1、會計學1Bt伴胞晶體毒蛋白的結構功能和應用伴胞晶體毒蛋白的結構功能和應用第1頁/共73頁 Bacillus thuringiensis (Bt)Sporulated cultureCrystal第2頁/共73頁第3頁/共73頁蘇云金芽胞桿菌能產生7種毒素蛋白-內毒素-外毒素-外毒素-外毒素不穩定外毒素水溶性毒素鼠因子外毒素CryCryCryCryCry-Cyt第4頁/共73頁第5頁/共73頁第6頁/共73頁第7頁/共73頁本實驗室主要研究內容：第8頁/共73頁1.毒素蛋白的基本特征和分類毒素蛋白的基本特征第9頁/共73頁米粒狀晶體 YBT-1518毒素蛋白的基本特征球形晶體B.thuringi

2、ensis M15菱形晶體第10頁/共73頁毒素蛋白的分類 第11頁/共73頁毒素蛋白的分類 第12頁/共73頁毒素蛋白的分類 第13頁/共73頁毒素蛋白在Bt中的分布 第14頁/共73頁2.毒素蛋白的結構和功能 第15頁/共73頁Cry5BaCry1Aa2.毒素蛋白的結構和功能 第16頁/共73頁 Swiss-PdbViewer顯示Cry蛋白三維模型IIIIIIPymol顯示Cry蛋白三維模型2.毒素蛋白的結構和功能 第17頁/共73頁Pymol預測蛋白質表面相對靜電荷2.毒素蛋白的結構和功能 第18頁/共73頁Molsoft預測cry蛋白活性位點2.毒素蛋白的結構和功能 第19頁/共73頁

3、2.毒素蛋白的結構和功能 2.1 結構域：第20頁/共73頁2.1.1“鉛筆刀”模型： 第21頁/共73頁傘狀模型2.1.2 “傘狀模型” ： 第22頁/共73頁2.1.3 “5螺旋六聚體”模型： 第23頁/共73頁 2.2 結構域： 第24頁/共73頁2.3 結構域： 第25頁/共73頁2.4 三個結構域之間的相互作用 第26頁/共73頁第27頁/共73頁3.毒素蛋白與昆蟲的作用機理 毒素蛋白與昆蟲受體的相互作用模式： 第28頁/共73頁毒素蛋白與昆蟲受體的相互作用模式： 第29頁/共73頁毒素蛋白與昆蟲受體的相互作用模式： 第30頁/共73頁第31頁/共73頁3.2 毒素蛋白受體： 第32

4、頁/共73頁3.2.1 APN(aminopeptidase N) 第33頁/共73頁3.2.1.1 APN受體結合的毒素種類 第34頁/共73頁3.2.1.2 APN受體對毒素插入質膜的介導 第35頁/共73頁昆蟲中腸 APN受體與 Bt 殺蟲毒力 第36頁/共73頁3.2.2 類鈣粘蛋白(Cadherin-like) 第37頁/共73頁棉鈴蟲中腸類鈣粘蛋白結構模型 3.2.2 類鈣粘蛋白(Cadherin-like) 第38頁/共73頁堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase ，ALP ） 第39頁/共73頁3.2.4 其他的毒素受體 Glyco-conujgate recep

5、tor第40頁/共73頁毒素蛋白的應用 4.1 Bt在農業生產中的應用 第41頁/共73頁 Bt的主要產品劑型 蔬菜蔬菜-水劑，撒粉劑水劑，撒粉劑水稻水稻-油劑，粉劑油劑，粉劑林木林木-油劑，粉劑油劑，粉劑衛生衛生-漂浮粒劑漂浮粒劑4.1 Bt在農業生產中的應用 第42頁/共73頁Bt 的主要市場4.1 Bt在農業生產中的應用 第43頁/共73頁 主要防治對象小菜蛾小菜蛾菜青蟲菜青蟲棉鈴蟲棉鈴蟲玉米螟玉米螟稻稻 螟螟松毛蟲松毛蟲蚊子幼蟲蚊子幼蟲 4.1 Bt在農業生產中的應用 第44頁/共73頁4.1 Bt在農業生產中的應用 第45頁/共73頁4.2 Bt毒素在抗病方面的應用 第46頁/共73

6、頁白血病T細胞正常T細胞肝癌正常肝細胞4.2 Bt毒素在抗病方面的應用 Cell survival %Toxin proteins g/ mL Cell survival %Toxin proteins g/ mL Toxin proteins g/ mL Toxin proteins g/ mL Cell survival %Cell survival %第47頁/共73頁白血病T細胞宮頸癌細胞4.2 Bt毒素在抗病方面的應用 Cell survival %Toxin proteins g/ mL Cell survival %Toxin proteins g/ mL 第48頁/共73頁4.

