1、生化制備概論一 制備主要對象及特點蛋白質：易降解 易變性 多樣性 多種因素影響活性 核酸 ： 分子量大，易被機械切割力破壞（基因組DNA）易降解（酶解）特別是RNA 常與核蛋白質結合 多糖 ： 成分復雜多樣，分析困難，糖苷同樣也會被多種酶降解脂類： 種類多，成分復雜，分析儀器要求較高二 物質的提取與緩沖溶液針對蛋白質的操作一般要注意的問題：基本原則：防止生物分子變性、降解 1控制適當的pH 2控制低溫 3注意提取過程中的溶液環境 4防止提純過程中丟失一些輔助因子或亞基1 低溫 04度。2 緩沖溶液提取操作，適度的離子(鹽)濃度。3加保護劑酶抑制劑，如巰基乙醇、DTT,，Vc,PVP,重金屬絡合

2、劑，酶的底物 蛋白酶抑制劑等等4操作連續，盡量快速。5 避免劇烈攪拌。蛋白質的溶液提?。ǔ樘幔┧芤禾崛。捍蟛糠值鞍踪|均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質的提取一般以水為主。稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質穩定性好、溶度大，是提取蛋白質的最常用溶劑。鹽濃度等滲鹽溶液尤以0.020.05mol/L 磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用。0.15mol/L 氯化鈉溶液應用也較多。如6-磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/L 碳酸氫鈉液提取等。有時為了螯合某些金屬離子和解離酶分子與其他雜質的靜電結合，也常使用枸櫞酸鈉緩沖液和焦磷酸鈉緩沖液。有些蛋白質在低鹽濃度下濃度低，如脫氧核糖核蛋白質需用1mol/L 以

3、上氯化鈉液提取PH 值：蛋白質提取液的PH 值首先應保證在蛋白質穩定的范圍內，即選擇在偏離等電點兩側。如堿性蛋白質則選在偏酸一側，酸性蛋白質選擇偏堿一側，以增大蛋白質的溶解度，提高提取效果l 細胞破粹方法：1、高速組織搗碎：將材料剪小，放置于筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關后，逐步加速至所需速度。此法適用于動物內臟組織、植物肉質種子等l 2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。l 3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多

4、適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100 毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱，應采取相應降溫措施。對超聲波敏感物質和核酸應慎用。l 4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。l 5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。6滲透沖擊：用蒸餾水沖擊細胞或經過高滲液處理（平衡）過的細胞，讓細胞內容物釋放出來無論用哪一種方法破碎組織細胞

5、，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入對苯甲基磺酰氟（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部。 表面活性劑的利用：對于某些與脂質結合的蛋白質和酶，也有采用表面活性劑如膽酸鹽及十二烷基磺酸鈉等處理。表面活性劑有陰離子型（如脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽及膽酸鹽等），陽離子型（如氧化芐烷基二甲基銨等）及非離子型（Triton X-100 、 NP-40等 ）、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。非離子型表

6、面活性劑比離子型溫和，不易引起酶失活，使用較多。對于膜結構上的脂蛋白和結構，己廣泛采用膽酸鹽處理，兩者形成復合物，并帶上凈電荷，由于電荷再排斥作用使膜破裂。近年來研究膜蛋白使用表面活性劑的稀溶液提取時，較喜歡用非離子型表面活性劑。 膜蛋白提取注意事項 常用去垢劑：SDS Tween 20 40 Triton X-100 CHAPS三 蛋白質的基本操作 鹽析 中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現象稱鹽析 分段鹽析，有機溶液沉淀 目的 純化 濃縮 保存 注意事項影響鹽析的因素

7、有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶解度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶解度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉淀出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質

8、和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。樣品保存l 溶液狀態 冷藏保、 冷凍保存 、液氮保存l 干粉狀態 真空干燥、噴霧干燥、冰凍干燥、 脫脂樣品、丙酮干粉蛋白質含量的測定變性不溶解蛋白質 凱氏定氮法 “可溶”蛋白質（蛋白質溶液） 1 雙縮脲法（Biuret assay） 2 勞里反應（Lowry assay）Folin-酚法 3 巴福得測定法（Bradford assay ）標準曲線 4 UV(紫外分光光度)法 l Absorbance assaysl Absorbanc

