1、細胞凋亡發生機制和疾病匯總四、細胞凋亡與疾病 三、細胞凋亡的發生機制 二、細胞凋亡過程與調控 一、概述 五、細胞凋亡在疾病防治中的意義 一、概述（一）研究背景 人們研究細胞的發育、分化和成熟至今已有百余年的歷史，近二十年才發展到在分子水平上研究相關基因的表達調控。和細胞增殖一樣，細胞死亡規律的研究一直被人們所忽視。 可尋的研究： 1858年，Virchow提出細胞死亡在動脈瘤中的重要性，并將它簡單地定義為細胞退化（degeneration）、壞疽（mortification）、軟化（softening）和壞死（necrosis）。 1885年，Flemming在退行性卵巢囊泡中觀察到染色質凝聚

2、成半月形和細胞核漸進性退化、消失等現象，并稱之為“染色質裂解”（chromatolysis）。 1914年，Graper進一步提出機體內必定存在和有絲分裂為敵的平衡機制，而“染色質裂解”的意義就在于生理性清除細胞。 1951年，Glucksman發現細胞在生物發育中的特定時空內發生死亡，并提出程序化細胞死亡（programmed cell death）的概念。 20年后，Kerr發現結扎門靜脈誘導肝細胞缺血后，出現肝萎縮現象，他將它稱為“固縮性壞死”（shrinkage necrosis）。 1972年，Kerr，Wyllie和Currie等正式以細胞凋亡（apoptosis）命名這種特殊的細

3、胞死亡形式。 19761981年間，三個小組分別發現淋巴細胞凋亡伴隨典型的“梯樣”DNA電泳圖譜。 1984年，Wyllie進一步提出細胞凋亡伴隨內源性核酸酶的激活。 20世紀80年代末期，生命科學家逐漸認識到細胞死亡，特別是程序化細胞死亡特殊的生物學意義，引起眾多學者的廣泛關注，形成一個新的研究熱點，并以驚人的速度取得新進展.（二）概念 細胞凋亡（apoptosis）由體內外因素觸發細胞內預存的死亡程序而導致的細胞死亡過程，又稱程序性細胞死亡（PCD）。 Apoptosis源自希臘語，意為“花瓣或樹葉的凋謝枯落”，細胞像秋天樹葉凋謝一樣，一定的生理或病理條件下，遵循自身所定程序結束生命的過程

4、，細胞凋亡是一種由基因控制的自主性死亡。 .有學者認為凋亡是形態學概念，程序性死亡是功能性概念。（三）與細胞壞死的區別 細胞壞死是由強烈損傷因素作用下（缺氧、毒物、強酸、強堿等）細胞死亡，正常組織不發生細胞壞死，細胞凋亡為生理性、主動的細胞死亡。（四）細胞凋亡的意義 1、確保機體正常發育、生長 2、維持內環境穩定 3、發揮積極的防御功能 二、細胞凋亡過程與調控 （一）細胞凋亡過程1、凋亡信號轉導 2、凋亡基因激活 3、細胞凋亡執行 4、凋亡細胞的清除 誘導期效應期降解期（二）凋亡時細胞主要變化 1、細胞形態學變化胞膜逐漸脫離與周圍細胞的接觸 空泡化 胞體縮小 固縮內質網與胞膜融合,在膜表面突起

5、出芽染色質深縮成團，分布于膜邊緣邊集胞膜皺縮、內陷，分割胞漿，蛋白濃染形成凋亡小體 凋亡小體被鄰近細胞吞噬、清除（主要是巨噬細胞）凋亡過程不導致周圍組織損傷和炎癥反應 2、細胞凋亡的生化改變（1）DNA片段化 DNA鏈上每隔200個核苷酸有1個核小體，核小體之間的連接區易受內切酶的切割而斷裂，當在核小體連接區切開DNA時，可形成200bp或整倍數的片段，在凝膠電泳中呈“梯”狀。（2）內源性核酸內切酶激活 該酶由細胞內信號轉導環節被激活，在細胞凋亡過程中執行染色質DNA切割任務（3）凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用 凋亡蛋白酶是一組對底物天冬氨酸部位有特異性水解作用，活性中心富含半胱