7、3 利用分子生物學技術定向進化毒素蛋白基因 第49頁/共73頁4.3.1 新的毒素基因的鑒定與克隆 4.3.1.1 Bt140菌株中cry2Ac6新基因的克隆： 第50頁/共73頁 中其他功能基因的擴增 第51頁/共73頁4.3.2. 利用生化和分子生物學技術定向改造毒蛋白 4.3.2.1 利用基因定點突變技術，提高毒蛋白殺蟲毒力 第52頁/共73頁4.3.2.1 利用基因定點突變技術，提高毒蛋白殺蟲毒力 第53頁/共73頁Cry蛋白中18- 19loop的結構與序列比對4.3.2.1 利用基因定點突變技術，提高毒蛋白殺蟲毒力 第54頁/共73頁Cry1Aa蛋白結構，18- 19loop及與其

8、相鄰的殘基4.3.2.1 利用基因定點突變技術，提高毒蛋白殺蟲毒力 第55頁/共73頁4.3.2.1 利用基因定點突變技術，提高毒蛋白殺蟲毒力 第56頁/共73頁Bt4基因組易錯PCRCry1AcPCR回收TA克隆篩選PCR回收pET28aBL21表達毒素基因cry1Ac核心區改組文庫通過易錯PCR和DNA shuffling定向改造毒蛋白，提高毒力 第57頁/共73頁突變子的表達1、對照Cry-B(1Ac）2、突變子T524N 3、Cry-B陰性對照 M、Maeker通過易錯PCR和DNA shuffling定向改造毒蛋白，提高毒力 第58頁/共73頁通過易錯PCR和DNA shufflin

9、g定向改造毒蛋白，提高毒力 第59頁/共73頁16小時32小時對照vip3基因在Bt無晶體突變株XBU001中的表達4.3.3 工程菌構建 4.3.3.1 中vip基因的克隆表達及重組殺蟲工程菌構建 第60頁/共73頁4.3.3.2 攜帶異源毒素基因的Bt工程菌的構建 pH5AXI（ hwtx-XI ）在菌株中的表達 1,Bt4.0718; 2-4, Bt4.0718(pH5AXI). 第61頁/共73頁采用EGFP抗體(A)和-ACTX 抗體(B)對Cry1Ac-ACTX-Hv1a-egfp融合蛋白的Western-blot檢測 工程菌伴胞晶體的原子力顯微鏡檢測A、Cry1-B(1Ac-AC

10、TX-EGFP) B、Cry1-B(1Ac）4.3.3.2 攜帶異源毒素基因的Bt工程菌的構建 第62頁/共73頁5.蘇云金芽胞桿菌蛋白質組學研究 5.1 Bt殺蟲晶體蛋白質組研究 第63頁/共73頁 A B C D（A）、Bt武漢亞種（B）、和以色列亞種H14(C)、伴胞晶體殺蟲晶體蛋白的雙向電泳及其與HD-1殺蟲晶體蛋白的gel spot的匹配圖譜(D)5.2 不同亞種殺蟲晶體蛋白的比較蛋白質組研究 第64頁/共73頁菌株Bt4.0718菌株、Bt庫斯塔克亞種HD-1Bt以色列亞種H14武漢亞種140斑點數1229126 1129025220105.2 不同亞種殺蟲晶體蛋白的比較蛋白質組研

11、究 第65頁/共73頁5.2 不同亞種殺蟲晶體蛋白的比較蛋白質組研究 第66頁/共73頁5.3 Bt工程菌株殺蟲晶體的蛋白質組學研究 A B Bt4（Phah43）（A）、XBU001(pHTAcS60)（B）晶體蛋白的雙向電泳圖第67頁/共73頁NoImage 對部分特征蛋白質點進行原位酶解、肽質量指紋圖分析，鑒定到Bt菌株和轉Bt菌株含有Cry1Aa，Cry1Ac等蛋白，還發現第四期芽胞蛋白A，翻譯延伸因子-Tu，丙氨酸脫氫酶，丙酮酸脫氫酶E1復合物，亞單位，伴侶蛋白DnaK，ATP合成酶鏈，丙酮酸脫氫酶E3復合物等部分伴侶蛋白。如下表所示：5.3 Bt工程菌株殺蟲晶體的蛋白質組學研究 第68頁/共73頁5.4