1、分子生物學（ molecular biology ）是以生物分子為靶標，在細胞內從分子水平(shupng)研究生命現象本質和生命過程規律的一門交叉學科。基因(jyn) (gene)：攜帶(xidi)有遺傳信息的 DNA或 RNA序列，也稱為遺傳因子。 結構基因：可被轉錄形成 mRNA，并轉譯成多肽鏈，構成各種結構蛋白質，催化各種生化反應的酶和激素等。調節基因：某些可調節控制結構基因表達的基因。其突變可影響一個或多個結構基因的功能，或導致一個或多個蛋白質（或酶）量的改變。 開放閱讀框架 (open reading frame，ORF)：在DNA鏈上，由蛋白質合成的起始密碼開始，到終止密碼為止的一

2、個連續編碼序列。基因組 (genome)：一個細胞內的全部遺傳信息，包括染色體基因組和染色體外基因組。C值 (C-value)：一種生物體單倍體基因組DNA的總量，用以衡量基因組的大小。基因重疊：同一段DNA片段能夠參與編碼兩種甚至兩種以上的蛋白質分子。病毒基因組的大小與細菌或真核細胞相比，病毒的基因組很小。不同的病毒之間基因組大小相差很大。 乙肝病毒DNA：3kb，編碼4種蛋白質； 痘病毒的基因組：300kb，編碼幾百種蛋白質。病毒基因組的大小通常與其對宿主的依賴程度有關，基因組越大，依賴性越小。 基因重疊的方式 （1）一個基因完全在另一個基因里面。（2）幾個基因部分重疊。（3）兩個基因之間

3、只有一個堿基重疊。 多順反子 mRNA (polycistronie mRNA) ：病毒基因組DNA序列中功能上相關的蛋白質的基因或 rRNA的基因往往叢集在基因組的一個或幾個特定的部位，形成一個功能單位或轉錄單元。它們可被一起轉錄成含有多個 mRNA 的分子。插入序列 (insertion sequence，IS):2000bp以內，兩端都有正向重復序列（direct repeats，DR）和反向重復序列（inverted repeats，IR），中間1kb左右的編碼序列，僅編碼和轉座有關的轉座酶。復合型轉座子 ( composite transposon, Tn):200020000bp之

4、間，兩端由一對 IS 元件組成，帶有與轉座作用有關的基因以及其他基因。質粒（plasmid）：一類染色體外具有自主復制能力的環狀雙鏈DNA分子，屬染色體外基因組。嚴緊控制（stringent control）型質粒：其復制常與宿主的繁殖偶聯，拷貝數較少，每個細胞中只有1個到十幾個拷貝。松弛(sn ch)控制（relaxed control）型質粒：其復制與宿主不偶聯，每個細胞中有幾十到幾百個拷貝。 質粒的不相容性（incompatibility）：兩種不同質粒因利用同一復制和維持機制，在復制和隨后向子代細胞(xbo)分配的過程中會發生競爭，從而不能在同一宿主細胞內穩定存在，其中一種質粒將被丟失

5、。影響(yngxing)質粒穩定性的因素：宿主細胞分裂時質粒能否均衡地分配到子代細胞。質粒分子自身結構的穩定性。 真核生物染色體基因組特點人類基因組中僅含有2500030000個基因，遠低于預期。在人類基因組中只有很少一部份（約2-3）DNA序列用以編碼蛋白質和結構RNA。人類基因組中存在大量基因間隔區序列，主要由重復DNA構成。在基因內部含大量內含子。單拷貝序列：占 40%-80%，結構基因基本上屬于單拷貝序列。 中度重復序列：重復次數10105，占 10-40%。如rRNA、tRNA、組蛋白以及免疫球蛋白的基因等，另有部分可能與基因的調控有關。 高度重復序列：拷貝數大于106 ，占 10-

