1、分子克隆常用工具酶植物基因工程 每一單鏈具有 5-3極性 兩條單鏈間以氫鍵連接 兩條單鏈，極性相反，反向平行 以中心為軸，向右盤旋Structure and featuresDNA 的基本結構植物基因工程植物基因工程Replication植物基因工程分子克隆操作過程： 克隆目的基因將目的基因與載體用限制性內切酶切割和連接，制成重組DNA導入宿主細胞篩選、鑒定擴增和表達。植物基因工程 工具酶是指能用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、反轉錄等有關的各種酶系統稱為工具酶。 要把不同基因的DNA線形分子片段準確地切出來，需要各種限制性核酸內切酶（restriction endonuclease）

2、；要把不同片段連接起來，需要DNA連接酶（ligase）；要合成基因或其中的一個片段，需要 DNA 聚合酶（polymerase）等。 因此，酶是 DNA 重組技術中必不可少的工具。植物基因工程核酸水解酶類核酸合成酶類核酸修飾酶類核酸內切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA連接酶磷酸酶核苷酸激酶核苷酸轉移酶甲基化酶植物基因工程限制性核酸內切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶用于核酸操作的常用工具酶工具酶名稱 主要功能限制性內切核酸酶 Restriction endonucleases在DNA分子內部的特異性的堿基序列內部進行切割DNA連接酶DNA ligase將兩條以上的線性DN

3、A分子或片段催化形成磷酸二酯鍵連接成一個整體DNA聚合酶IDNA polymerase I通過向 3 端逐一增加核苷酸以填補雙鏈DNA分子上的單鏈裂口，即53 DNA 聚合酶活性與 35及53-外切酶活性多核苷酸激酶DNA polymerase kinease催化將把一個磷酸分子加到多核苷酸鏈的5-OH末端上反轉錄酶Reverse transcriptase以RNA分子為模板合成互補的cDNA鏈DNA末端轉移酶DNA terminal transferase將同聚物尾巴加到線性雙鏈 或單鏈DNA分子的3-OH末端或DNA的3-末端標記dNTP降解酶 S1nuclease S1降解單鏈DNA或R

4、NA，產生帶5磷酸的單核苷酸或寡聚核苷酸，同時也可切割雙鏈核酸分子的單鏈Taq DNA 聚合酶Taq DNA polymerase能在高溫（72）下的單鏈DNA為模板，從53方向合成新生的互補鏈常用的工具酶性質及功能植物基因工程植物基因工程第一節 分子克隆最常用兩個工具酶“分子剪刀” 限制性核酸內切酶 在DNA上核苷酸的特定連接處以特定的方式把DNA雙鏈切開。如EcoRI, HpaI“分子膠” DNA連接酶促使具有互補粘性末端或平頭末端的載體和供體DNA片段連接，形成重組DNA分子。植物基因工程限制性內切酶 Restriction enzymes“分子剪刀” 限制性核酸內切酶 在DNA上核苷酸

5、的特定連接處以特定的方式把DNA雙鏈切開。如EcoRI, HpaI植物基因工程 限制性內切酶是一種能識別 DNA 上特定堿基組成的序列并在這些序列位點上切斷DNA分子水解磷酸二酯鍵的一種內切核酸酶。植物基因工程一、限制性核酸內切酶的分類植物基因工程二、 限制性核酸內切酶的命名原則 名 屬 種 株 序 菌株來源 稱 名 名 名 號EcoR E co R Escherichia coli R Hind H in d Haemophilus influenzae d Hind H in d Haemophilus influenzae d Hpa H pa / Haemophilus parainf

6、luenzaea Hind 代表從流感噬血桿菌(Haemophilus influenzae) d 株中分離到的第3個限制酶。植物基因工程 一般分子量為60kd，單鏈多肽，最適 pH 為 68 NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巰基有保護作用 對熱不穩定，通常貯存于20環境。為避免反復凍溶使酶失活，商品酶均含有50甘油，使用時添加相應的緩沖液稀釋，降低反應液中甘油的濃度。三、限制性核酸內切酶學特性植物基因工程每一種酶都有各自特異識別位點 它對底物要求有特異的序列，通常的識別序列是4 bp 6bp，有些則為7bp8bp，甚或多于8bp。 多數限制酶的識別序列為回文結構，在識別序列內或其附近水