9、e at 280 nm Range: 20 micrograms to 3 mg Volume: Depends on cuvette - volumes range from 200 microliters to 3 ml or greater Accuracy: Fair Convenience: Excellent, if equipment available Major interfering agents: Detergents, nucleic acids, particulates, lipid droplets l Absorbance at 205 nm Range: Ro

10、ughly 1 to 100 micrograms Volume: Depends on cuvette - volumes range from 200 microliters to 3 ml or greater Accuracy: Fair Convenience: Very good Major interfering agents: Detergents, nucleic acids, particulates, lipid droplets l Colorimetric assaysl Modified Lowry Range: 2 to 100 micrograms Volume

11、: 1 ml (scale up for larger cuvettes) Accuracy: Good Convenience: Fair Major interfering agents: Strong acids, ammonium sulfate l Biuret Range: 1 to 10 mg Volume: 5 ml (scale down for smaller cuvettes) Accuracy: Good Convenience: Good Major interfering agents: Ammonium salts l Bradford assay Range:

12、1 to 20 micrograms (micro assay); 20 to 200micrograms (macro assay) Volume: 1 ml (micro); 5.5 ml (macro) Accuracy: Good Convenience: Excellent Major interfering agents: None 針對核酸的操作一般要注意的問題基本要求：盡量保持被分離核酸的完整性，除去影響下步操作的物物質。 高分子量的DNA（核DNA） 操作主要注意的是它易被機械 切割力破壞 RNA操作的主要障礙是“無處不在”的RNA酶的降解STORAGE：（儲存）5oC is

13、 one of the best and simplest conditions for storing DNA. -20oC: this temperature causes extensive single and double strand breaks. -70oC is probable excellent for long-term storage. For long-term storage of DNA, it is best to store in high salt (>1M) in the presence of high EDTA (>10mM) at pH

14、 8.5. Storage of DNA in buoyant CsCl with ethidium bromide in the dark at 5oC is excellent. There is about one phosphodiester break per 200 kb of DNA per year. Storage of DNA in the phage is better than storing the pure DNA.QUANTITATION.（定量）. For pure solutions of DNA, the simplest method of quantit

15、ation is reading the absorbance at 260 nm where an OD of 1 in a 1 cm path length = 50 ug/ml for double-stranded DNA, 40 ug/ml for single-stranded DNA and RNA and 20-33 ug/ml for oligonucleotides. An absorbance ratio of 260 nm and 280 nm gives an estimate of the purity of the solution. Pure DNA and R

16、NA solutions have OD260/OD280 values of 1.8 and 2.0, respectively. This method is not useful for small quantities of DNA or RNA (<1 ug/ml).RNA 操作注意事項與實驗技巧l 1.如果可能，實驗室應辟出專門RNA操作區，離心機、移液槍、試劑等均應專用。RNA操作區應保持清潔，并定期進行消毒。l 2.操作過程中應自始至終佩戴拋棄式橡膠或乳膠手套，并 經常更換，以避免將手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶入試管或污染用具。盡量避免使用拋棄式塑料手

17、套。塑料手套不貼身，常常造成操作不 便，而且多出部分還容易在器具上遭RNA酶污染并向未污染處傳遞，擴大污染。l 3.盡量使用一次性槍頭、離心管等塑料制品，盡量避免與 其它實驗共享器具，以防止交叉污染。推薦使用出廠前已經滅菌的槍頭和離心管，大多國外廠商供應的無菌塑料制品很少有RNA酶污染，買來后可直接用于RNA 操作。許多研究者用DEPC等處理的塑料制品，往往由于二次污染而帶有RNA酶，從而導致實驗失敗。l 4.配制溶液用的酒精，異丙醇、Tris等應采用未開封的新品。溶液需用DEPC水配制（加0.01%(體積比)DEPC至重蒸水或Mili Q級水中，處理過夜，滅菌即成DEPC水）l 5.所有玻璃

