1、分子生態學參考書:1.Molecular Ecology (Second Edition) ( Freeland J. R., Kirk H. and Petersen S.), 2011, Wiley-Blackwell. 2. 分子生態學(Bee T.J.C., Rowe G.)(張軍麗等譯），中山大學出版社，2009。3.生物多樣性譯叢（三） 中國科學院生物多樣性委員會。科學出版社，19974植物分子生態學 阮成江，何禎祥，周長芳。化學工業出版社，2005同工酶 1. 同功酶同功酶（Isozyme）: 是指同一種酶的多種分子形式，這些不同的分子形式具有相同或相似的底物，催化相同的反應。

2、2. 等位酶等位酶（Allozyme）：由同一基因位點上受不同等位基因來編碼的同工酶，即造成同種酶多種分子形式的原因在于編碼它們的是同一位點上不同的等位基因。這類特殊的同工酶叫做等位基因同工酶（allele isozyme），簡稱等位酶(allozyme)。利用同工酶變異作為基因組變異的指標. 材料的采集材料的采集研磨和酶的提取研磨和酶的提取酶的保存酶的保存淀粉凝膠制備淀粉凝膠制備電泳電泳凝膠切片凝膠切片酶的組織化學染色酶的組織化學染色酶譜的記錄與分析酶譜的記錄與分析數據分析數據分析同工酶與等位酶同工酶與等位酶等位酶分析的過程同工酶與等位酶同工酶與等位酶酶譜照片酶譜照片二倍體二倍體同工酶與等位

3、酶同工酶與等位酶酶譜照片酶譜照片多倍體多倍體同工酶的遺傳學分析 1 酶蛋白的結構酶蛋白的結構 我們常選來作遺傳分析的酶都是單體酶、二聚體酶或四聚體酶。因為它們的酶譜比較少，容易分析。對大多數酶的遺傳學控制已了解得相當清楚，所以這就允許我們從凝膠上的帶譜作出遺傳學的推斷。 過氧化物酶、脂酶、磷酸酶和肽酶等，其同工酶的數量、位置和四級結構往往是可變的，雖然它們也常常也被用來檢查遺傳變異性，但這些酶對種群遺傳結構和系統發育的分析可能是無用的，因為它們的同源性往往不能肯定。二倍體的基因型與酶型的關系等位酶分析的應用1. 了解自然種群的遺傳結構; 2. 探查種群的交配系統和交配類型;3. 探查種群間的分

4、化程度;4. 交系分析;5. 分子生態學其它應用.等位酶分析方法的優缺點優點： 1. 等位酶的遺傳和表達遵循孟德爾定律,便于遺傳學分析; 2. 量化, 可實驗,可重復; 3. 不容易飾變; 4. 取材和樣品制備簡單易行; 5. 結果明解,可比性強.缺點: 1. 有限種類的酶分析會帶來一定的偏差; 2. 所先酶的所有基因未必都能表達在酶譜上; 3.大量的新鮮的活體素構造表示活體取樣可能遇到困難; 4.可能有非遺傳性的或人為的帶干擾酶譜解釋; 5. 同一個體不同器官或不同發育時期酶的活性有時可能不一樣。推薦讀物 王中仁.1996.植物等位酶分析.北京：科學出版社同工酶與等位酶同工酶與等位酶 DNA

5、分子標記分子標記在遺傳學研究中廣泛應用的在遺傳學研究中廣泛應用的DNA分子標記已經分子標記已經發展了很多種：發展了很多種：（1）是以）是以Southern雜交技術為核心的分子標記，雜交技術為核心的分子標記，（如（如RFLP），這類分子標記被稱為第一代分），這類分子標記被稱為第一代分子標記。子標記。（2）是以）是以PCR技術為核心的分子標記，（如技術為核心的分子標記，（如STS、RAPD、AFLP、SSR）等，這類分子標）等，這類分子標記被稱為第二代分子標記；單核苷酸多態性記被稱為第二代分子標記；單核苷酸多態性（SNP）標記被稱為第三代分子標記）標記被稱為第三代分子標記 。它也是。它也是以以PC