6、氨酸的蛋白酶。（含半胱氨酸的門冬氨酸特異水解酶） 有人在研究無脊椎動物如線蟲細胞凋亡時發現，細胞的死亡呈現嚴格的特異性，在雌雄同體發育產生的1090個體細胞中，131個細胞在特定的時空內以凋亡而終結，這些細胞凋亡至少受14個基因的調控，其中最重要的是凋亡活化基因Ced-3、Ced-4和凋亡抑制基因Ced-9。它們誘導和調控細胞凋亡的基本機制：Ced-3是具嚴格底物特異性的半胱氨酸蛋白酶，誘導細胞的特征性形態學和生化學變化。Ced-3能結合Ced-4，后者能結合Ced-9。在活細胞，Ced-9以Ced-4為中介和Ced-3結合成三體復合物，扣押Ced-3使其以無活性的酶原形式存在于細胞內，在凋亡

7、誘導信號的作用下，Ced-9自復合物中解離。其結果是導致Ced-3的活化和細胞凋亡。如Ced-3和Ced-9在人體的類似物分別代兩大家族，即caspases家族和Bcl-2家族.人體細胞凋亡要比線蟲細胞調亡的機制復雜得多。差別可能在于線粒體在哺乳細胞凋亡中的重要性。哺乳細胞凋亡主要包括兩條途徑，即死亡受體途徑和線粒體途徑。它們通過一系列分子和生物化學途徑導致兩條途徑共同的“中央處理器”分子即caspases的活化，并誘導許多細胞核和細胞漿內相關底物的降解。 93年有人發現Ced-3基因與哺乳動物白介素1轉化酶ICE功能和序列相似，和Ced-3一樣，ICE高表達可致成纖維細胞凋亡，之后，許多實驗

8、室致力于識別ICE/Ced-3樣蛋白，至今已發現14個ICE/Ced-3家族成員（分為三組），其中一些參于細胞凋亡，一些參于細胞因子加工和炎癥，為避免命名上混亂，96年專門小組推薦ICE/Ced-3家族成員統一命名天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，并按先后為序在caspase后加阿拉伯數字表示。 其在凋亡中作用：滅活細胞凋亡抑制物（如Bcl-2）水解細胞的蛋白結構，導致細胞解體 凋亡小體；在凋亡級聯反應中水解相關活性蛋白，使 該蛋白另具功能等。Caspase 的天然抑制劑：病毒性蛋白、p35，抑制蛋白-抑制Caspase活化，凋亡蛋白抑制因子IAP等（三）細胞凋亡的調控 1、細胞凋亡相關因素 （1

9、）誘導性因素 細胞外誘導因素啟動細胞凋亡程序，使細胞趨于死亡激素與生長因子失衡 強烈應激使糖皮質激素分泌，可誘導淋巴細胞凋亡理化因素 OFR增加，細胞處氧化應激 狀態，DNA受損，細胞凋亡免疫性因素 免疫細胞可分泌免疫分子，參于免疫細胞或靶細胞的凋亡生物因素 細菌、病毒及其毒素可 誘導細胞凋亡（2）抑制性因素 某些細胞因子、激素具有抑制細胞凋亡的作用，如IL-2、NGF、ACTH、睪酮、雌激素等可抑制相應的靶細胞凋亡，防止其萎縮。 某些二價陽離子（Zn+）藥物（苯巴比妥）病毒（EB）、中性氨基酸亦具抑制細胞凋亡作用。2、細胞凋亡信號轉導 凋亡信號轉導系統是連接凋亡誘導因素與DNA片段化斷裂及最

10、終激活細胞死亡程序，導致細胞結構蛋白降解的中間環節。這個系統的特點是：多樣性：即不同種類的細胞有不同的信號轉導系統；偶聯性：即死亡信號的轉導系統與細胞增殖、分化過程中的信號轉導系統在某些環節上有交叉；因此同一個信號，在不同條件下既可引起凋亡，也可刺激增殖； 同一性：即不同的凋亡誘導因素可以通過同一信號轉導系統觸發細胞凋亡。多途徑：即同一凋亡誘導因素可經過多條信號轉導途徑觸發凋亡。（1）死亡因子介導的細胞凋亡 TNF受體家族至少12個成員，為I型膜蛋白。TNF受體家族中的Fas蛋白（膜受體）可與淋巴細胞表面Fas配體（Fas ligand）或抗Fas抗體結合 以三聚體形式與鄰細胞的fas結合，并

11、誘導受體的三聚化，激活的受體通過與多種具有死亡域的受體連接蛋白結合，形成死亡誘導信號復合體（DISC），同時激活caspase級聯反應，誘發細胞凋亡。 TNF被稱為死亡因子（death factor）, 作用的受體被稱為死亡受體（DR）。同受體結合后通過些接頭蛋白活化caspase導致細胞凋亡（3） cAMP/PKA 信號系統 糖皮質激素淋巴細胞 Ca+/Ca+調蛋白 cAMP PKA 細胞凋亡（2） 胞內Ca+信號系統:胞內Ca+ (+) Ca+ 依賴性谷氨酰胺轉移酶活化轉錄因子 細胞凋亡 （4）神經酰胺介導的細胞凋亡 神經酰胺是細胞凋亡信號調控中的第二信使分子，許多誘導和刺激因素能激活細胞