18、制品都必須在240烘烤4小時。所有舊塑料制品都必須用0.5M的NaOH處理10分鐘，并用DEPC-H2O徹底沖洗后滅菌，也可考慮用 0.01%的DEPC水浸泡過夜，然后滅菌，烘干。無法用DEPC處理的用具可以用氯仿擦拭若干次，這樣通常可以消除RNA酶的活性。樣本保存的注意事項：樣本一旦從生物體中分離后，細胞內的RNA就變得非常不穩定，容易降解。因此取樣后，如何保證取樣前后基因的表達模式不變，就變得非常重要。傳統方法是用液氮速凍，再放到超低溫冰箱中保存。核酸提取分離純化的基本操作細胞和組織的破粹酶處理酚-氯仿抽提 乙醇沉淀 梯度離心 堿變性和復性 柱純化、分級分離 電泳及分析 核酸的檢測和定量分

19、析基因組（核）DNA的提取 1 堿裂解法 煮沸法堿裂解的原理：堿裂解抽提質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性和復性的差異而達到分離目的。在堿性條件下，線性大分子細菌染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構互補鏈變性解開。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀結構的兩條互補鏈不會完全分離。當用pH4.8的NaAc高鹽緩沖液調其pH值至中性，變性的質粒DNA又恢復到原來的構型，保存在溶液中為可溶狀態。而染色體DNA不能復性，形成纏連的網狀結構。通過離心將細胞碎片，染色體DNA與不穩定的大分子RNA，蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來被除去，質粒DNA則存在于上清中。 &#

20、160;  堿裂解法是一種應用最為廣泛的制備質粒DNA的方法，對于小量制備的質粒DNA，經過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質和RNA，所得純化的質粒DNA已可滿足細菌轉化、DNA片段的分離和酶切、常規亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學實驗室中常用。層析(色譜)技術 薄層層析 薄層層析是將作為固定相的支持劑均勻地鋪在支持板（一般是玻璃板）上，成為薄層，把樣品點在薄層上，用適當的溶劑展開，從而使樣品各組分達到分離的一種層析技術。 （一）原理：如果支持劑不同其層析的原理也不同： 如果支持劑是吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酰胺等，層析時主要是依據吸附力

21、的不同進行層析分離，則稱之為薄層吸附層析；如果支持劑是纖維素、硅藻土等，層析時主要是依據分配系數的不同進行層析分離，則稱之為薄層分配層析；如果支持板上鋪上離子交換劑，層析主要依據是離子交換作用，則稱之為離子交換層析；薄層若由凝膠過濾劑制成，主要依據相對分子質量的大小而分離的則稱之為薄層凝膠層析等。這幾種薄層層析的原理各不相同，但其操作技術即大同小異。 薄層層析的優點： 1、快速、展層時間短，一般僅需1560分鐘。 2、設備簡單，操作方便。   3、分辨力比紙層析高10100倍，它既能分離0.01g的微量樣品，又能分離500甚至更多的樣品，也適用于制備。制備可規格化。   4

22、、點樣后可立即展開，不受溫度和溶劑飽和程度的影響，易控制。所以操作時比紙層析少一個“平衡”步驟。 5、可以使用腐蝕性顯色劑（用淀粉做粘合劑的薄板除外）。其缺點是Rf值的重現性比紙層析差，對生物大分子物質的分離效果不大理想 薄層板常用的制作方法有：1、浸涂法 2、噴涂法 3、傾斜涂布法（傾淌法）4、推鋪法Applications of TLC：l Identification of unknown compoundl Qualitative analysis of unknown mixturel Determination of sample purityl Monitor the cours

23、e of reactionsl Determine the solvent system that works well for column chromatograpy各類層析的原理和載體類別 分離原理 基質或載體吸附層析 化學、物理吸附 硅膠、氧化鋁 、羥基磷酸分配層析 兩溶劑相中的溶解效應 纖維素、硅藻土 、硅膠 凝膠層析 分子篩效應的排阻效應 sepharose 、sephadex離子交換層析 離子基團的交換反應 離子交換樹脂 、纖維素、 葡聚糖親和層析 分離物與配體之間有 帶配基的sepharose或 特殊親和力 sephadex聚焦層析 等電點和離子交換作用 多緩沖交換劑（與帶有多