6、R技術為基礎的分子標記技術。技術為基礎的分子標記技術。幾種主要的幾種主要的DNA分子標記分子標記（二）（二）RFLP標記：稱為限制性片段長度標記：稱為限制性片段長度多態性，是指用某一種限制性內切酶來多態性，是指用某一種限制性內切酶來切割來自不同個體的切割來自不同個體的DNA分子上，內切分子上，內切酶的識別序列有差異，即是由限制性酶酶的識別序列有差異，即是由限制性酶切位點上堿基的插入、缺失、重排或點切位點上堿基的插入、缺失、重排或點突變所引起的。這種差異反映在酶切片突變所引起的。這種差異反映在酶切片段的長度和數目上。段的長度和數目上。RFLP標記是發展最早的標記是發展最早的DNA標記技術。標記技

7、術。RFLP技術主要包括以下基本步驟：技術主要包括以下基本步驟：DNA提取用限制性內切酶酶切提取用限制性內切酶酶切DNA 、 用凝膠電泳分開用凝膠電泳分開DNA片段把片段把DNA片段片段轉移到濾膜上利用放射性標記的探針雜交轉移到濾膜上利用放射性標記的探針雜交顯示特定的顯示特定的DNA片段（片段（Southern雜交）和結果雜交）和結果分析。分析。 特點特點A 無表型效應，無表型效應，RFLP標記的檢測不受環標記的檢測不受環境條件和發育階段的影響。境條件和發育階段的影響。B RFLP標記在等位基因之間是共顯性的，標記在等位基因之間是共顯性的，因此在配制雜交組合時不受雜交方式的因此在配制雜交組合時

8、不受雜交方式的影響。影響。C 在非等位的在非等位的RFLP標記之間不存在上位標記之間不存在上位效應，因而互不干擾效應，因而互不干擾D RFLP標記起源于基因組標記起源于基因組DNA的自身變的自身變異，在數量上幾乎不受限制異，在數量上幾乎不受限制E DNA需要量大，檢測技術繁雜，難以需要量大，檢測技術繁雜，難以用于大規模的育種實踐中。在植物分子用于大規模的育種實踐中。在植物分子標記輔助育種中需要將標記輔助育種中需要將RFLP轉換成以轉換成以PCR為基礎的標記。為基礎的標記。RAPD（三）（三）RAPD標記標記 RAPD標記的基本原理是利用合成的隨機引物標記的基本原理是利用合成的隨機引物（一般為（

9、一般為10個堿基）對基困組個堿基）對基困組DNA進行進行PCR擴擴增增 ，然后電泳檢測，然后電泳檢測PCR產物的多態性。產物的多態性。RAPD標記的主要特點有：標記的主要特點有：（1）不需）不需DNA探針，設計引物也無須知道探針，設計引物也無須知道序列信息；序列信息；（2）顯性遺傳（極少數共顯性），不能鑒）顯性遺傳（極少數共顯性），不能鑒別雜合子和純合子；別雜合子和純合子；（3）技術簡便，不涉及分子雜交和放射性）技術簡便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術；自顯影等技術；（4）DNA樣品需要量少，引物價格便宜，樣品需要量少，引物價格便宜，成本較低；成本較低；（5）實驗重復性較差，結果可靠性較低

10、。）實驗重復性較差，結果可靠性較低。 （二）（二）AFLP標記標記 Amplified Fragment Length Polymorphism(AFLP) AFLP標記是擴增片段長度多態性的簡稱標記是擴增片段長度多態性的簡稱 是是RFLP與與PCR兩項技術相結合的產物，兩項技術相結合的產物，AFLP技技術的主要步驟：術的主要步驟：DNA提取有兩種限制性內切酶酶切提取有兩種限制性內切酶酶切DNA寡聚核苷酸接頭的連接對限制性酶切片段的寡聚核苷酸接頭的連接對限制性酶切片段的選擇性擴增擴增產物的電泳分析。選擇性擴增擴增產物的電泳分析。由于不同由于不同材料材料DNA酶切片段存在差異，因而便產生發擴增產