12、膜上神經鞘磷脂酶，引起細胞膜上神經鞘磷脂水解產生神經酰胺。有人用維生素D3處理HL-60白血病細胞后，該細胞出現早期的和可逆的神經鞘磷脂水解，同時伴有神經酰胺升高，隨后發生細胞凋亡。抗腫瘤藥物紅必霉素可激活神經酰胺合成酶引起神經酰胺升高，誘導細胞凋亡。 許多刺激因子如TNF、Fas、離子射線、IL-1、免疫分子、熱休克蛋白、激素、抗癌藥（紅必霉素、長春堿）和活性氧等能激活神經鞘磷脂產生神經酰胺，誘導多種細胞發生凋亡。 神經酰氨 鞘氨醇 1磷酸鞘氨醇（SPP)傳遞增殖信號 抗凋亡細胞凋亡水解 激酶（6）PTK信號系統 對細胞凋亡起負調控作用，神經、表皮生長因子與其受體結合，激活該系統，促進細胞分

13、化。阻斷該途徑引起細胞凋亡。（5）二酰甘油/PKC 信號系統 激活的PKC可引起白血病細胞發生凋亡（7）p53+基因觸發的細胞凋亡 p53在射線所致的、化學損傷的DNA損傷和生存必需因子短缺等觸發細胞凋亡過程中起重要作用。也參與病毒感染、細胞癌基因異常表達或某些腫瘤抑制基因產物缺乏所誘發的凋亡。 p53可使Bax表達增加，促進凋亡發生（8）線粒體損傷啟動的細胞凋亡 1993年Jacobson等人發現用溴化乙錠除去線粒體DNA，誘導人成纖維細胞凋亡，表明線粒體在細胞凋亡中起重要作用，在細胞凋亡中線粒體功能損傷表現為：線粒體膜通透性增高，內膜的跨膜電位下降，能量合成水平顯著降低等，從而啟動細胞凋亡

14、。3、調亡相關基因及調控細胞凋亡是級聯式基因表達的結果，已知細胞凋亡相關基因多達數十種，根據其功能不同，分為三大類：抑制凋亡基因，例如Bcl-2、EIB和IAP；促進凋亡的基因，例如p53、Fas等；雙向調控基因，例如c-myc、Bclx。正常情況下前二類基因處于動態的平衡，以確保細胞生死有序。目前已發現多種基因編碼的產物參與了調亡的發生和調控，研究得較多的是Bcl-2、p53等。（1）Bcl-2 是B細胞瘤/白血病-2的基因縮寫，是訖今研究的最深入、廣泛的抑制凋亡基因之一，最早從小鼠B細胞瘤中分離出來，是一種細胞內膜蛋白，主要定位于線粒體、內質網、核膜。至今已相繼發現至少20個存在于哺乳動物

15、的Bcl-2同源蛋白。其中，一些屬于凋亡抑制蛋白如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Bcl-G等，一些則具有凋亡誘導活性如Bax、Bak、Bid、Bim、Bik、Bcl-B、Bcl-Xs等。 Bcl-2家族成員主要包含兩大結構域，即位于羧基端的跨膜結構域（TM）和數量不等（14個）的Bcl-2同源結構域（Bcl-2 homology，BH）。根據結構特點的不同，Bcl-2家族可劃分為三個分別以Bcl-2;Bax和BH3-only域蛋白（Bik）為代表的亞類。 Bax由192氨基酸組成，與Bcl-2的同源性為21%，Bcl-2與Bax在體內可形成異二聚體，但Bax與Bcl-2的作用完全相反，

16、Bax/Bax二聚體在體內過量表達時，可促進細胞凋亡，而Bcl-2的抑制凋亡功能可能通過與Bax形成異二聚體而實現。Bcl-2家族可決定細胞生死存亡。 Bcl-2高表達可導致腫瘤細胞對射線、抗癌藥物的耐受性增強。Bcl-2抗凋亡機制：直接抗氧化；抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質；抑制凋亡誘導蛋白Bax、Bak的細胞毒作用；抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活；維持細胞鈣穩態。 （2）Fas Fas基因對細胞凋亡有促進作用，Fas與其配體（Fasl）的相互作用是引起細胞凋亡的主要途徑之一。Fas蛋白屬于TNF受體家族，Fas與其細胞表面配體Fasl的結合，可誘導酪氨酸激酶活化使多種細胞蛋白的酪氨酸

