1、第一章第一章 遺傳的物質基礎遺傳的物質基礎-DNA 第一節第一節 遺傳物質的本質遺傳物質的本質 第二節第二節 DNA的結構和性質的結構和性質 第三節第三節 DNA變性和復性變性和復性 第四節第四節 分子雜交分子雜交第一節 遺傳物質的本質 1868年，瑞士的內科醫生年，瑞士的內科醫生Friedrich Miescher從外科醫院包從外科醫院包扎傷口的繃帶上的膿細胞核中提取扎傷口的繃帶上的膿細胞核中提取到一種富含磷元素的酸性化合物，到一種富含磷元素的酸性化合物，將其稱為核質或核素將其稱為核質或核素(nuclein)；后后來他又從鯖魚精子中分離出類似的來他又從鯖魚精子中分離出類似的物質，并指出它是由

2、一種堿性蛋白物質，并指出它是由一種堿性蛋白質與一種酸性物質組成的，此酸性質與一種酸性物質組成的，此酸性物質即是現在所知的核酸物質即是現在所知的核酸(nucleic acid)。 Friedrich Miescher米歇爾（米歇爾（1844-1895） 一、 遺傳物質的發現 1889年，年，奧爾特曼奧爾特曼(R. Altmann)首次提出了核酸首次提出了核酸(nucleic acid)的名稱。的名稱。 1885-1901年，年，Kossel等證等證實核酸由實核酸由A、G、C、U四四種堿基。種堿基。 1911-1934年年Levene等等確確定了核酸有兩種，一種是定了核酸有兩種，一種是脫氧核糖核酸

3、脫氧核糖核酸(DNA)，另，另一種是核糖核酸一種是核糖核酸(RNA)。證實核酸由不同的堿基組證實核酸由不同的堿基組成。其最簡單的單體結構成。其最簡單的單體結構是堿基是堿基-核糖核糖-磷酸構成的磷酸構成的核苷酸。核苷酸。科賽爾（科賽爾（1853-1927） 列文列文(1869-1940) 核酸是遺傳物質核酸是遺傳物質遺傳物質必須具備哪些特點？1) 在體細胞中含量穩定；2) 在生殖細胞中含量減半；3) 能攜帶遺傳信息；4) 能精確地自我復制；5) 能發生變異；核核 酸酸(nucleic acid) 是以核苷酸為基本組成單位的生物大分是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。子，攜帶

4、和傳遞遺傳信息。遺傳物質的主要載體遺傳物質的主要載體- -染色體。染色體。 （通過對細胞有絲分裂、減數分裂和受精過程的研究，人們（通過對細胞有絲分裂、減數分裂和受精過程的研究，人們了解到染色體在生物的傳宗接代過程中，能夠保持一定的穩了解到染色體在生物的傳宗接代過程中，能夠保持一定的穩定性和連續性。因此，人們認為染色體在遺傳上起著主要作定性和連續性。因此，人們認為染色體在遺傳上起著主要作用。）用。）( (染色體的主要成分是染色體的主要成分是DNADNA和組蛋白，雖然這兩種成分都在基和組蛋白，雖然這兩種成分都在基因功能上起著重要的作用，但多數證據證明，基因的主要特因功能上起著重要的作用，但多數證據

5、證明，基因的主要特性由性由DNADNA決定，或者說遺傳信息貯存在決定，或者說遺傳信息貯存在DNADNA中中) )。3. 3. DNADNA是遺傳物質的證據。是遺傳物質的證據。 如果如果DNA確是遺傳物質確是遺傳物質, ,那么能不能把那么能不能把DNA和蛋白質分開，和蛋白質分開，單獨觀察單獨觀察DNA的作用呢？這些實驗已在微生物中做了的作用呢？這些實驗已在微生物中做了, ,證明證明遺傳物質確是遺傳物質確是DNA（或或RNA）。 證據：證據：6Frederick Griffith格里菲斯格里菲斯(1879-1941) 利用肺炎雙球菌感染小利用肺炎雙球菌感染小鼠的一系列生物學實驗，鼠的一系列生物學實

6、驗，發現了一種可以在細菌發現了一種可以在細菌之間轉移的遺傳分子之間轉移的遺傳分子 ，即即轉化因子轉化因子格里菲斯實驗格里菲斯實驗n 1928年Frederick Griffith 轉化實驗7 1944年年Avery等人通過肺炎球等人通過肺炎球菌轉化實驗證明菌轉化實驗證明DNA是攜帶遺傳是攜帶遺傳信息的分子信息的分子Oswald Theodore Avery埃弗里（埃弗里（1877-1955）DNA分子中貯存著遺傳信息分子中貯存著遺傳信息人們仍不相信DNA是遺傳物質,這是由于：（1）因認為蛋白分子量大，結構復雜，二十種氨基酸的排列組合將是個天文數字，可作為一種遺傳信息。而DNA分子量小，只含4種

7、不同的堿基，人們一度認為不同種的有機體的核酸只有微小的差異。（2）認為轉化實驗中DNA并未能提得很純，還附有其它物質。（3）即使轉化因子確實是DNA，但也可能DNA只是對莢膜形成起著直接的化學效應，而不是充當遺傳信息的載體。 1952年，年，Hershey 和和 Chase 完成噬菌體感染實驗噬菌體感染實驗10RNA也是遺傳物質也是遺傳物質1956年吉爾年吉爾(A.Gierer)和施拉姆和施拉姆(G.Schraman)發現煙發現煙草花葉病毒草花葉病毒（tobacco mosaic virus,TMV）的遺傳的遺傳物質是物質是RNA1957年美國的弗倫克爾年美國的弗倫克爾-康拉特康拉特(Frae