11、物的酶切片段存在差異，因而便產生發擴增產物的多態性。多態性。 AFLP的實驗過程AFLPKeygene N. V. Wageningen, the Netherlands Zabeau, M., and P. Vos. 1993. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerpringting. European Patent Application, Publ. No.: EP0534858, no. 92402629.7. Vos, P. et al. 1995. AFLP: a

12、new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23:4407-4414.AFLPAFLP的重復性問題Jones et al.（1997）同一實驗在歐洲的8個實驗室重復，172條帶只有1條在一次實驗中沒有，重復率99.4%，與SSR的水平相當。（Jones, C. J. et al. 1997. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories. Mol. Breed

13、. 3:381-390)AFLP AFLP標記的主要特點有：標記的主要特點有：（1）由于）由于AFLP分析可以采用的限制性內切酶及選擇性分析可以采用的限制性內切酶及選擇性堿基種類、數目很多，所以該技術所產生的標記數目堿基種類、數目很多，所以該技術所產生的標記數目是無限多的；是無限多的；（2）典型的）典型的AFLP分析，每次反應產物的譜帶在分析，每次反應產物的譜帶在50-100條之間，所以一次分析可以同時檢測到多個座位，且條之間，所以一次分析可以同時檢測到多個座位，且多態性極高；多態性極高；（3）分辯率高，結果可靠；）分辯率高，結果可靠；（4）目前該技術受專利保護，用于分析的試劑盒昂貴，）目前該

14、技術受專利保護，用于分析的試劑盒昂貴，實驗條件要求較高。但也存在假陽性帶出現頻繁、技實驗條件要求較高。但也存在假陽性帶出現頻繁、技術復雜、成本高等缺點。術復雜、成本高等缺點。 （四）（四）SSR標記標記又叫微衛星又叫微衛星DNA標記，它是指基因組中存標記，它是指基因組中存在的由在的由2-5個核苷酸為重復單位組成的長個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列，廣泛達幾十個核苷酸的串聯重復序列，廣泛分布于真核生物基因組中。分布于真核生物基因組中。 SSR標記具有共顯性、高多態性和易于標記具有共顯性、高多態性和易于檢測等優點，是一種理想的分子標記，檢測等優點，是一種理想的分子標記， SS

15、R標記的主要特點有：標記的主要特點有：（1）數量豐富，廣泛分布于整個基因）數量豐富，廣泛分布于整個基因（2）具有較多的等位性變異；）具有較多的等位性變異；（3）共顯性標記，可鑒別出雜合子和純合子；）共顯性標記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）實驗重復性好，結果可靠；）實驗重復性好，結果可靠；（5）由于創建新的標記時需知道重復序列兩端）由于創建新的標記時需知道重復序列兩端的序列信息，因此其開發有一定困難，費用也的序列信息，因此其開發有一定困難，費用也較高。較高。 SSR位位點標記的優點點標記的優點 約50%呈多態性 共顯性 數目多且在基因組中均勻分布 多數位點呈選擇中性，符合群體遺傳學了理論 技術

16、上適合用PCR分析半自動化，結果可靠 部分降解的DNA樣品也可用 適合于等位酶變異小的居群水平的研究 SSRSSRSSR位點標記的缺點位點標記的缺點 可用的位點數目少 設計引物的費用高，耗時長 物種專一性 在說明群體分化和物種分化時可能產生錯誤SSRSSR標記的應用領域 遺傳圖譜的構建 連鎖分析特殊的基因（如感病基因） 姻親分析樣品鑒定（如父本分析、血緣分析、等號樣品分析、雜種分析） 物種和居群的遺傳多樣性 群體遺傳學分析（如有效群體大小、群體遺傳結構、群體分化、遷移與基因流動） 傳粉生物學與散布生物學（如花粉和種子的散布、交配系統） 保護生物學SSRISSR標記（五）（五）SNP標記標記 也