17、磷酸化，介導DNA裂解。 有資料表明外周血T、B細胞中，Bcl-2的表達下降，而Fas表達顯著升高，提出Bcl-2具有抑制Fas介導的凋亡作用。（3）p53 因編碼53 KD蛋白質而得名，在細胞G1期監視細胞基因組的完整性，如DNA遭損傷， p53蛋白可阻止細胞進入細胞周期或與之結合使DNA得到修復，如修復失敗則啟動細胞凋亡。p53如何使細胞生長停滯在G1期與決定細胞走向死亡有機的結合起關健作用，但p53究竟是如何把此兩個功能精確地結合起來，現在還是個謎。 （4）C-myc、Bcl-x 已發現很多原癌基因與細胞凋亡過程有關，如c-fos jun max、bcr-abl等，c-myc是調控細胞周

18、期的主要基因，是一種轉錄調節基因，既是可介導細胞增殖的基因，也是可介導細胞凋亡的基因，取決于細胞接受的何種信號及所處的生長環境。研究表明,在缺乏生長因子時c-myc才誘導細胞凋亡，否則其功能仍呈增殖狀態。基因表達與其他致癌因素同存時為增殖作用，與其他抑癌條件共存時就導致細胞凋亡。 Bcl-x，由241氨基酸殘基組成，與人Bcl-2基因同源性達74%，其由于mRNA剪切方式不同可產生兩種大小不同Bclx蛋白，大分子（Bcl-XL）含有Bcl-2的二個同源結構域（BH1和BH2）其功能與Bcl-2相似，可以抑制細胞凋亡；Bcl-x的小分子蛋白（Bcl-Xs）缺少BH1和BH2同源區，其功能與Bcl

19、-2相反，可以促進細胞凋亡，mRNA的剪切加工是Bcl-x產生抑制或促進細胞凋亡的關健控制點。 、吞噬細胞對凋亡細胞的吞噬吞噬細胞受體識別凋亡細胞，凋亡細胞有相應標記（）吞噬細胞凝集素作用吞噬細胞植物凝集素凋亡細胞N-乙酰葡萄糖胺N-乙酰半乳糖半乳糖（）血小板反應蛋白(TSP)介導吞噬吞噬細胞分泌的TSP黏附巨噬細胞在凋亡細胞間形成分子橋，介導對凋亡細胞的吞噬（）磷脂酰絲氨酸受體的作用凋亡細胞膜內層磷脂酰絲氨酸暴露巨噬細胞磷脂酰絲氨酸受體吞噬三、細胞凋亡的發生機制 （一）氧化損傷在細胞凋亡中的作用 各種OFR氧化劑破壞機體正常的氧化/還原動態平衡，造成生物大分子核酸、蛋白、脂質）氧化損傷，形成

20、嚴重氧化應激（oxid five stress）狀態，誘導細胞凋亡氧化應激引起細胞凋亡的可能機制 1、OFR DNA損傷 （）p53 細胞凋亡 2、OFR DNA損傷 NAD ATP細胞凋亡 3、OFR 膜脂質過氧化細胞凋亡 鈣內流 4、OFR（+） Ca+/mg+依賴性核酸內切酶5、氧化應激NFB和Ap-1，凋亡相關 基因表達細胞凋亡消耗（二）鈣穩態失衡在細胞凋亡中作用 1、細胞鈣失衡可激活Ca+/mg+依賴核 酸內切酶，降解DNA。2、鈣失衡激活谷氨酰胺轉移酶，催化胞內肽鏈酰基轉移，在肽鏈間形成共價鏈，細胞骨架交聯，有利于凋亡小體形成。3、激活核轉錄因子，增加凋亡相 關基因轉錄。4、胞內C

21、a+ DNA鏈展開，暴露 核小體酶切位點，DNA易被酶切割。（三）線粒體損傷在細胞凋亡中的作用 線粒體功能改變在細胞凋亡的發生中起關鍵性作用：抑制線粒體的三羧酸循環或呼吸鏈功能即可引起細胞凋亡；線粒體內膜通透性可增大，線粒體內膜的跨膜電位下降，能量合成水平顯著降低，在細胞核出現凋亡性改變之前，常常先有線粒體跨膜電位的降低。已證明，阻止線粒體的通透性改變（permeabililty transition，PT）可以防止細胞凋亡。 線粒體膜功能和結構上的完整性破壞引起細胞凋亡的可能機制是：線粒體內、外膜之間的通透性轉換孔（PTP）是一種蛋白復合物，具有調節線粒體膜通透性作用。正常情況下，絕大多數P