8、nkel-Conrat)和和B.Singre用病毒重建實驗證實了這一結論用病毒重建實驗證實了這一結論Heinz Ludwig Fraenkel-ConratAlfred Gierer 11 煙草花葉病毒是一種煙草花葉病毒是一種RNA病毒，不含病毒，不含DNA，它，它有一個圓筒狀的蛋白質外有一個圓筒狀的蛋白質外殼，由殼，由2130個相同的亞基組個相同的亞基組成，內有一條成，內有一條RNA分子，分子，沿著內壁在蛋白質亞基之沿著內壁在蛋白質亞基之間盤旋間盤旋 1889年，年，奧爾特曼奧爾特曼(R. Altmann)首次提出了核酸首次提出了核酸(nucleic acid)的名稱。的名稱。 1885-1

9、901年，年，Kossel等證等證實核酸由實核酸由A、G、C、U四四種堿基。種堿基。 1911-1934年年Levene等等確確定了核酸有兩種，一種是定了核酸有兩種，一種是脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸(DNA)，另，另一種是核糖核酸一種是核糖核酸(RNA)。證實核酸由不同的堿基組證實核酸由不同的堿基組成。其最簡單的單體結構成。其最簡單的單體結構是堿基是堿基-核糖核糖-磷酸構成的磷酸構成的核苷酸。核苷酸。科賽爾（科賽爾（1853-1927） 列文列文(1869-1940) 二、 DNA和RNA的化學組成1929年Levene和London提出四核苷酸假說：“不同DNA的成分都是相同的”。1948年A

10、lfred Mirsky，Hars RisR.Vendrely，A.Boivin兩組學者分別發現不同的生物體細胞中DNA的含量都是其配子中的兩倍。 1950英Chargaff對各種生物DNA的堿基組成進行了定律測定，發現DNA的“當量規律”即：嘌呤的總含量和嘧啶的總含量相等；且不同生物DNA堿基組成有明顯差異。否定了四核苷酸假說，提示了A-T、G-C 互補的可能性。 14核酸的分類及分布核酸的分類及分布 存在存在于細胞核于細胞核和線粒體內。和線粒體內。存在存在于胞核、胞液于胞核、胞液和線粒體和線粒體。(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucleic acid,

11、RNA)脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸核糖核酸核糖核酸攜帶遺傳信息，決定細胞和個攜帶遺傳信息，決定細胞和個體的遺傳型體的遺傳型(genotype)。參與遺傳信息的復制與表達。參與遺傳信息的復制與表達。某些病毒某些病毒RNA也可作為遺傳信也可作為遺傳信息的載體。息的載體。核核 酸酸(nucleic acid) 是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。帶和傳遞遺傳信息。15核酸的基本組成單位是核苷酸核酸的基本組成單位是核苷酸(nucleotide)堿基堿基戊糖戊糖磷酸磷酸核苷酸核苷酸核苷核苷核酸核酸DNA的基本組成單位是的基本組成單位是脫氧核糖核

12、苷酸脫氧核糖核苷酸 。RNA的基本組成單位是的基本組成單位是核糖核苷酸核糖核苷酸 。元素組成：元素組成：C、H、O、N、PP元素的含量較多并且恒定，約占元素的含量較多并且恒定，約占911%。16嘌呤嘌呤 嘧啶嘧啶 堿基堿基腺嘌呤（腺嘌呤（A）鳥嘌呤（鳥嘌呤（G）胞嘧啶（胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（尿嘧啶（U）DNA、RNA均有均有DNA有有RNA有有每種核酸都含有四種堿基每種核酸都含有四種堿基 。（一）堿（一）堿 基基17嘧啶嘧啶嘌呤嘌呤 除了上述五類基本的堿基外，核酸中還有一些除了上述五類基本的堿基外，核酸中還有一些含量甚少的堿基，稱為含量甚少的堿基，稱為稀有堿基稀有堿基。稀

13、有堿基種。稀有堿基種類極多，大多數都是甲基化堿基類極多，大多數都是甲基化堿基。tRNA中含有中含有較多的稀有堿基。較多的稀有堿基。18生物體內游離存在的嘌呤堿基生物體內游離存在的嘌呤堿基稀有堿基稀有堿基 五種堿基都能形成酮式五種堿基都能形成酮式-烯醇式或氨基烯醇式或氨基-亞氨基亞氨基的互變異構。這兩種異構體的平衡關系受介質酸的互變異構。這兩種異構體的平衡關系受介質酸堿環境的影響。堿環境的影響。 19HNHNCNH2+O+HNNH2NNH2亞亞氨氨基基氨氨基基+ H+NCOHNCO-+ H+酮酮式式烯烯醇醇式式20 一些合成的嘌呤和嘧啶具有臨床應用價值，它們可以取一些合成的嘌呤和嘧啶具有臨床應用

14、價值，它們可以取代某些酶活性部位中的天然嘧啶和嘌呤底物。例如代某些酶活性部位中的天然嘧啶和嘌呤底物。例如5-氟尿嘧氟尿嘧啶啶和和6-巰基嘌呤巰基嘌呤就常用于治療某些類型的癌癥。就常用于治療某些類型的癌癥。5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶相應的核苷酸類似于胸苷酸，是一種潛在的胸苷酸合成酶的相應的核苷酸類似于胸苷酸，是一種潛在的胸苷酸合成酶的抑制劑，胸苷酸合成酶是抑制劑，胸苷酸合成酶是DNA合成所必需的酶。合成所必需的酶。次黃嘌呤次黃嘌呤21（二）戊（二）戊 糖糖（構成（構成RNA）核糖核糖(ribose)（構成（構成DNA）脫氧核糖脫氧核糖(deoxyribose)12453OOHOHHHHCH2OHHOH