7、解DNA鏈中的磷酸二酯鍵。植物基因工程植物基因工程不同限制性內切酶切割的三種結果植物基因工程植物基因工程植物基因工程植物基因工程5-GGATCC-33-CCTAGG-55-G GATC C-33-C CTAG G-55-AGATCT-33-TCTAGA-55-A GATC T-33-T CTAG A-5Bgl IIBam H同尾酶植物基因工程 溫度：一般37 鹽離子濃度：Na，Mg2 緩沖體系：具有穩定 pH 環境的Tris-HCl緩沖體系 DTT用于保持酶 穩定性和活性 反應體積和甘油濃度： 商品化的限制性內切核酸酶均加50甘油作為保護劑，一般在-20保存。酶切反應時，加酶的體積一般不超過總

8、反應的10，否則甘油濃度過高，影響酶切反應 反應時間：通常為1h；進行大量DNA酶切反應時一般讓酶解過夜 DNA純度和結構 DNA樣品中所含的蛋白質、有機溶劑、 RNA等雜質會影響酶切反應的速度和完全程度酶切的底物一般為雙鏈DNA，DNA的甲基化位置會影響酶切反應。四、影響酶切反應的條件*植物基因工程II 型限制性核酸內切酶酶解反應體系植物基因工程“星”活性Star activity “星”活性：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端ppH值等，會使一些核酸內切酶的識別和切割序列發生低特異性所謂的現象。 在名稱右上角加一個星號(*)表示,如EcoR*：AATT ；EcoR：GAATTC 必

9、須采用規范的實驗步驟, 應用推薦的反應條件。植物基因工程植物基因工程位點偏愛（site preference） 某些限制性內切酶對不同位置的同一個識別序列表現出不同的切割效率。植物基因工程第二節 DNA連接酶 DNA Ligase植物基因工程定義：催化DNA上裂口兩側(相鄰)核苷酸裸露的3羥基和5磷酸之間形成共價結合的磷酸二酯鍵，使斷開的DNA裂口連接起來功能：具有修復單鏈或雙鏈的能力,在DNA重組、復制和損傷后的修復中都起關鍵作用。一、DNA連接酶性質 植物基因工程植物基因工程T4 DNA ligaseE.coli DNA ligase來源T4 噬菌體大腸桿菌分子量6000075000輔助因

10、子ATPNAD+底物雙鏈DNA分子的粘、平端RNA-DNA雜合體，RNA鏈缺口、雙鏈DNA分子中的單鏈缺口同源互補粘端雙鏈分子中的單鏈缺口應用范圍廣泛、效率高 窄兩種DNA連接酶比較 二、常用連接酶植物基因工程連接反應的溫度是影響轉化效率的最重要參數。多數內切酶產生的粘性末端的Tm值在15以下，然而保持連接酶活性的最佳反應溫度卻是37但在該溫度下，粘性末端之間的氫鍵結合是不穩定的，因此最適溫度是粘性末端的Tm值和連接酶最適溫度的折衷，所以連接反應一般采用16過夜。三、DNA連接酶的反應條件植物基因工程DNA濃度：外源片段濃度比載體DNA濃度高5-10倍 由于平末端的連接效率比粘性末端要低得多，

11、故在平末端連接反應中，T4 DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要求較高。防止環化：堿性磷酸酶預先處理質粒載體時間：過夜最好1）粘性末端DNA片段的連接植物基因工程直接用T4 DNA連接酶連接：效率不高，較少采用。同聚物加尾連接平末端DNA片段：先用末端核苷酸轉移酶，給平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA連接酶進行連接用銜接物連接平末端DNA分子：目的是在平末端分子上構建限制性核酸內切酶酶切位點，經酶切后產生特異的粘性末端，從而與具有互補末端的DNA連接2)平末端DNA片段的連接植物基因工程植物基因工程應用互補同聚物加尾法連接DNA片段植物基因工程用銜接物分子連接平末端的DN