6、60%。如反向重復序列 (inverted repeats) 和衛星DNA (satellite DNA)。單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）:由基因組DNA上的單個堿基的變異引起的DNA序列多態性。多基因家族 (multi gene family)：由某一祖先基因經過重復和變異所產生的一組基因。假基因 (pseudo gene)：與某些有功能的基因結構相似，但不能表達有功能的基因產物的某些基因。假基因的產生有兩種方式：由突變引起的基因序列變化而失去功能，這樣產生的假基因帶有內含子，稱為常規假基因（conventional pseudogen

7、e）。mRNA經過反轉錄為cDNA，再插入基因組，由于插入位點不合適或序列發生變化而導致失去功能。這種類型的假基因不含內含子，稱為已加工的假基因（processed pseudogenes）。 高等動物線粒體基因組具有獨特的特點： 母系遺傳。子代線粒體基因組來自母親，父系的線粒體基因組在精卵結合時一般不能進入卵細胞。 線粒體DNA損傷后不易修復，突變率較高，可能與衰老及某些疾病有關。遺傳密碼與通用遺傳密碼存在差別，如UGA（終止密碼子）編碼Trp，AGA/AGG（Arg）為終止密碼子等。基因組學（Genomics）：對生命有機體全基因組進行序列分析和功能研究的學科。結構基因組學：目的是在生物體

8、的整體(zhngt)水平上測定出全部蛋白質分子、蛋白質蛋白質、蛋白質與其他生物分子復合體的三維結構。基因定位克隆：利用微衛星和SNP全基因組掃描來搜索與疾病性狀緊密(jnm)相關的位點，從而確定疾病相關基因的位置并進一步獲得克隆。功能基因組學：根據(gnj)已有基因的功能推測基因組中具有相似結構的基因的功能，通過實驗手段驗證。有效的方法有定點突變、基因敲除（knock-out）和RNA干擾及過量表達技術等。蛋白質組：蛋白質組學(proteomics): 指應用各種技術手段來研究蛋白質組的一門新興科學，其目的是從整體的角度分析細胞內動態變化的蛋白質組成成份、表達水平與修飾狀態，了解蛋白質之間的相

9、互作用與聯系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規律。蛋白質組學包括:細胞器蛋白質組學：通過純化細胞器或用質譜儀鑒定蛋白質復合物組成來確定蛋白質在亞細胞結構中的位置。表達蛋白組學：把細胞、組織中的所有蛋白質建立成定量表達圖譜或掃描EST圖。蛋白質組學研究流程圖蛋白質組學的研究內容1 蛋白質組表達模式（組成）的研究 蛋白質組成分鑒定、數據庫構建、新型蛋白質的發現、同源蛋白質比較、蛋白質加工和修飾分析。2 蛋白質組功能模式（作用）的研究 基因產物識別、基因功能鑒定、基因調控機制分析。 重要生命活動的分子機制（如細胞周期、分化與發育、環境反應與調節等）。 醫藥靶分子的尋找和分析（包括新藥靶分子、腫瘤分子標

10、記、人體病理介導分子等）。2-DE是指第一向的固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）等電聚焦電泳與第二向SDS組成的分離系統，也稱雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳，簡稱2-DE。等電點聚焦:這種不同的蛋白質分別聚集在各自的pI處，形成一條狹窄穩定的區帶而彼此分開的現象稱為等電點聚焦固相pH梯度（IPG）;這種pH梯度是由固定在凝膠基質上的羧基和氨基形成的緩沖對來維持，不容易變動，因此稱為固相pH梯度（IPG）。 雙向電泳的流程:樣品制備第一(dy)向等電聚焦第二(d r)向SDS凝膠上蛋白(dnbi)的檢測蛋白的軟件的檢測匹配斑點:通過比較兩塊（或多塊）凝膠圖譜，將圖譜上

11、對應的蛋白質斑點（代表同一種蛋白質）標識出來.未匹配斑點:只在一塊膠上出現的蛋白質斑點也標識出來，代表可能的差異表達蛋白質.2-DE存在的不足和缺陷：首先，2-DE的分辨率仍不能滿足蛋白質組學研究的需要，人類基因組有35萬個基因，可能表達的蛋白質達數十萬種，這對2-DE技術的分離能力提出了嚴峻挑戰；其次，2-DE對極酸、極堿性和疏水性膜蛋白的分離效果不盡人意，對具有重要功能的低豐度蛋白質的檢測也是個很大的難題；最后，2-DE操作過程的自動化是一個亟待解決的難點，自動化的操作平臺可減少人為誤差，提高實驗結果的重復性，帶來高通量的分析速度，滿足大規模蛋白質組學研究的需要。色譜法又稱色譜分析、色譜分