17、是以也是以PCR技術為基礎的分子標記技術。它是指不同生物個體基技術為基礎的分子標記技術。它是指不同生物個體基因組因組DNA序列之間單個核苷酸的差異，這種差異可以通過設計特序列之間單個核苷酸的差異，這種差異可以通過設計特異異PCR引物擴增和電泳檢測顯示出來。引物擴增和電泳檢測顯示出來。 SNP標記是根據基因組測序結果發展起來的，因而它的數量非常標記是根據基因組測序結果發展起來的，因而它的數量非常豐富。檢測豐富。檢測SNP的最佳方法是新近發展起來的的最佳方法是新近發展起來的DNA芯片技術。芯片技術。 目前目前SNP作為一種的分子標記技術，已有作為一種的分子標記技術，已有2000多個多個SNP標記定

18、位在標記定位在人類染鈀體上，在稻和大豆等植人類染鈀體上，在稻和大豆等植 物上也發展了一些物上也發展了一些SNP標記。標記。 Genetic Variations The genetic variations in DNA sequences (e.g., insertions, deletions, and mutations) have a major impact on genetic diseases and phenotypic differences. All humans share 99% the same DNA sequence. The genetic variations

19、 in the coding region may change the codon of an amino acid and alters the amino acid sequence. Single Nucleotide Polymorphism A Single Nucleotide Polymorphisms (SNP), pronounced “snip,” is a genetic variation when a single nucleotide (i.e., A, T, C, or G) is altered and kept through heredity. SNP:

20、Single DNA base variation found 1% Mutation: Single DNA base variation found 3)commentsreferenceITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG White et al, 1990ITS2GCTGCGTTCTTCATCGATGC (is similar to 5.8S below)White et al, 1990ITS3GCATCGATGAAGAACGCAGC (is similar to 5.8SR below)White et al, 1990ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC W

21、hite et al, 1990ITS5GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG (is similar to SR6R)White et al, 1990ITS1-FCTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA Gardes & Bruns, 1993ITS4-BCAGGAGACTTGTACACGGTCCAG Gardes & Bruns, 19935.8SCGCTGCGTTCTTCATCG Vilgalys lab5.8SRTCGATGAAGAACGCAGCG Vilgalys labSR6RAAGWAAAAGTCGTAACAAGG Vilgalys labback to the to

22、p of this page 基因組信息資源基因組信息資源l GenBank (/)l DDBJ (http:/www.ddbj.nig.ac.jp/)l EMBL (http:/www.embl-heidelberg.de/)NCBI ( National Center for Biotechnology Information) / 全球最大的生物信息資源中心 DNA 序列、蛋白質序列、出版物、數據挖掘工具等NCBI主頁主頁密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁EMBL (Germany)EB

23、I, Hinxton (Cambridge), UK 2004年2月22日攝密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁EMBL-EBI (UK)EMBnet密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁DDBJNCBI、EBI和和DDBJ之間的區別與聯系之間的區別與聯系密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁GenBank序列投送指南序列投送指南密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁GenBank序列投送軟件平臺序列投送軟件平臺 GenBank用純文本文件 注釋、作者 、版本等信息 例: 可視化 怎樣檢索分子數據庫?l 分類學分類學 (Taxonomy ) 檢索檢索l 序列相似性序列相似性 (Similarity) 檢索檢索數據庫查詢 只查詢某一種生物 布爾查詢 (AND/OR/NOT) 時間限制查詢 密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁SRS SRS (2004)密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁GenBank 的分類學檢索的分類學檢索 (以睡蓮科以睡蓮科Nymphaeaceae為例為例)密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁挑選白睡蓮挑選白睡蓮 (Nymphaea alba) 的的 nrDNA ITS 區序列區序列 (收錄號收錄號AF136283)密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁白睡蓮白睡蓮 (Nymphaea alba) 的的 nrD