1、Ch6 生物酶工程生物酶工程（Biological Enzyme Engineering）： 是指在基因水平上，對酶蛋白分子進行修飾、改造，改進酶蛋白的催化特性或酶蛋白的蛋白質特性等。本章主要介紹 核酶、進化酶、雜合酶和抗體酶的有關基本概念和基本知識。1Ch6-1 核酶(Ribozyme)到目前為止，除了我們傳統概念的酶蛋白質外，還發現另一類具有催化活性的物質核酸。這里的核酶要和核酸酶（Nuclease）的概念區別開來，前者是酶的化學本質是核酸；后者是指催化核酸水解的酶，其化學本質是蛋白質；1981年Cech等發現四膜蟲的核糖體前體RNA可以在沒有酶蛋白存在的情況下，自身催化切除內涵子，完成加

2、工過程；發現了具有催化活性的RNA，從而提出了核酶這個概念。由于核酶具有很多與酶蛋白截然不同的特點，尤其在醫學界的優勢更為突出，用于基因治療可以克服一直困擾人們的免疫問題。所以近些年來引起了酶工程研究領域的極大熱情。 到目前為止，已經發現的天然核酶的作用底物都是核酸，按其催化反應可分兩類：剪切型核酶：這類核酶主要催化自身或異體RNA的切割，相當于核酸內切酶的作用。目前發現的剪切型核酶包括三種： 錘頭型核酶 R. Symons研究一些植物病毒RNA的自身剪切功能后，提出了錘頭狀二級結構模型； 發卡型核酶 發卡型核酶的二級結構象一個發卡裝，由50個堿基組成，它和底物的14個堿基共同構成一個發卡結構

3、，識別順序是NGUC，在N-G之間切割。 蛋白質RNA 復合酶 由蛋白質和M1RNA兩個部分構成，其中蛋白質的分子量2000Da，RNA部分函377個堿基。催化活性完全有RNA部分完成，蛋白質部分只是維護RNA的構象，主要功能是剪切修飾tRNA。剪接型核酶：這類核酶主要催化mRNA前體的修飾加工，切除內含子，并完成片段的拼接； 主要包括組內含子和組內含子。Cech 研究發現四膜蟲的核糖體RNA前體，具有自身切除413 堿基的intron，并進行片段的拼接功能，進一步研究發現，其Intron 本身具有催化RNA前體剪輯功能。脫氧核酶： 前述核酶的化學本質是RNA，在發現RNA核酶后，很快就發現了

4、切割RNA和DNA的DNA核酶。1994年，Breaker 利用體外選擇技術，首次發現了切割RNA的DNA分子，命名為脫氧核酶（DNAzyme）關于核酶的應用前景關于核酶的研究，主要目標是將其應用于基因治療，總體上講，目前處于研究階段。開發公司治療對象研究階段American CyanamidColumbia UniversityGene ShearsInnovirOsaka UniversityRibozyme Ph. Inc.Tokyo UniversityB細胞白血病-淋巴瘤人免疫缺陷病毒人免疫缺陷病毒乙肝病毒，丙肝病毒乙肝病毒，丙肝病毒丙肝病毒人免疫缺陷病毒血管生長因子丙肝病毒臨床前期

5、臨床前期一、二期臨床臨床前期臨床前期臨床前期一、二期臨床臨床前期臨床前期關于核酶用于基因治療研究存在的主要問題 體內運輸與細胞吸收及殘留問題： 切割位點的特異性選擇問題： 自身穩定性問題： 毒性和免疫原性問題：2Ch6-2 酶分子的定向進化（Directed Evilution）酶分子的定向進化是指在分子水平上，人為地創造特殊的進化條件，模擬自然進化機制（隨機突變、基因重組和自然選擇），對酶基因進行改造，并進行定向選擇，篩選出所需性質的酶蛋白。對酶蛋白分子的改造，主要包括兩個方面，即酶分子改造的合理化設計（Rational Design）和非合理設計（Irrational Design）合理化