15、OHOHHHHCH2OHHOH12345-D-呋喃核糖呋喃核糖-D-2-脫氧呋喃核糖脫氧呋喃核糖22堿基和核糖（或脫氧核糖）通過堿基和核糖（或脫氧核糖）通過糖苷鍵糖苷鍵連連接形成接形成核苷核苷（或脫氧核苷）。（或脫氧核苷）。（三）核（三）核 苷（苷（nucleoside）RNA 腺苷、鳥苷腺苷、鳥苷 尿苷、胞苷尿苷、胞苷 DNA 脫氧腺苷、脫氧鳥苷脫氧腺苷、脫氧鳥苷 脫氧胸苷、脫氧胞苷脫氧胸苷、脫氧胞苷 23（四）核苷酸（四）核苷酸（nucleotide） 核苷酸就是核苷的磷酸酯。是核苷中的戊糖核苷酸就是核苷的磷酸酯。是核苷中的戊糖上上C5相連的羥基被磷酸分子酯化所形成的。相連的羥基被磷酸分子

16、酯化所形成的。糖苷鍵酯鍵腺苷酸NNNN9NH2OOHOHHHHCH2H12OPO- -HOO524一個核苷酸一個核苷酸3 的的羥基羥基與另一個核苷酸與另一個核苷酸5 的的-磷酸磷酸基團縮合形成基團縮合形成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵(phosphodiester bond) 多個脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵構多個脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵構成了具有成了具有方向性方向性的線性分子，稱為的線性分子，稱為多聚多聚核苷酸，核苷酸，即即DNA鏈或鏈或RNA鏈鏈（四）核苷酸之間通過（四）核苷酸之間通過3 , 5 -磷酸二酯鍵連接磷酸二酯鍵連接25交替的磷酸基團交替的磷酸基團和戊糖構成了和戊糖構成了DNA的骨架的骨架(b

17、ackbone)。DNA鏈的方向是鏈的方向是5 3 26脫氧核糖核酸和核糖核酸的比較脫氧核糖核酸和核糖核酸的比較分類分類核糖核酸核糖核酸 （ribonucleic acid，RNA）脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid，DNA）組組成成戊糖戊糖核糖核糖脫氧核糖脫氧核糖堿基堿基A,G,CA,G,CUT磷酸磷酸Pi（磷酸二酯鍵）（磷酸二酯鍵）Pi（磷酸二酯鍵）（磷酸二酯鍵）結構結構單鏈，部分堿基互補，局部雙單鏈，部分堿基互補，局部雙螺旋，三葉草形等螺旋，三葉草形等雙鏈，堿基互補，雙螺旋形雙鏈，堿基互補，雙螺旋形分布分布細胞核（核仁），細胞核（核仁）， 細胞質（線細

18、胞質（線粒體、核蛋白體、胞液）粒體、核蛋白體、胞液）細胞核（染色質），細胞質細胞核（染色質），細胞質（線粒體）（線粒體）生物功能生物功能主要參與遺傳信息的傳遞和表主要參與遺傳信息的傳遞和表達過程，在蛋白質的生物合成達過程，在蛋白質的生物合成中起重要作用中起重要作用是基因遺傳與表達的載體，是是基因遺傳與表達的載體，是生物的主要遺傳物質生物的主要遺傳物質27DNA的一級結構是指脫氧核苷酸之間的連接方式和排列順序。的一級結構是指脫氧核苷酸之間的連接方式和排列順序。由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為堿基序列堿基序列。 5533一、一、DNA的一級結

19、構的一級結構第二節第二節 DNA的結構和性質的結構和性質28化學式化學式PAPCPGPT或 PA-C-G-T ACGT多聚核苷酸鏈具有方向性，若不特別注多聚核苷酸鏈具有方向性，若不特別注明，明，一般規定從一般規定從5端書寫至端書寫至3端端。線條式線條式文字式文字式雙鏈雙鏈DNA的兩條鏈為反向平行，必須注的兩條鏈為反向平行，必須注明各條鏈的走向。明各條鏈的走向。核酸的表示方式核酸的表示方式29 生物的遺傳信息貯存于生物的遺傳信息貯存于DNA堿基序列中，堿基序列中，生物界的多樣性即寓于生物界的多樣性即寓于DNA分子中的分子中的4種種脫氧核苷酸千變萬化的精確排列順序中。脫氧核苷酸千變萬化的精確排列順

20、序中。 基因的遺傳信息的物質基礎就是基因的遺傳信息的物質基礎就是4種堿基種堿基的精確排列順序。的精確排列順序。 可以通過測定可以通過測定DNA序列來研究序列來研究DNA所載的所載的信息及其功能。信息及其功能。DNA一級結構的意義：一級結構的意義：30 根據堿基配對原則，當一條多核苷酸鏈的序列被確定根據堿基配對原則，當一條多核苷酸鏈的序列被確定后，即可決定另一條互補鏈的序列。這就表明，遺傳信息后，即可決定另一條互補鏈的序列。這就表明，遺傳信息由堿基的序列所攜帶。由堿基的序列所攜帶。DNA堿基配對示意圖堿基配對示意圖（一）（一）DNA雙螺旋模型的誕生雙螺旋模型的誕生Watson & Crick建立

