪接信號 影響整個基因功能編碼序列 蛋白質功能改變中性變化 AA變化，功能不變靜止突變 堿基變，AA不變三、DNA突變147缺失插入倒位一個堿基/一段核苷酸/整個基因一段原來沒有的堿基/核苷酸序列

27、DNA鏈內部重組，一段方向顛倒148149（二）誘發基因突變的因素 根據突變發生的原因可將突變分為:自然條件下未經人工處理而發生的自發突變（spontaneous mutation）經人工處理而發生的突變誘發突變（induced mutaion）誘發突變的各種內外因素統稱為： 誘變劑（mutagen）150 H NNHOBroNNHOBr OHHNNHOOCH3酮式5-BU 烯醇式5-BU 胸腺嘧啶1、堿基類似物 5-溴尿嘧啶（5-BU) 與G配對與A配對化學因素151烯醇式 5- BU與G的配對NNOBrO-HH-NH-NHNONN1525-BU引起的 A-T G-C 轉換 A-T第一次復制

28、 A-TA-BU （酮式）第二次復制 A-BU（酮式） G-BU （烯醇式）第三次復制A-BUG-BUG-C突變A-T1532、堿基修飾劑脫氨劑：誘導堿基脫氨、點突變 亞硝酸鈉、亞硫酸氫鈉羥胺烷化劑AI與C配對脫氨CGU與A配對X仍與C配對脫氨脫氨154芳基化劑引起的DNA損傷可與DNA形成共價化合物 OH HO HO G NH 苯并芘苯并芘二羥環氧化物與鳥嘌呤加合物1553、嵌入染料誘發的突變一類較強的誘變劑 NNH2 H2N 原黃素的結構原黃素插入母鏈兩個堿基之間，結果多一個核苷酸；插入子鏈兩個堿基之間，正常堿基不能插入，結果少一個核苷酸后果：引起移碼突變1564、紫外線和電離輻射紫外輻射

29、：產生相鄰堿基二聚體，T=T最常見電離輻射：直接作用于DNA分子 間接作用（輻射產生的活性氧） 堿基損傷、糖環斷裂、DNA鏈斷裂或交聯生物因素：可移動基因成分 插入或切斷基因、病毒、轉座子物理因素生物因素15715820下列關于大腸桿菌DNA連接酶的敘述哪些是正確的：A催化DNA雙螺旋結構之斷開的DNA鏈間形成磷酸二酯鍵B催化兩條游離的單鏈DNA分子間形成磷酸二酯鍵C產物中不含AMPD需要ATP作能源15916插入或缺失堿基對會引起移碼突變，下列哪種化合物最容易造成這種突變：A口丫啶衍生物 B5-溴尿嘧啶C氮雜絲氨酸 D乙基乙磺酸 E咪唑硫嘌呤17在對細菌DNA復制機制的研究中，常常用到胸腺嘧啶的類似物5-溴尿嘧啶，其目的在于：A引起特異性移碼突變以