24、種電荷 基團的配體相偶聯的sepharose 6B）用于蛋白質分離層析的主要分類l 離子交換層析：容量大，分離效果好，樣品體積不受限制，抗污染力強，有濃縮作用的優點。l 操作過程：1.交換劑的選擇 2交換劑的預處理 典型 鹼洗-水洗-酸洗-水洗-上樣緩沖液平衡（裝柱后）3色譜柱的規格 樣品組成復雜量多時 20 30cm 相反510cm4裝柱 上樣 上樣量一般是理論負載量的1/35洗脫 分步（段）洗脫 連續梯度洗脫分配層析 分配層析是利用各組分的分配系數不同而予以分離的法。 分配系數是指一種溶質（AA）在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時該溶質在兩相溶劑中的濃度比值。在層析條件確定后分配系數是一

25、常數，以K表示。凝膠過濾應用1 脫鹽 常用sephadex G25 外水體積測定 藍色葡聚糖2 分組分離（組別分離）短柱3 分級分離 生物大分子純化 長柱4 分子量測定電泳技術傳統電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）l PAGE是在區帶電泳原理的基礎上，以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠(PAG)作為支持物，采用電泳基質的不連續體系(即凝膠層的不連續性、緩沖液離子成分的不連續性、pH的不連續性及電位梯度的不連續性) 或 連續體系（一層凝膠、一種pH和一種緩沖溶液），進行電泳分離一種方法。l 不連續PAGE三種效應：電荷效應、分子篩效應和濃縮效應SDS-PAGE 當SDS（Sodium Dodecyl

26、 Sulfate）與蛋白質結合后，蛋白質分子即帶有大量的負電荷，并遠遠超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質分子間的電荷差別就降低乃至消除了。與此同時蛋白質在SDS的作用下結構變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS -蛋白質復合物在電泳時產生的泳動率差異，就反映了分子量的差異。在此條件下，樣品分子量的對數與其在凝膠中的遷移率呈直線關系。可用下式表示： Log Mr=a bmr 樣品全蛋白組成分析 應用: 測定蛋白質分子量 測定蛋白質亞基數電滲毛細管電色譜（capillary electro chromatography，CEC）以內含色譜固定相的毛細管為分離柱，兼具毛細管電泳及高效液相色譜的雙重

27、分離機理，既可分離帶電物質也可分離中性物質。毛細管電色譜法是用電滲流或電滲流結合壓力流來推動流動相的一種液相色譜法。l 毛細管電色譜法可以說是HPLC和HPCE 的有機結合，它不僅克服了HPLC 中壓力流本身流速不均勻引起的峰擴展，而且柱內無壓降，使峰擴展只與溶質擴散系數有關，從而獲得了接近于HPCE 水平的高柱效，同時還具備了HPLC 的選擇性。l HPLC是用壓力驅動流動相。流速是隨填充微粒的大小和柱長而變化的。流速在管中呈拋物線輪廓，因而造成了色譜峰譜帶的展寬，降低了柱效。而CEC是采用電場推動流動相。其線速度是與柱的直徑和填微粒的大小無關的，因而在毛細管中幾乎沒有流速梯度。譜帶展寬效應

28、相應的就十分小。這點是CEC與HPLC的本質差別，也是CEC效率高于HPLC的根本 六 毛細管等速電泳（capillary isotachophoresis ，CITP）1. 將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導離子(充滿毛細管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。 2. 負離子分析時，前導電解質的淌度大于試樣中所有負離子的。所有試樣都按前導離子的速度等速向陽極前進，逐漸形成各自獨立的區帶而分離。陰極進樣，陽極檢測3. 不同離子的淌度不同，所形成區帶的電場強度不同(=E)，淌度大的離子區帶電場強度??； 沿出口到進口，將不同區帶依次排序1、2、3、4× × × ×電場強度依次增大。假設“2”號中離子擴散到“3”號，該區電場強度大，離子被加速，返回到“2”區；當“2”號中離子跑到“1”號區，離子被減速使之歸隊； 4. 特點：界面明顯，富集、濃縮作用；雙向電泳第一向進行等電聚焦，蛋白質沿pH梯度分離，至各自的等電點；隨后，再沿垂直的方向進行分子量的分離(SDS-PAGE)  蛋白質組(Proteome): 由一個基因組(genOME)，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質蛋白質