21、雙螺旋模型主要是受到建立雙螺旋模型主要是受到4個方面的影響：個方面的影響：（1）1938年年W.T.Astbury & Bell用用x衍射技術研究衍射技術研究DNA。1947年拍年拍攝了第一張攝了第一張DNA的衍射照片，并推斷的衍射照片，并推斷DNA分子的結構是：分子的結構是： 柱狀；柱狀； 多核苷酸是一疊扁平的核苷酸；多核苷酸是一疊扁平的核苷酸； 核酸殘基取向核酸殘基取向和分子長軸垂直，間距為和分子長軸垂直，間距為3.4nm。（2）1951年年Pauling和和Corey運用化學的定律來推理，而不做具體運用化學的定律來推理，而不做具體的實驗，建立了蛋白質的的實驗，建立了蛋白質的-螺旋模型。螺

22、旋模型。（3）晶體學者）晶體學者美美J. Donohue & Chargaff 的指點糾正起初的同類的指點糾正起初的同類堿基配對的錯誤構想，而提出互補配對的正確構型。堿基配對的錯誤構想，而提出互補配對的正確構型。（4）R.Franklin & Wilkins在在1952年底拍得了年底拍得了DNA結晶結晶X衍射照片。衍射照片。二、二、 DNA的二級結構的二級結構 雙螺旋結構雙螺旋結構（二）雙螺旋模型 (double helix model)雙螺旋模型有以下特點雙螺旋模型有以下特點：（要求）（要求）(1)DNA分子由兩條反向平行的多核苷酸鏈組成，形成右手雙螺旋。 (2)兩條鏈反向平行其5和3方向相

23、反。(3)雙螺旋直徑2nm；螺距3.4nm；上下相鄰堿基的垂直距離0.34nm，交角為36 ；每個螺旋有10個堿基對。(4)糖一磷酸鏈是在雙螺旋的外側，堿基對與軸線垂直。(5)糖與附著在糖上的堿基近于垂直。(6)堿基配對時，必須一個是嘌呤，另一個是嘧啶。(7) DNA雙螺旋有大溝(major or wide groove)和小溝(minor or narrow groove)的存在。模型中的堿基配對有何重要性？（要求）模型中的堿基配對有何重要性？（要求）A-T,G-C配對可形成很好的線性氫鍵；A-T對和G-C對的幾何形狀一樣，使雙鏈中兩側脫氧核糖之間的距離相近，使雙螺旋保持均一；堿基對處在同一

24、平面內垂直于對稱軸，沿對稱軸旋轉180仍保持原對稱性，不論核苷酸的順序如何，都不影響雙螺旋的結構，其外形都是光滑均勻的圓柱體；模型中堿基對處于同一平面，但實際其存在一個小角度的扭轉，稱螺旋槳式扭轉，使相鄰堿基間的重疊面積大，增加了堿基間的堆集力，增強了雙螺旋的穩定性；為DNA半保留復制奠定了基礎。34（三）（三）DNA二級結構的穩定因素二級結構的穩定因素（要求）（要求） DNA二級結構的穩定因素 (1)堿基對之間的氫鍵。 (2)堿基的堆集力。 它包括： 疏水作用； 范德華力； 磷酸基的負電荷斥力； (3)核苷酸的磷酸基團上都帶有負電荷1. 兩條兩條DNA鏈之間堿基對形成的鏈之間堿基對形成的氫鍵

25、氫鍵（hydrogen bond）：）：使四種堿基形成特異配對關系，使四種堿基形成特異配對關系，G-C間可形成間可形成3對氫鍵，對氫鍵，A-T之間有兩對氫鍵之間有兩對氫鍵 。雖然氫鍵是一種弱鍵，但。雖然氫鍵是一種弱鍵，但DNA中氫鍵中氫鍵數量多，所以氫鍵是比較重要的因素。數量多，所以氫鍵是比較重要的因素。2. 堿基堆積力堿基堆積力（base stacking force）：雙螺旋結構內部堿）：雙螺旋結構內部堿基層層堆積，形成了一個強大的疏水區，消除了介質中水基層層堆積，形成了一個強大的疏水區，消除了介質中水分子對堿基之間氫鍵的影響。分子對堿基之間氫鍵的影響。這是維持這是維持DNA雙螺旋穩定的雙

26、螺旋穩定的主要因素。主要因素。3. 介質中的陽離子（如介質中的陽離子（如Na+、K+和和Mg2+）可與磷酸基團上）可與磷酸基團上的負電荷形成的負電荷形成離子鍵離子鍵，降低了，降低了DNA鏈之間的排斥力、范德鏈之間的排斥力、范德華引力等，有利于雙螺旋的穩定。華引力等，有利于雙螺旋的穩定。36DNA二級結構的穩定因素與二級結構的穩定因素與Tm值值 (1)堿基對之間的氫鍵 堿基對數越多雙鏈越穩定（Tm越大），在設計PCR引物時，最少16nt，最好為20-24nt (2)堿基堆集力 堿基間相互作用強度與相鄰堿基之間的環面積成正比，即：嘌呤與嘌呤嘌呤與嘧啶嘧啶與嘧啶即DNA鏈中嘧啶越多Tm值越低，反之嘌