6、設計：主要指事先已經搞清楚了酶蛋白的結構，有明確的修飾目標，定點改造某一結構活某氨基酸而設計的改造修飾方案，如酶蛋白的化學修飾、酶蛋白基因的定點突變等；非合理設計： 事先不必確定基因的改造修飾目標，設計酶蛋白基因改造技術和方法，設計基因改造方案，然后按照預定目標要求，進行篩選。酶分子的定向進化就屬于非合理設計。 1. 酶分子定向進化方法： 目前已經研究成功的酶蛋白分子定向進化方法只要包括一下幾個方面： 易錯PCR方法； DNA改組方法； 基因家族之間的同源重組方法； 易錯PCR法：易錯PCR是在利用PCR（Polymerase Chain Reaction）技術在Taq聚合酶的催化下，對目的基

7、因進行擴增，通過調整反應條件（提高Mg 2濃度、加入Mn 2 改變反應體系中四種dNTP的比例濃度等） ，改變Taq酶催化的目的基因擴增中的突變頻率，以一定的頻率隨機構件了基因突變庫，然后選擇或篩選符合需要的突變體。易錯PCR的關鍵在于一下兩點控制： 每個目的基因的突變堿基數要嚴格控制：突變率不應太高，太高時酶的基因突變太大，酶固有活力不易保持，太低不易實現酶分子的有效進化，一般理論上講每個靶基因導入的突變堿基數控制在1.55個； 一般一次突變很難獲得有用突變，所以在設計易錯PCR時，是設計連續易錯PCR 擴增，連續進行隨機突變，從而獲得符合進化目的的突變體。易錯PCR定向進化的應用實例：利用

8、易錯PCR定向進化L天冬氨酸酶實例設計工作程序：易錯PCR篩選突變體（優勢突變重組篩選）；研究結果： 獲得了一株酶活力提高28倍的突變體；并且進化酶的pH穩定性和熱穩定性都明顯優于原始酶。進一步測序研究表明進化后的突變體共發生了7個堿基突變，其中3個突變位點引起了氨基酸的改變Asn217Lys； Thr233 Arg； Val367 Gly3Ch6-2 酶分子的定向進化（Directed Evilution）DNA改組技術DNA改組技術是在易錯PCR方法基礎上發展起來的，設想經過易錯PCR獲得的兩個或兩個以上的正突變的突變體，如果將這些正突變的突變部位整合到一個突變體上，會獲得更為突出的定向進

9、化效果。具體方法是將多個正突變的突變體混合，然后用脫氧核糖核酸酶進行隨機切割，得到隨機DNA片段，然后進行PCR擴增，此時隨機DNA片段互為模版（Template）或引物（Primer），直到獲得全長基因片段后，進行分離和篩選，以獲得高效突變體。基因家族之間的同源重組本定向進化方法是利用自然界中天然存在的基因家族出發，利用它們之間的同源順序進行重組，這種方法獲得高效突變的幾率較大，并且盲目性小，容易獲得理想的進化效果。研究報道實例：Stemmer等利用來自4種微生物編碼頭孢菌素酶的基因進行同源重組進化研究，獲得了進化重組體的產酶活性提高了270倍。2.酶分子定向進化的酶工程意義酶分子定向進化研

10、究實踐表明， 在改造、修飾酶蛋白分子方面主要體現以下幾點： 提高酶分子的催化活力 提高酶的催化活力始終是酶工程研究的最實際、最有價值的研究熱點之一。關于定向進化提高酶催化活力的實例前已列舉，這里提高酶催化活力和提高產酶菌株的產酶活力的概念要加以區別，酶分子的定向進化是通過對酶蛋白分子進行改造來實現的酶活力提高；但傳統的在酶工程研究領域，對產酶菌株進行誘變育種、培育，實現產酶活力的提高，后者不排除有導致酶蛋白分子發生改變的可能，但更重要的是通過點突變，改變細胞的代謝調控機制而實現產酶活力的提高。 改善酶蛋白的穩定性：提高酶蛋白的穩定性，尤其是熱穩定性提高，是酶工程研究的另一研究熱點。因為在關于生