12、析法、層析法，是一種制備分離和分析方法。酵母雙雜交技術：噬菌體展示技術(phage display) 是一種非常有效的多肽及蛋白質功能篩選技術,它利用大腸桿菌絲狀噬菌體作為載體，將外源蛋白質或多肽的基因克隆到絲狀噬菌體基因組中，與噬菌體外膜蛋白融合表達，展示在噬菌體顆粒的表面。噬菌體展示技術的基本原理和過程為：在絲狀噬菌體基因、基因的5端或基因的3端插入外源蛋白基因，噬菌體感染大腸桿菌使融合蛋白表達在噬菌體顆粒的表面。利用固定于固相支持物上的配基（抗體或受體等），親和吸附表達靶蛋白的噬菌體顆粒，得到的噬菌體顆粒再次感染大腸桿菌，擴增數量，再進行親和吸附，經過幾輪篩選，就能得到足夠的靶克隆。噬菌

13、體展示技術的優勢在于：展示的外源蛋白具有生物學活性；利用親和吸附可將極稀少的靶克隆富集出來，并且不必對配基的結構有深入了解，大大擴展了該項技術的使用范圍；外源靶蛋白及其編碼基因統一于同一個噬菌體內，極大方便了對基因序列的研究。蛋白質組學的應用：1、疾病的蛋白質組研究疾病特異性蛋白(disease specific proteins,DSPs)：通過測定體液和組織的蛋白質組, 尋找特異疾病的生物標記。DSPs水平的變化對于疾病診斷、治療和判斷愈后具有重要意義,還可以成為研究藥物的藥理或毒理作用的靶點。2、病原(bngyun)微生物的蛋白質組研究確定(qudng)致病菌毒力;尋找(xnzho)新的

14、診斷標記物;為疫苗的研制尋找新的候選抗原;闡明藥物抗菌作用機制與病菌耐藥性發生機理,為新的抗生素的研制尋找靶點 3、蛋白質組在藥物開發中的應用 疾病特異性蛋白的不斷發現為藥物設計提供了豐富的靶點。以DSPs為靶點,分析其分子結構,定向合成有效藥物成為藥物設計的理想模式。基因工程（gene engineering ）：又稱DNA重組技術（DNA recombination），是指將外源基因通過體外重組后導入受體細胞，并使其能在受體細胞內復制和表達的技術。分子克隆（molecular cloning ）：是指將目的DNA片段與載體重組，然后導入受體細胞，并在受體細胞中復制、擴增，以獲得該DNA分子

15、大量拷貝的技術。工具酶：限制性核酸內切酶：限制酶，是一類能識別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。DNA聚合酶DNA連接酶堿性磷酸酶T4多核苷酸激酶核酸酶S1回文結構（palindrome structure）：指雙鏈DNA分子上按對稱軸排列的反向互補序列（常為限制酶所識別）。粘性末端（sticky end）：指限制酶錯位切開兩條對稱軸互補DNA雙鏈所產生的末端。平末端（blunt end）：指限制酶平齊切開兩條對稱軸互補DNA雙鏈所產生的末端。同工異源酶（isoschizomers）：指來源不同，但能識別和切割同一位點的酶。同尾酶（isocaudarner）：指識別序列不同，但能產生

16、相同粘性末端的酶。大腸桿菌DNA聚合酶（ E . Coli DNA polymerase ）是單一多肽鏈的多功能酶，分子量為103kD，它具有3種酶活性： 5 3 DNA聚合酶活性 3 5 核酸外切酶活性 5 3 核酸外切酶活性Klenow片段的主要用途：補齊雙鏈DNA的3末端，同時可使3 末端DNA標記上同位素。cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈。DNA序列分析。 Taq DNA聚合酶（簡稱Taq 酶）是一種耐熱的DNA聚合酶，分子量為65Kd，最佳作用溫度是7080，Taq酶具有53 聚合酶活性和依賴于聚合作用的53外切酶活性。逆轉錄酶（reverse transcriptase）是依賴(