12、A片段銜接物：指用化學方法合成的一段由若干個核苷酸組成的、具有一個或數個限制酶識別位點的寡核苷酸片段植物基因工程四、重組DNA實驗的一般程序選用一種對載體DNA只具唯一限制識別位點的限制酶（如EcoR I）作位點特異的切割，形成全長的具粘性末端的線性DNA分子再將外源DNA片段也用同一種酶作相同的消化?；旌?，加入DNA連接酶。由于具有相同的（如EcoR I）粘性末端，能退火形成雙鏈結合體。其中單鏈缺口經DNA連接酶封閉之后，便產生穩定的雜種DNA分子。植物基因工程第二節 其他分子克隆工具酶一、DNA 聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶IK1enow片段T4 DNA聚合酶Taq DNA聚合酶逆轉錄酶：依

13、賴于RNA的DNA聚合酶RNA聚合酶依賴于DNA的DNA聚合酶植物基因工程 用途：DNA缺口平移中標記DNA探針大腸桿菌DNA聚合酶I 以一條DNA為模板通過聚合作用把脫氧核苷酸加到雙鏈DNA分子的 3-OH 端而合成新的 DNA.植物基因工程植物基因工程基本用途 大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenow fragment) 大腸桿菌DNA聚合酶I經枯草桿菌蛋白酶處理,獲得N端三分之二的大肽段,即Klenow 酶。 Klenow 酶仍擁有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了5 3的核酸外切酶活性。 植物基因工程植物基因工程植物基因工程植物基因工程有35的核酸外切酶活性和 5

14、3的DNA聚合酶活性。在無dNTP時，可以從任何 3-OH端外切 T4 DNA 聚合酶 (T4 phage DNA polymerase)植物基因工程 基本用途植物基因工程Taq DNA聚合酶是從棲熱水生菌(Thermus aquaticus)中分離純化的依賴DNA的DNA聚合酶，最適溫度75-80需要Mg2+(10 mmolL)，在低濃度Mn2+(2 mmol/L)中有低活性，Ca2+使其完全失活，一價陽離子高至0.1 moIL對活性無影響，而最適濃度NaCl為40 mmol/L，KCl為60 mmol/L最適pH7.8(Tris-HCl)，與大腸桿菌DNA聚合酶相比，其最大特性是耐高溫和無

15、核酸酶活性Taq DNA聚合酶植物基因工程催化RNA體外合成反應依賴 DNA 的 RNA 聚合酶不依賴 DNA 的RNA聚合酶 RNA聚合酶植物基因工程 反轉錄酶(reverse transcriptase) 反轉錄酶具有53的DNA聚合酶活性，以RNA為模板聚合cDNA鏈,同時又具有3 5和5 3的 RNA 外切核酸酶活性。AMV和MLV。主要用途：轉錄 mRNA 成為 cDNA 制備基因片段植物基因工程雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈植物基因工程DNA 和 RNA的修飾酶核酸酶SI堿性磷酸酶磷酸激酶末端脫氧核苷酸轉移酶甲基化酶植物基因工程1）單鏈核酸酶SI 功能： 降解 ssDNA

16、 或 ssRNA 形成 5-磷酸末端的單或寡核苷酸片段。植物基因工程植物基因工程應用：分析DNA：RNA雜交體結構（S1 mapping）。確定內含子部位。切除DNA片段上的單鏈末端，形成平末端. 切開 cDNA 合成過程中形成的發夾環在限制酶位點上產生小缺失植物基因工程植物基因工程Rnase 和 DNaseRNase-Free DNase 是一種DNase I（核酸內切酶）， 可以降解雙鏈或單鏈 DNA。RNase H： 特異性地水解雜交到 DNA 鏈上的 RNA磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈。該酶不能消化單鏈或雙鏈DNA。 RNase A：廣泛應用的核酸內切酶。對R