22、TP處于關閉狀態。當線粒體跨膜電位在各種凋亡誘導因素作用下降低時PTP開放，導致線粒體膜通透性增大，使細胞凋亡啟動因子如：細胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子（Apaf）和凋亡誘導因子（AIF）等從線粒體內釋放出來，促進細胞凋亡。 Bcl-2具有恢復跨膜電位和調節PTP功能的作用，因而可阻止上述凋亡啟動因子從線粒體向外釋放，切斷了細胞凋亡級聯式反應中的關鍵性環節，所以具有很強的抗細胞凋亡的作用。 氧化損傷、鈣穩態失衡、線粒體損傷三者在細胞凋亡的發生上既可單獨啟動，又可聯合作用，近來有人把它們合而為一，提出了細胞凋亡的網絡假說。四、細胞凋亡與疾病 （一）細胞凋亡不足 1、腫瘤 在腫瘤的研究與治療中，人

23、們一直在試圖闡明腫瘤細胞是如何接受異常刺激信號而無限增殖的，盡管取得不少成果，發現一系列癌基因和抑癌基因，但至今未取得突破性進展。目前已認識到細胞增殖過度是腫瘤發病的一個途徑，而凋亡受抑、細胞死亡不足是腫瘤發病的另一途徑，結果導致病變組織內腫瘤細胞存活延長，使群體細胞內存活與死亡的平衡破壞，許多腫瘤組織中Bcl-2基因表達顯著高于周圍正常組織，提示腫瘤與細胞凋亡減弱有關。如前所述p53基因是目前最受關注的抑癌基因，作為轉錄調節蛋白，p53即上調細胞凋亡的促進因子Bax，又能抑制細胞周期的進展，并修復損傷的DNA。 許多應激信號如DNA損傷、端粒磨損（telemere attrition）、癌基

24、因活化和低氧（hypoxia）等廣泛存在于癌癥的發生和發展包括腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中，而這些信號都能活化p53基因，p53基因作為防止潛的在惡性細胞生長和存活的應激反應信號途徑中樞，在防止腫瘤發生機制中發揮關鍵作用。當p53基因突變或缺失時，腫癌發生發展明顯增高。2、自身免疫病 正常情況下，免疫系統在發育過程中可將針對自身抗原的免疫細胞以細胞凋亡方式有效清除，免疫系統對自身成份不發生免疫應答。而自身免疫病則是機體產生抗自身抗體或致敏淋巴細胞，對自身抗原攻擊造成組織器官損傷。1994年mountz等提出自身免疫病可能同細胞凋亡有關。可能與免疫系統在發育過程中未能將針對自身抗原的免疫細胞以凋亡

25、的方式有效清除有關。目前認為類風關、SLE等都同細胞凋亡有關。 糖皮質激素治療自身免疫病可能機制就是誘導異常存活的自身免疫性T細胞凋亡。（二）細胞凋亡過度 1、心血管疾病 近年來研究發現越來越多的心血管疾病的發生發展與細胞凋亡有關。（1）心肌缺血再灌流損傷與細胞凋亡 有學者將離體大鼠心肌細胞置無氧的培養環境中，發現其在12小時后細胞出現凋亡，同時伴有Fas抗原mRNA表達的增加，而對照組成纖維細胞在72小時后的仍然無凋亡，Itoh等觀察19例急性心梗者心肌細胞證實：心肌細胞除壞死外還存在凋亡，缺血早期以凋亡為主，晚期以壞死為主，梗死區周邊細胞凋亡為主，中央以壞死為主，急性嚴重心梗以壞死為主，慢性輕度則發生細胞凋亡。 缺血再灌注損傷引起細胞凋亡機制可能同氧化應激有關（因SOD可減輕凋亡）缺血缺氧使Fas受體上調，（FasL（配體）與受體反應促進凋亡） 缺O2增加p53基因轉錄細胞凋亡（2）心衰 氧化應激 負荷增加 細胞因子 缺血缺氧 誘導心肌細胞凋亡 細胞數量減少 心衰發生發展 2、神經原退行性疾病 阿爾茨海默病（AD） 帕金森氏病 特定神經原進行性喪失AD可能機制：氧化應激（OFR） 神經原 鈣內流 （+）相關基因 淀粉樣蛋白 神經原凋亡 臨床用尼莫地平（鈣拮抗）及抗氧化劑（VitE）治療。3、病毒感染 HIV感染的AIDS其關鍵發病機制為