11、產中，提高反應溫度，可以提高底物的溶解度、降低反應介質的黏度，提高酶的催化活力，特別是防止在生產過程中的微生物污染。Zhao H 等在對枯草桿菌蛋白酶進行定向進化研究中，取得了很大成功，他們利用易錯PCR 和突變體的DNA 改組方法，并進行提高溫度的篩選條件進行重組體的篩選，使枯草桿菌蛋白酶的最適催化溫度提高了17（65） 在最適溫度下的半衰期增加了200倍。 改善酶蛋白的底物專一性 根據酶蛋白在生產中的應用特點，可以有目標地通過分子定向進化，提高或降低底物專一性。通過定向進化，降低Km值的實例很多，通過對進化酶蛋白的動力學研究，證明很多通過催化效率的進化酶的Km值大大降低。 通過酶蛋白分子對

12、應用環境的適應能力 許多酶蛋白催化適應環境是在長期生物體內的催化環境進化形成的，而在使用中，很難模擬體內的催化環境，通過定向進化，可以提高酶蛋白對催化環境的適應能力。如：在洗滌劑生產中，添加枯草桿菌蛋白酶，以增加洗滌劑去污能力，添加去脂肪酶增加去油漬的能力，而這些酶需要有特定的金屬離子作為配基時，才能發揮良好的催化活性，而在洗滌過程中，往往在洗滌劑中都加有去離子熬合劑，對酶蛋白不利，利用定向進化改造酶蛋白的適應環境極為必要。Bryant報道利用定向進化方法，對枯草桿菌蛋白酶改造，去除了結合Ca的環突結構，獲得了一株產不依賴Ca蛋白酶的枯草桿菌菌株。4Ch6-3 酶基因的定點突變定點突變是對已知

13、序列的基因(或DNA)中任意指定位置進行突變的技術，它又可以分為寡核苷酸誘導和寡核苷酸置換兩大類。分別適用于不同類型的預先確定突變氨基酸位置的突變實驗。5Ch6-3 酶基因的定點突變1.寡聚核苷酸誘導的定點突變這項技術主要是利用帶有預定突變序列的寡核苷酸單鏈引物，在體外與原基因序列退火，誘導合成少量完整的突變基因，然后，通過體內增殖得到大量的突變基因。這類技術的最早應用是Hutehison和Razill等人，分別用合成的寡核苷酸引物誘導了X174單鏈噬菌體DNA嘌吟點突變。后來，逐漸改用M13單鏈噬菌體DNA作為基因載體，突變技術也日趨成熟。 定點突變的基本操作程序： (1)將酶基因(包括結構

14、基因和起動基因)克隆到M13(一種單鏈DNA噬菌體)上(或質粒上)，由此得到模板(以下稱“正鏈”)。 (2)化學合成含有所需突變順序的寡核苷酸引物，這段“突變引物”的核苷酸順序，除預定突變的部位外，其余的順序與“正鏈”互補。 (3)合成含突變順序的雙鏈M13 DNA，即是將合成的突變引物5端磷酸化后，與“正鏈”DNA退火，這時突變引物與“正鏈”的欲突變部位，形成含錯誤配對的雙鏈，然后加入DNA聚合酶(常用大腸桿菌DNA聚合酶I)和四種dNTP，將引物延伸，合成全部互補的雙鏈、并由T4噬菌體DNA連接酶封口，得到共價閉環雙鏈DNA(cccDNA)。并用超離心或凝膠過濾等技術分離純化雙鏈DNA。