17、NA有水解作用，但對DNA則不起作用。Rnase 酶非常穩定，常規的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。 DEPC 處理。 堿性磷酸酶 功能：催化去除 DNA、RNA 上的 5 端磷酸基團, 從DNA片段上除去5磷酸以防自身連接。用途：在DNA連接之前常用它處理克隆載體以防止載體自身連接。植物基因工程植物基因工程Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)磷酸激酶T4-多核苷酸磷酸激酶植物基因工程植物基因工程末端脫氧核苷酸轉移酶 功能：在一定條件下，催化將一個一個的脫氧核苷酸，沿著5到 3加到 DNA 鏈的 3-OH 末端。該過

18、程不需要DNA模板，對雙鏈、單鏈 DNA 都適用。經常用于人工粘性末端的構建。 末端脫氧核苷酰轉移酶(TDT)植物基因工程甲基化酶原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統中的一員，用于保護宿主 DNA 不被相應的限制酶所切割。 Dam 甲基化酶可在 GAmTC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。受其影響的酶有Bccll II、MbbooII等。 Dcm 甲基化酶識別 CCmAGG 或 CCmTGG 序列，在第二個胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基。受其影響的酶有EccooR IIII等植物基因工程基因工程中常用的工具酶工 具 酶功 能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化D

19、NA中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3末端Klenow片段DNA聚合酶I大片段具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA 3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基植物基因工程植物基因工程思考題：載體構建的工具酶主要有那些類型？限制性核酸內

20、切酶、同裂酶、同尾酶、宿主的限制與修飾。核酸內切酶命名原則、操作注意事項及產生星活性的原因、影響其酶活性的因素。T4 DNA連接酶的性質及用途.Klenow 酶的基本性質及用途。其他工具酶的用途。練 習 題1. 一種DNA分子經三種限制酶完全酶切后得如下結果： EcoRI 5kb EcoRI/HindIII 1、2、3、4kb HindIII 3kb 、7kb EcoRI/PstI 2、3、5kb PstI 10kb HindIII/PstI 1、3、6kb 將各限制酶位點繪制在DNA分子上。2.另一DNA分子經相同處理后得如下結果，將各限制酶位點標在DNA分子上。 EcoRI 1、3、6kb

21、 EcoRI/HindIII 1、3kb HindIII 4、6kb EcoRI/PstI 1、3、5kb PstI 2、8kb HindIII/PstI 2、6kb 3.下圖中的一段DNA分子上有兩個限制酶PstI和EcoRI識別位點，兩位點相距10bp，現有一研究生要分析EcoRI右側500bp區域內的功能，他需要在這一區域內獲得各種缺失突變體以確定某功能區，他應如何設計此實驗？假定EcoRIPstI間的10bp除去后并不影響任何結果分析，但PstI位點左側的DNA不能除去 10bp 500bp PstI EcoRI 4. 假如PstI位點為另一限制酶HindIII，實驗又該如何設計？ 5

22、. 現有一研究者打算將一EcoRI DNA片段克隆到一個DNA分子的 BamHI 位點以便 DNA 擴增，但擴增后的 DNA 分子又可用BamHI 限制酶將插入的片段回收，如何設計此實驗。 6. 一研究生要將一質粒（pI）上的BamHI-HindIII片段取代另一質粒（pII）上的BamHI-XbaI片段，所獲重組質粒（pIII）上的插入片段要求能用BamHI-HindIII進行回收，問如何設計此實驗？10bp 500bp HindIII EcoRI H Xb H5kb pI 1kb 6kb pII .5kb 6kb pIII 1kb B B B 7. 現有一重組質粒的限制酶譜和克隆到的基因轉錄方向入圖所示： 已知HindIII克隆片段中的BamHI（3kb）片段含有一完整的基因編碼區，現要將此3kb的BamHI片段克隆到另一表達載體pB的BamHI位點，如何才能