27、呤越多Tm越高，鏈越穩定。 (3)核苷酸的磷酸基團上都帶有負電荷與介質中鹽離子結合屏蔽靜電排斥作用，使鏈穩定 鹽離子濃度降低，屏蔽減弱，Tm降低 鹽離子濃度大于生理鹽水，隨濃度增加，Tm增加 Watson和和Crick所描述的所描述的雙螺旋結構是雙螺旋結構是B型型DNA，是在生理條件下（低濃度是在生理條件下（低濃度鹽溶液中）的構型，其僅鹽溶液中）的構型，其僅僅是眾多僅是眾多DNA雙螺旋構雙螺旋構象中的一種。在外界條件象中的一種。在外界條件的改變下，雙螺旋的構象的改變下，雙螺旋的構象也會改變。也會改變。三、雙螺旋結構的構象變異（一） DNA構象的類型DNA的構象現已知有：A，B，C，D，E，T，

28、Z 7種。 引起DNA雙鏈構象改變有以下因素：（1）核苷酸順序；（2）堿基組成；（3）鹽的種類；（4）相對濕度。 目前已知目前已知DNADNA雙雙螺旋結構可分螺旋結構可分為為A A、B B、C C、D D及及Z Z型等數種，型等數種，除除Z Z型為左手雙型為左手雙螺旋外，其余螺旋外，其余均為右手雙螺均為右手雙螺旋。旋。 Z-DNA B-DNA 40A，B，Z型型DNA構象的比較構象的比較B型結構：型結構：右手雙股螺旋；堿基在右手雙股螺旋；堿基在內，戊糖在外，堿基平面垂直內，戊糖在外，堿基平面垂直于螺旋軸；螺旋軸穿過堿基對；于螺旋軸；螺旋軸穿過堿基對；雙螺旋每轉一周為雙螺旋每轉一周為10個堿基對

29、；個堿基對；大溝寬而深，小溝窄而淺。大溝寬而深，小溝窄而淺。A型結構：型結構：右手雙股螺旋，每圈右手雙股螺旋，每圈11個堿基對；堿基平面傾斜個堿基對；堿基平面傾斜20，螺旋軸位于大溝，小溝寬而淺，螺旋軸位于大溝，小溝寬而淺，大溝極深；螺旋變粗變短，螺大溝極深；螺旋變粗變短，螺距距23nm。Z型結構：型結構：左手螺旋，每圈左手螺旋，每圈12個堿個堿基對；堿基平面傾斜基對；堿基平面傾斜9，螺旋軸，螺旋軸位于小溝，沒有大溝，小溝窄位于小溝，沒有大溝，小溝窄而深。而深。 在生理溶液中，在生理溶液中，B-DNA與與Z-DNA可以互變。可以互變。421. 右手螺旋右手螺旋B-DNA: 相對濕度相對濕度92

30、%，鈉鹽，鈉鹽細胞內主要的存細胞內主要的存 在形式在形式A-DNA: 相對濕度相對濕度75%，鈉鹽，鈉鹽轉錄時轉錄時DNA-RNA 雜交雜交C-DNA: 相對濕度相對濕度66%，鋰鹽，鋰鹽染色體及某些病染色體及某些病 毒的毒的DNA中中2. 左手螺旋左手螺旋Z-DNA：常存在于基因的調控區域，可能與基因：常存在于基因的調控區域，可能與基因 的表達調控有關。的表達調控有關。 DNA雙螺旋結構的多樣性雙螺旋結構的多樣性431972年 Pohl et al 發現 poly(dG-dC)在高鹽下旋光性發生改變；1979年 Wang A.H-J(王惠君), A.Rich對 d(CGCGCG)單晶作X衍射

31、分析提出ZDNA模型（二）（二）Z型型DNA構象構象 u1. Z-DNA的發現：的發現：（1）糖磷骨架呈“之”字形（Zigzag）走向。（2）左旋。（3）G的糖苷鍵呈順式，使G殘基位于分子表面。（4）分子外形呈波形。（5）無大小溝區分，溝窄而深。（6）每個螺旋有12bp。u2. Z-DNA的結構特點的結構特點(要求要求)u3. ZDNA存在的條件：存在的條件： (1) 高鹽：NaCl2Mol/L, MgCl20.7 Mol/L (2) 嘌呤-嘧啶相間排列：現認為在適當的離子存在條件下，任何不少于6個bp的嘌呤-嘧啶交替排列序列都能形成Z-DNA (3)在活細胞中如果m5C（甲基化胞嘧啶）存在，

32、則無需嘌呤-嘧啶相間排列，在生理鹽水的濃度下即可產生Z型。 (4)在體內多胺化合物，如和亞胺及亞精胺和陽離 子一樣， 可和磷酸基因結合，減少負電荷的靜電排斥作用，使B-DNA轉變成 Z-DNA。 (5)某些蛋白質如Z-DNA結合蛋白帶有正電荷，可使DNA周圍形成局部的高鹽濃度和微環境，也是活細胞中形成Z-DNA的原因之一。 (6)負超螺旋的存在u4.Z-DNA的生物學意義（要求）的生物學意義（要求）(1) 可能提供某些調節蛋白的識別位點。嚙齒類動物病毒的復制起始部位有d（GC）有交替順序的存在。(2) 在SV40的增強子中有三段8bp的Z-DNA存在。(3) 原生動物纖毛蟲，它有大、小兩個核，