17、yli)RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，4種dNTP為底物，催化合成DNA，此過程稱為逆轉錄過程。逆轉錄酶是多功能酶。末端(m dun)脫氧核苷酰轉移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT，簡稱末端轉移酶）：分子量為60Kd，在二價陽離子存在下，催化脫氧核糖核苷酸轉移到單鏈或雙鏈DNA分子的3末端-OH上。末端(m dun)轉移酶的功能主要有： 在載體或目的基因 3末端加上互補的同質多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接。用于DNA 3末端的同位素探針標記。DNA連接酶（DNA ligase）：稱為基因工程的縫紉針，它的主要功能是催

18、化兩個互補粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的5磷酸基團與3羥基形成磷酸二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的DNA連接起來。 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的 5-磷酸基團。主要用途有：除去DNA片段上的5磷酸以防自身連接。在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素標記前，從RNA或DNA上除去5端的磷酸。 核酸酶S1可水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交分子中的單鏈部分。其主要作用有：除去粘性末端以產生平末端。除去cDNA合成時形成的發夾結構。分析RNA的莖環結構和DNA-RNA分子的雜交情況。載體（vector）：指能攜帶外源D

19、NA片段導入宿主細胞進行擴增或表達的工具。載體的本質為DNA。克隆載體：能將外源DNA在受體細胞中復制、擴增并產生足夠量目的DNA的載體。克隆載體應具備的特征：能自我復制并具較高的拷貝數。分子量一般 10Kb。帶有遺傳篩選標記。有適當的限制酶酶切位點，便于外源DNA的插入和篩選。質粒克隆載體的主要用途： 用于保存和擴增 2Kb目的DNA。 構建cDNA文庫。 目的DNA的測序。 作為核酸雜交時的探針來源。多克隆位點（multiple cloning sites，MCS）：載體上具有的多個限制酶的單一酶切位點。噬菌體（bacteriophage，phage）：指感染細菌的病毒。按其生活周期分為兩

20、種類型：溶菌性噬菌體、溶原性噬菌體。cos位點：噬菌體5末端含12核苷酸的互補單鏈順序，是天然的粘性末端。噬菌體載體的用途： 用作一般的克隆載體。 用于構建基因組或cDNA文庫（22Kb）。 用于抗體庫或隨機(su j)肽庫的構建。 核酸的序列(xli)分析。粘粒(cosmid)是由質粒和噬菌體的cos位點構建(u jin)而成。粘粒載體的特點：粘粒載體大小為46Kb，而插入外源基因長達4050kb。加入噬菌體頭部和尾部蛋白，可將粘粒包裝成類似于噬菌體的具感染能力的顆粒，容易進入大腸桿菌。粘粒進入細菌后則完全失去噬菌體的功能，而表現質粒的特性。表達載體是指能將外源基因在受體細胞中有效轉錄和正確

21、翻譯的載體。報告基因：是指處于待測基因下游并通過轉錄和表達水平來反映上游待測基因功能的基因，又稱報道基因。終止子：一個基因的3末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶識別并停止轉錄的功能。基因工程的基本步驟目的基因的獲取載體的選擇目的基因和載體的連接重組DNA導入受體細胞重組體的篩選和鑒定基因工程的基本步驟 分、切、接、轉、篩目的基因的獲取：1）從基因文庫中獲取2）逆轉錄合成cDNA3）人工合成DNA片段4）直接從染色體DNA中分離目的基因。基因組文庫（genomic library，G-文庫）是指含有某種生物全部基因隨機片段的重組DNA克隆群。目的基因和載體的連接：1)粘性末端連接：本