15、(4) 將雙鏈DNA轉染受體菌(例如大腸桿菌F株)使其擴增。從所得到的噬菌斑分離單鏈DNA。經印跡轉移至硝酸纖維素薄膜上，把上述突變引物標記532P作為探針，進行雜交(退火)，此時突變型單鏈DNA與探針全部互補，而野生型(未突變者)與探針之間，存在錯誤配對，在高溫洗滌時，這種互補鏈，易解鏈，探針被洗掉，因而留下來的互補鏈，可能是突變酶基因的鏈。 (5)由篩選到的含突變酶基因的受體菌株，進一步純化，分離DNA，測定突變部位的順序，與預定序列相符者，即為所要求的突變酶基因。 (6)將含有突變酶基因的M13，轉化高效表達體菌、溶菌后即可收得大量的突變酶。這個方法有許多重要的優點: 它可以精確地在基因

16、的預定位置導入任何所需的突變，并有有效的篩選手段取得突變基因； 它對目的基因本身的結構沒有任何附加要求(如要求它在某處具有某種限制位點之類)，可以直接地用于各種需要突變的基因； 這個方法步驟比較簡單、技術比較成熟，因此，目前在蛋白質工程研究中得到了廣泛的應用。這個方法也有一些缺點，最突出的一個缺點是突變基因產率較低，噬菌體后代帶有所需突變的比率常常遠低于理論值(50)。在某些場合，尤其當需要進行較多突變工作時，突變率低是很不利的，近年來，針對這一缺點，提出了許多改進方案。6Ch6-3 酶基因的定點突變2.寡聚核苷酸置換的定點突變 寡核苷酸誘導的定點突變法，只適用于將蛋白質中的某一氨基酸，轉變為

17、預定的另一種氨基酸。但如果事先不能確定轉變產物，需將每一種可能代替的氨基酸逐一實驗的時候，就要同時進行某一位點的多種突變。適合這類要求的突變方法，就是寡核苷酸置換的定點突變法。 這類方法的特點是，用帶有各種所需突變序列的寡核苷酸，在體外直接置換目的基因中欲變部位而實現突變。因為是直接置換，所以不需要進行退火和誘導合成。然而置換過程需要限制性酶切和連接酶連接，所以必須在雙鏈DNA之間進行。寡核苷酸是雙鏈，目的基因及其載體(質粒或 Phage M13)也是雙鏈。盒式突變(Cassette mutagenesis) 本方法是這類技術的代表。所謂盒(Cassette)就是指與目的基因欲變部位相應的化學

18、合成的一系列雙鏈寡核苷酸，它們帶有各種能選用的突變序列。當進行突變處理時，根據實驗需要把各種突變“盒”插入目的基因中，猶如把盒式錄音帶插入錄音機一樣，非常靈活方便，用此技術可使蛋白質中某種氨基酸殘基一次分別為多種氨基酸取代。實例： 枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin)的活性中心涉及Ser-221殘基，與其鄰近的是Met-222。由于Met-222的存在，使該酶易被氧化失活。因為事先無法確定哪種氨基酸取代Met-222后會既改善對氧化的穩定性，又不致劇烈降低酶的活力，故采用這種盒式突變技術對該酶進行修飾。完整的枯草桿菌蛋白酶的基因在質粒PS4.5的一個1.5Kb的EcoR I-BamHI消化片

19、段中。 將此片段連接到噬菌體M13mp9上，構成一個單鏈重組噬菌體DNA(M13mp9 SUBT)。 合成一個38體寡聚脫氧核苷酸引物，該引物缺失包括Met-222在內的10個核苷酸，并在其兩側分別創造了限制酶Kpn I和Pst I的新切點。 以此核苷酸為引物，以M13mp9SUBT為模板，在DNA聚合酶I(Klenow)和T4 DNA連接酶催化下體外復制成新的突變DNA分子。 用EcoRI-BamH I 消化后獲得的DNA片段，再克隆到穿梭質粒pBS42上，獲得質粒p222。 用限制酶Kpn I和Pst I消化這個質粒，形成切口，將5種雙鏈25體寡核苷酸混合物(庫)在連接酶催化下插入切口，形成五種不同的重組質粒。 用此混合質粒轉化大腸桿菌，培養后提取質粒。分離單菌落的質粒DNA，測定DNA序