33、大核大核有轉錄活性，小核小核和繁殖有關。Z-DNA抗體以螢光標記后，顯示僅和大核DNA結合，而不和小核的DNA結合，說明大核DNA有Z-DNA的存在，可能和轉錄有關。471957年年G. Felsenfeld等發現在基因的調控區或染等發現在基因的調控區或染色質的重組部位有色質的重組部位有DNA的三螺旋結構的三螺旋結構（三）其它（三）其它DNA二級結構二級結構 u1.三鏈三鏈DNA48u三鏈三鏈DNA（triple-stranded DNA） 是DNA的一種特殊結構，由第三條寡核苷酸鏈通過Hoogsteen堿基配對和雙螺旋中的一條鏈以特殊的氫鍵相連，形成三螺旋結構，又稱三鏈體DNA（triple

34、x DNA）。uHoogsteen堿基配對：1963年K. Hoogsteen發現三鏈DNA中的堿基能以不同于Watson-Crick配對的構象連接，即A的6-NH2和N-7分別與T的4-O和H-1形成氫鍵，G與C的配對要求C的N-1是質子化的，G的6-O和N-7分別與C的4-NH2和質子化的N-1形成氫鍵。u應用：三螺旋DNA的形成可能伴隨于DNA轉錄、復制和重組等過程。如在E. coli重組酶RecA作用中產生三鏈中間體，又稱R-DNA。50u生物學功能：生物學功能：可能參與端粒可能參與端粒DNA的復制的復制 （三）其它（三）其它DNA二級結構二級結構 u2. 四鏈體四鏈體DNA 是富含是

35、富含G序列的四鏈序列的四鏈DNA所形成的一種結構。所形成的一種結構。端粒的單鏈富含端粒的單鏈富含G的的3突出端即能形成鳥嘌呤四連體。突出端即能形成鳥嘌呤四連體。u發現：發現：1989年年J. R. Williamson等用等用X射線在體射線在體外分析了哺乳動物端粒序列末端的一段外分析了哺乳動物端粒序列末端的一段150-200nt的單鏈富含的單鏈富含G重復序列的晶體，發現其可重復序列的晶體，發現其可形成特殊的四鏈結構，特別是在具有形成特殊的四鏈結構，特別是在具有Na+和和K+ 存在的情況下。存在的情況下。 所謂所謂DNA的三級結構，是指在一二結構基礎上的三級結構，是指在一二結構基礎上的多聚核苷酸

36、鏈上的卷曲。在一定意義上，的多聚核苷酸鏈上的卷曲。在一定意義上， DNA雙螺旋進一步扭曲盤繞則形成其三級結構。雙螺旋進一步扭曲盤繞則形成其三級結構。u三級結構包括三級結構包括鏈的扭結鏈的扭結和和超螺旋超螺旋或者是單鏈形或者是單鏈形成的環或是環狀成的環或是環狀DNA中的中的連環體。連環體。u超螺旋超螺旋是是DNA三級結構的主要形式。三級結構的主要形式。 四、四、DNA的三級結構的三級結構 u超螺旋的發現：超螺旋的發現：1965年年J. Vinograd等人在離心分離多瘤病毒的環等人在離心分離多瘤病毒的環形形DNA時，意外發現出現兩條帶，他認為一條時，意外發現出現兩條帶，他認為一條是松弛性是松弛性

37、DNA，另一條可能是超螺旋，另一條可能是超螺旋DNA，從，從而發現了而發現了DNA的超螺旋。的超螺旋。 slide 53u各種生物各種生物DNA的超螺旋的超螺旋 現已知道絕大多數原核生物都是現已知道絕大多數原核生物都是共價封閉環狀共價封閉環狀(covalently closed circle,CCC)DNA分子，這種雙分子，這種雙螺旋環狀分子再度螺旋化成為螺旋環狀分子再度螺旋化成為超螺旋結構超螺旋結構 (superhelix或或supercoil)。有些有些單鏈環形單鏈環形DNA(如如174)或或雙鏈線形雙鏈線形DNA(如如噬菌體噬菌體)，在其生活周期的某一階段，也必將其，在其生活周期的某一階

38、段，也必將其變為變為超螺旋形式超螺旋形式。對于真核生物來說，雖然其染色體多為對于真核生物來說，雖然其染色體多為線形分子線形分子但其但其DNA均與蛋白質相結合，兩個結合點之間的均與蛋白質相結合，兩個結合點之間的DNA形成一個突環形成一個突環(loop)結構，類似于結構，類似于CCC分子，分子，同樣具有超螺旋形式同樣具有超螺旋形式。 原核生物原核生物DNADNA的三的三級結構：級結構： 絕大多數原核生絕大多數原核生物的物的DNADNA都是共價都是共價封閉的封閉的環狀環狀雙螺雙螺旋。如果再進一旋。如果再進一步盤繞則形成麻步盤繞則形成麻花狀的超螺旋三花狀的超螺旋三級結構。級結構。 u 超螺旋結構的類型

39、超螺旋結構的類型松馳型DNA（relax form DNA）超螺旋（Supercoiled DNA）超螺旋結構：正超螺旋 擰緊狀態 負超螺旋 擰松狀態（天然DNA主要以負超螺旋結構存在，以利于基因的表達） 負超螺旋（負超螺旋（Negative Supercoiled）：是指順時針右手螺旋的DNA雙螺旋以相反方向繞它的軸扭轉而成，通過這種方式，調節了DNA雙螺旋本身的結構，松解了扭曲壓力，使每個堿基對的旋轉減少，甚至可打亂堿基配對。 slide 56松馳結構松馳結構 正超螺旋正超螺旋 負超螺旋負超螺旋57 向左捻向左捻向右捻向右捻松弛型松弛型正超螺旋正超螺旋負超螺旋負超螺旋 slide 58u超