22、法適用于在質粒和目的基因上有相同單或雙酶切位點。2)平末端連接：1、質粒和目的基因上沒有相同的酶切位點。2、人工接頭：本法適用于在質粒和目的基因上沒有相同的酶切位點。3)通過同聚尾連接：本法適用于在質粒和目的基因上沒有相同的酶切位點。轉化（transformation）：是指以質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。感受態細胞(competent cell)：細胞膜結構改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細胞。雙抗生素篩選法：在含四環素和氨芐青霉素的平皿上都能夠生長的細菌只含有空載體，此篩選方法稱為雙抗生素篩選法藍白斑篩選法：當外源基因插入lacZ基因中MCS，lac -肽基因

23、閱讀框架被破壞，細菌內將無-半乳糖苷酶活性，結果重組克隆呈白色菌落，這是常用的藍白斑篩選法。變性（denaturation） ：在某些理化因素的作用下，維系DNA分子二級結構的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA由雙螺旋變成單鏈過程。紫外吸收增加：DNA變性后，DNA 溶液(rngy)的紫外吸收增強。增色(zn s)效應：DNA變性時其溶液OD260增高的現象。融解溫度（ melting temperature，Tm）：在熱變性過程中，紫外吸收增加(zngji)達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度或融解溫度。爆發式：熱變性是在變性溫度范圍內突發的躍變過程，很像結晶達到熔點時的融化現象，故

24、名融解溫度。狹窄性：變性溫度范圍很小。復性（renaturation）：指變性 DNA 在適當條件下，二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現象，它是變性的一種逆轉過程。退火（annealing）：熱變性DNA一般經緩慢冷卻后即可復性，此過程稱之為“退火”。核酸分子雜交（molecular hybridization）:兩條DNA鏈或兩條RNA鏈或一條DNA鏈和一條RNA鏈按堿基互補的原則締合成異質雙鏈的過程稱為分子雜交或核酸分子雜交。核酸探針（nucleic acid probe)：是指能與特定核苷酸序列發生特異性互補雜交，雜交后可用特殊方法檢測的已知被標記的核酸分子。選擇探針的基本原則

25、：高度特異性、探針的來源是否方便、制備探針的難易程度。核酸探針的類型：基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、寡核苷酸探針。cDNA(complementary DNA)：是指與mRNA互補的DNA分子。基因組DNA探針：來源：這類探針來源于某種生物的基因組，多為某一基因的全部或部分序列。 制備方法:基因克隆的方法、聚合酶鏈反應(PCR) 特點:多克隆在載體中的DNA片段，可無限繁殖，取之不盡。PCR制備探針簡便和省時。相對RNA而言，DNA探針不易降解，標記方法也較成熟。cDNA探針：特點:不存在內含子和高度重復序列，是一種較理想的核酸探針，尤其是用于基因表達的研究。 排除了RNA酶的影

26、響，現已成為分子生物學實驗室的常規實驗。 探針設計原則：探針長度：一般要求在1050bp。 GC含量為4060。 探針分子中應避免互補序列。 避免同一堿基連續出現，一般不能多于4個，如GGGG-或 -CCCC-。 借助計算機相應軟件與已知的各種基因序列進行同源性比較。 理想的探針標記物應具有以下特點：檢測物要靈敏、特異、穩定、簡便。標記物與探針結合后，應不影響雜交反應，尤其是雜 交特異性、穩定性和Tm值。標記物對環境污染(hunjng wrn)小，對人體無損傷，價格低廉。標記物對檢測(jin c)方法無干擾。 分子雜交(zjio)技術一般流程探針制備及標記（同位素或非同位素） 待測核酸樣品制備

27、（分離，純化）雜交（液相，固相，原位雜交）雜交后處理（去掉非特異雜交分子）顯示結果（顯色，發光，放射自顯影）結果分析原位雜交（In situ hybridization ）是以特定標記的已知序列的核酸分子作為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交并對其檢測的方法。原位雜交材料：石蠟包埋組織切片、冰凍切片、細胞涂片、培養細胞爬片原位雜交基本流程：細胞或組織切片的處理：玻片清洗、組織和細胞的固定增強組織的通透性和核酸探針的穿透性預雜交雜交雜交后漂洗結果檢測探針的選擇：檢測單個堿基改變選用寡核苷酸探針。檢測單鏈靶序列選用與其互補的DNA單鏈探針或RNA探針。長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶

28、核苷酸序列和病原體。100bp左右的探針適合原位雜交。基因芯片的應用：基因表達水平的檢測基因突變和多態性的檢測 基因芯片在藥物篩選中的應用預防醫學領域的應用 基因芯片在疾病診斷中的應用：感染性疾病診斷 、遺傳性疾病的診斷聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）技術是生命科學界的重大發明，是生物技術領域中最重要的四項生物技術（即細胞融合技術、分子克隆術、蛋白工程技術和基因擴增技術）之一。PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。通過體外（試管內）擴增，可以將目的基因（或靶基因）片段百萬倍的放大，從而達到極大地提高核酸分子檢測的靈敏度，理論上其檢測的靈敏度可

29、以達到一個細胞、甚至一個分子的水平。 PCR的應用：研究-基因克隆，DNA測序，分析突變診斷細菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構建，DNA測序，表達圖譜法醫犯罪現場標本分析腫瘤各種腫瘤檢測其他PCR技術的基本原理是DNA的半保留復制，在模板DNA、引物和四種(s zhn)dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應。PCR的特點：靈敏度高、簡便、快速、對標本(biobn)的純度要求低。PCR反應(fnyng)體系和反應條件引物設計基本原則：引物設計要求：(1)引物長度; (2)分布的均衡性;(3)引物二聚體及二級結構;(4)引物3端、5端的特異性(5)引物的內部穩定性;

30、 (6)引物的特異性(7)擴增區域的二級結構PCR擴增產物的檢測方法：凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳法 、聚丙烯酰胺凝膠電泳法 PCR-限制性片段長度多態性分析法（PCR-RFLP） 單鏈構型多態性分析法（PCR-SSCP）核酸探針雜交法 PCR產物測序 熒光PCRPCR-SSCP優點及作用：方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器，適合臨床實驗的需要，經實驗證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發現。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。不足之處：只能作為一種突變檢測方法，要最后確定突變的位置(wi zhi)和類型，還需進一步測序；電泳條件要求較嚴格。核酸

31、探針(tn zhn)雜交法：(1)點雜交（dot blot）(2)反向(fn xin)點雜交（reverse dot blot）(3)微孔板夾心雜交（microplate hybridization）(4)熒光探針雜交(5)Southern印跡雜交（Southern blot）PCR常見問題及分析：(1) 假陽性PCR產物是最主要的污染源。陽性對照的污染。標本之間的交叉污染。在采集標本時，其他污染源帶來的污染。使用帶有污染的試劑。(2) 假陰性假陰性是PCR反應中另一個易出現的問題。造成的原因也比較多。可以歸納以下幾方面原因。1)標本處理的原因。 處理標本時，靶DNA丟失。 處理標本時，雜質成

32、分沒有去除干凈，帶入PCR反應中抑制了Taq酶活性。 標本放置不當，模板發生降解（尤其是RNA）。2)PCR試劑問題。 引物設計不合理。 Taq DNA聚合酶失活。 Mg2+濃度過低或是沒有加。3)PCR擴增過程中的問題 PCR擴增儀故障。 PCR擴增反應液沒有加液體石蠟油。4) PCR產物鑒定中的問題 電泳時沒有加溴化乙錠。 電泳緩沖液和凝膠使用次數過多。 凝膠濃度過低，使擴增帶跑散。(3) 引物二聚體形成引物二聚體的原因有： 兩個相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對，特別是引物3端有互補區。 引物比例太高，可增加模板用量。 退火溫度過低。 熱循環次數過多。(4) 非特異性PCR產物造

33、成非特異性PCR產物的常見原因及其預防措施： 引物特異性不高或用量太大，應更換引物或降低用量；TaqDNA聚合酶質量(zhling)不好或用量太大，應更換酶或降低酶使用量； Mg2+濃度(nngd)過高，可適當調整其濃度；退火溫度(wnd)過低，可提高退火溫度；延伸時間過長，可減少延伸時間；熱循環次數過多，應適當增加模板量，減少循環次數。PCR技術的發展巢式PCR（nested PCR ）逆轉錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）多重PCR(multiplex PCR) ：多重PCR主要用于多種病原微生物的同時檢測或病原微生物、遺傳病及癌基因的分型鑒定。重

34、組PCR(recombinant PCR) 錨定PCR（anchored PCR, A-PCR） 不對稱PCR（asymmetric PCR） 反向PCR（inverse PCR） 擴增長片段PCR（long PCR，long-distance PCR） 免疫PCR(immuno-PCR) 原位PCR (in situ PCR)差示PCR（DD-PCR） 定量PCR 實時熒光定量PCR：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。與普通PCR的區別：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通

35、過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。普通PCR：對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析；無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測Ct值的定義： PCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產物量不恒定； Ct值則極具重現性熒光定量PCR的臨床應用遺傳疾病的早期診斷腫瘤的診斷抗病毒藥物療效的觀察、指導病情評估和預后判斷新藥驗證輸血源的篩選母嬰傳播的控制與觀察生物分子（Biomolecule）泛指生物體特有的各類分子，是自然存在于生物體中的分子的總稱，是組成生命的基本單位。生物大分子制備的一般步驟：根據

36、作用原理(yunl)生物分子的分離、純化可分為以下幾種類型：（1）根據分子極性大小和溶解度的不同，如溶劑(rngj)提取技術、鹽析法、分配層析(cn x)法、分級沉淀法等；（2）根據分子形狀和大小不同，如凝膠過濾層析等；（3）根據物質吸附性質不同，如選擇性吸附與吸附層析法等；（4）根據分子帶電性（電離性質）的差異，如離子交換層析、電泳、等電聚焦法等。（5）根據配體特異性，如親和層析。影響提取效果的因素：核酸分離純化的原則 一是保持核酸堿基序列的完整性。二是盡量清除其它分子的污染，保證核酸制品的純度。對于核酸的純化應達到以下三點要求： 1）核酸樣品中不存在過高濃度的金屬離子和對酶有抑制作用的有機

37、溶劑； 2）其它生物大分子如蛋白質、脂類和多糖分子的污染應降至最低程度； 3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時應去除RNA，提取RNA分子時應去除DNA。保持核酸的完整性 1）溫度不要過高(04)；(高溫破壞氫鍵) 2）控制pH值范圍(pH值4-10);(極端酸堿破壞磷酸二酯鍵) 3）保持一定離子強度; 4）減少物理因素對核酸的機械剪切力.酚抽提法：以含EDTA、SDS及無DNA酶的RNA酶裂解緩沖液破碎細胞，經蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復抽提至一定純度后，根據不同需要進行透析或沉淀處理獲得所需的DNA樣品。 質粒DNA的提取與純化的經典方法包括： 堿

38、裂解法、 煮沸裂解法、 SDS裂解法等生物小分子的提取純化：1、溶劑提取法2、水蒸氣蒸餾法 3、升華法 4、超臨界流體萃取法 5、超聲提取法 6、固相萃取法 代謝組(metabolome)是指一個細胞、組織或器官中所有代謝物的集合, 包含一系列不同化學型的分子, 比如肽、碳水化合物、脂類、核酸以及異源物質的催化產物等。代謝組學(metabonomicsmetabolomics)來源于代謝組一詞,是研究一個細胞(xbo)、組織或器官中所有小分子代謝組分集合的科學。代謝組學研究的目的是定量分析一個生物系統內所有代謝物的含量。 代謝(dixi)組學的特點：1.關注于內源性小分子化合物。2.對生物體系