40、螺旋概念的基本要點是：超螺旋概念的基本要點是：（）初級螺旋處于（）初級螺旋處于松纏或緊纏松纏或緊纏狀態；狀態；（）與松弛形式相比具有額外的自由能。（）與松弛形式相比具有額外的自由能。l 這兩點實際上是一種物理狀態的兩種表現。這兩點實際上是一種物理狀態的兩種表現。所有的生物的所有的生物的DNA都具有負超螺旋，都具有負超螺旋，它與許它與許多生命過程密切相關。多生命過程密切相關。l在溶液中和細胞內負超螺旋會部分地轉變為在溶液中和細胞內負超螺旋會部分地轉變為單鏈泡狀結構單鏈泡狀結構(下圖下圖)，這種單鏈泡狀結構也是，這種單鏈泡狀結構也是解除松纏作用造成的脅變的一種途徑。解除松纏作用造成的脅變的一種途徑

41、。 slide 59單鏈泡狀結單鏈泡狀結構構 slide 60uDNA超螺旋的產生機制超螺旋的產生機制p在原核生物中，負超螺旋主要由在原核生物中，負超螺旋主要由DNA旋轉酶旋轉酶(DNA gyrase )引入到已存在的雙鏈封閉環狀分子中，此酶引入到已存在的雙鏈封閉環狀分子中，此酶沿拓撲異構復制叉進行移動，靠沿拓撲異構復制叉進行移動，靠解旋酶解旋酶切斷配對堿切斷配對堿基，逐步解開基，逐步解開DNA聚合酶前面的雙螺旋。這一過程聚合酶前面的雙螺旋。這一過程需要水解需要水解ATP以提供能量。以提供能量。 在缺乏在缺乏ATP時，時，DNA旋轉酶旋轉酶也可使負超螺旋松弛，也可使負超螺旋松弛，但是這個作用與

42、超螺旋化作用比較起來要低但是這個作用與超螺旋化作用比較起來要低10倍以倍以上。原核細胞中，這一過程是由上。原核細胞中，這一過程是由拓撲異構酶拓撲異構酶I和其他和其他的的拓撲異構酶拓撲異構酶II來負責的。來負責的。 slide 61在真核生物中，染色體在真核生物中，染色體DNADNA負超螺旋結構被組蛋白負超螺旋結構被組蛋白所固定，細菌染色體所固定，細菌染色體DNADNA負超螺旋結構被類組蛋白負超螺旋結構被類組蛋白（HUHU，HDHD，NS1NS1，NS2 or DNA binding protein NS2 or DNA binding protein ）固定；真核生物和細菌染色體未被蛋白結合固

43、定；真核生物和細菌染色體未被蛋白結合的區域可分爲鬆弛與不完全鬆弛狀態，嗜熱古菌的區域可分爲鬆弛與不完全鬆弛狀態，嗜熱古菌染色體染色體DNADNA大部份爲鬆弛狀態，但它與大部份爲鬆弛狀態，但它與DNADNA結合蛋結合蛋白作用卻可使白作用卻可使DNADNA裸露區呈超螺旋狀態。極端嗜熱裸露區呈超螺旋狀態。極端嗜熱古菌已經找出多種分子量爲古菌已經找出多種分子量爲7 7、8 8、1010kDakDa的的DNADNA結結合蛋白。合蛋白。 DNA拓撲異構酶拓撲異構酶 (topoisomerase) : 拓撲拓撲：是指物體或圖像作彈性移位而又保：是指物體或圖像作彈性移位而又保持物體不變的性質。持物體不變的性質

44、。拓撲異構酶拓撲異構酶：是一類可改變：是一類可改變DNA拓撲性質拓撲性質的酶。對的酶。對DNA分子的作用是既能水解、又分子的作用是既能水解、又能連接磷酸二酯鍵。能連接磷酸二酯鍵。可松弛可松弛DNA超螺旋，超螺旋，有利于有利于DNA解鏈。解鏈。 slide 62 拓撲異構酶拓撲異構酶I（topo I）:又稱切刻又稱切刻-封閉酶封閉酶 (enicking-closing nzyme) 。n在原核生物曾被稱為在原核生物曾被稱為 蛋白。蛋白。n 主要作用是切開主要作用是切開DNA雙鏈中的雙鏈中的單鏈單鏈(每次只作用每次只作用一條鏈一條鏈)，使，使DNA解鏈旋轉中不打結，解鏈旋轉中不打結，DNA變為松變

45、為松弛狀態再封閉切口，不需能量因子弛狀態再封閉切口，不需能量因子ATP或或NAD。拓撲異構酶拓撲異構酶IIII（ topo II topo II）: : n在原核生物又叫旋轉酶在原核生物又叫旋轉酶( (gyrase)gyrase)。n能切斷能切斷DNADNA雙鏈雙鏈，使螺旋松弛。在，使螺旋松弛。在ATPATP參與下，參與下，松弛的松弛的DNADNA進入負超螺旋，再連接進入負超螺旋，再連接雙鏈雙鏈斷端。斷端。 slide 63uDNA超螺旋的產生機制超螺旋的產生機制p在真核細胞中，在真核細胞中，DNA的負超螺旋則主要是染色質的負超螺旋則主要是染色質的的 結構造成的。因為結構造成的。因為DNA在組