39、中的小分子化合物進行定性(dng xng)定量研究3.內源性小分子化合物的上調和下調指示了與疾病、毒性、基因修飾或環境因子的影響。4.內源性化合物的特點用來表征疾病和藥物篩選。代謝組學的應用：藥物研發、疾病研究、植物代謝組學、微生物代謝組學、中藥現代化代謝組學分析技術氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS)：適用于揮發性的代謝物。對于非揮發性代謝物的分析需要經過化學衍生。多用于環境分析、大氣有毒氣體分析、某些疾病診斷等。液相色譜-質譜聯用技術 （LC-MS)：適合于沸點高、極性強、熱穩定性差的化合物。毛細管電泳-質譜聯用技術 （CE-MS)：適用于普通反相色譜柱不易保留的離子性代謝物的分離分析。核

40、磁共振技術 （NMR）：用于反映化合物結構中的H和C原子的位置信息。 代謝組學研究一般包括四個步驟：第一步，給予生物體一定的刺激。第二步，代謝組數據的采集。用核磁共振、質譜、色譜等分析手段測定其中代謝物的種類、含量和狀態以及其變化。第三步，建立表征代謝特征的時空模型。在代謝組學中最常用的建模方法是主成分分析(Principle Components Analysis, PCA)。第四步，建立代謝物時空變化與生物體特性的關系，達到從不同層次和水平上闡述生物體對相應刺激的響應的目的。代謝組學的一般研究過程 miRNA是由2125個核苷酸組成的非編碼RNA；它在生物體生長發育、細胞增殖、分化、凋亡以

41、及人類各種疾病的發生發展過程中發揮重要的調控作用。MicroRNA的特征：廣泛存在于真核生物中, 是一類內源性表達的非編碼短序列RNA, 本身不具有開放閱讀框 (ORF) ； 成熟的miRNA長度通常為2125nt； miRNA在進化上具有高度保守性； miRNA表達具有細胞和組織特異性，同時具有時序性 功能及機制：miRNA通過基因的轉錄后調控過程參與了生命體的發生、生長、發育、分化和死亡的各個過程。mRNA剪切 miRNA與靶mRNA幾乎完全互補； 切割位點在從5端起與miRNA配對的第10位和11位核苷酸之間 ； 由RISC中的內切酶催化完成； 可催化多個mRNA分子(fnz)的降解翻譯

42、(fny)抑制 miRNA與靶mRNA互補(h b)程度較低； 翻譯抑制可能發生在翻譯起始后的某一階段； 翻譯順利進行但翻譯產物可能被特異性降解基因治療：狹義概念將具有正常功能的基因置換或增補患者體內有缺陷的基因，從而達到治療疾病的目的。廣義概念將某種遺傳物質轉移到患者細胞內，使其在體內發揮作用，最終達到治療疾病的目的。基因治療的必備條件：1. 分子缺陷清楚2. 可以得到相應基因的克隆3. 病理生理機制已知4. 有利的風險-利益比5. 治療基因可以被調控6. 合適的靶細胞7. 有效安全8. 相關法規健全基因治療的總體策略針對致病基因而言：（1）基因矯正（gene correction） 對于致

43、病基因中的異常堿基進行精確修復，使其恢復正常功能； （2）基因置換（gene replacement） 用正常基因在原位替換致病基因，使細胞DNA完全恢復正常狀態； （3）基因增補（gene augmentation） 將正常基因導入患者體細胞內，使其整合到染色體中一起表達，以補償缺陷基因的功能 ，但致病基因未去除；（4）基因表達調節（modulation ） 指將特定的反義核酸、RNA干擾或核酶等技術抑制目的基因表達從而消除致病基因的作用。針對非致病基因而言（1）自殺基因 這種基因導入受體細胞后可產生一種酶，它可將原無細胞毒性或低毒藥 物前體轉化為細胞毒物質，將細胞受體細胞殺死，這種基因被稱為“自殺基因”。自殺基因導入腫瘤細胞后，可將腫瘤細胞殺死。但對正常細胞則無傷害作用。 （2）免疫基因治療 將某些(mu xi)細胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因導入腫瘤患者體內，以增強患者的抵抗力。 （3）耐藥基因治療 在腫瘤化療過程中， 把產生抗藥物毒性(d xn)的基因導入患者體內，從而使患者能耐受更大劑量的化療。其他(qt)根據