46、蛋白八聚體外面在組蛋白八聚體外面纏繞的方向有利于纏繞的方向有利于DNA向松纏方向轉變。在核小向松纏方向轉變。在核小體組裝過程中，也肯定有體組裝過程中，也肯定有DNA拓撲異構酶參加。拓撲異構酶參加。在許多真核生物中部發現了拓撲異構酶在許多真核生物中部發現了拓撲異構酶和拓撲和拓撲異構酶異構酶II。 slide 65常見的常見的DNA分子形式分子形式 一般以相同核苷酸的線形雙螺旋一般以相同核苷酸的線形雙螺旋DNA分子的沉降常分子的沉降常數作為數作為1，其他各種分子取相對值。，其他各種分子取相對值。 沉降常數與電泳遷移率之間并不完全一致。沉降常數與電泳遷移率之間并不完全一致。 I形形DNA：具有負超螺

47、旋或正超螺旋的具有負超螺旋或正超螺旋的雙鏈封閉環狀雙鏈封閉環狀分子分子。相對沉降常數。相對沉降常數1.4l。 I0形形DNA：沒有超螺旋的雙鏈封閉環狀分子，也就是沒有超螺旋的雙鏈封閉環狀分子，也就是松弛形式松弛形式(relaxed form )，相對沉降常數相對沉降常數1.14。 II形形DNA：在一條鏈上或兩條鏈上有一個或幾個切刻在一條鏈上或兩條鏈上有一個或幾個切刻的雙鏈環狀分子，又稱為的雙鏈環狀分子，又稱為切刻環切刻環(nicked cirle )，相對相對沉降常數沉降常數1.14。 形形DNA：線形雙螺旋分子。相對沉降常數線形雙螺旋分子。相對沉降常數1.00。 坍縮坍縮DNA(colla

48、psed DNA)：當當I形成形成I0形形DNA在堿變在堿變性或熱變性時，其氫鍵斷裂，而兩條鏈無法分離，性或熱變性時，其氫鍵斷裂，而兩條鏈無法分離，結果生成兩條鏈緊密纏結的分子。坍縮結果生成兩條鏈緊密纏結的分子。坍縮DNA具有異具有異常高的沉降常數，相對沉降常數約常高的沉降常數，相對沉降常數約3.0。 單鏈環狀單鏈環狀DNA：相對沉降常數大約為相對沉降常數大約為1.14。 線性單鏈線性單鏈DNA：相對沉降常數為相對沉降常數為1.30。 環連環連DNA(catenated DNA catenane ):這是在這是在DNA復復制過程中的產物或由制過程中的產物或由DNA旋轉酶催化生成，由兩個旋轉酶催

49、化生成，由兩個以上以上T形形DNA分子環連而成。分子環連而成。 以上八種以上八種DNA分子形式的轉變表示于下圖，其中前分子形式的轉變表示于下圖，其中前四種仍標以四種仍標以I、I0、II、后四種則分別以后四種則分別以(5)、(6)、(7)、(8)表示。表示。 slide 67表 9-2 不同類型 DNA 的三級結構及性質類 型形態拓撲結構沉 淀 系數電泳遷移率閉合環超螺旋1.41最快閉合環松弛形1.41最慢開環松弛形1.14同型線形松弛形1.00中等速度第三節 DNA的變性與復性變性變性（denaturation）或解鏈解鏈（melting） 將雙鏈DNA緩慢地加溫，使其氫鍵斷裂，雙鏈解開，產生

50、單鏈DNA分子的過程。復性復性（renaturation）或退火退火（annealing） 核酸分子在變性后，分開的互補鏈緩慢冷卻，重新形成互補雙連的過程。1.下列因素可導致DNA變性： 高溫、酸、堿、尿素、甲酰胺 常用的方法是熱變性法和堿變性法。常用的方法是熱變性法和堿變性法。2.DNA變性后物理性質發生的變化：（1）流體力學的性質發生改變：粘度下降，而沉降速度增加；（2）提高了對紫外線的吸收能力，此稱為 增色效應增色效應（hyperchromic effect）。 3.增色效應(hyperchromicity) 由于DNA變性而引起的光吸收的增加稱為增色效應。 雙鏈DNA的A260=1.0

51、0（濃度為50g/ml時，對波長260nm紫外線的吸收能力）； 單鏈DNA的A260=1.37； 游離堿基或核苷酸的A260=1.60。一、變性一、變性4. 4. DNADNA的熔解曲線的熔解曲線解鏈溫度解鏈溫度（melting temperature, Tm）或熔點： 是A260的升高達到極大值一半時（一般約為1.185）的溫度。即是變性溫度范圍的中點。是鑒定DNA的參量。nDNA的熔解曲線：緩慢而均勻地增加DNA溶液的溫度（一般0.1/min），記錄各個溫度下的A260數據，即可繪制DNA熔解曲線。從中可測出Tmn影響變性的因素：外部條件：如溫度和正離子的濃度。 濃度低于0.4mol/L，單價陽離子增高10倍，Tm增加16.6內部條件：GC含量及分子類型。 當GC的含量上升1%，則Tm上升0.4。 馬默多蒂馬默多蒂（Marmur-Doty）關系式關系式： 二、復性1.復性的條件： (1) 有足夠的鹽濃度以消除磷酸基的靜電斥力； NaCl：0.15-0.5mol/L (2) 有足夠高的溫度以破壞無規則的鏈內氫鍵。 一般比Tm低20-252.復性的過程： DNA的復性對片段有兩個要求： (1) 互補順序的碰撞和排列； (2) 堿基的正確配對和氫鍵的形成。具體