1、基于PCR信號放大的微量蛋白檢測技術主要內容鄰位連接分析技術（proximity ligation assay）鄰位延伸分析技術（proximity extension assay）CytoploRare 技術一、PLA技術（鄰位連接分析技術）背景：瑞典ULF Landegren 研究小組2002年提出了一種新的蛋白體外分析方法-鄰位連接技術(proximity ligation assay , PLA），通過一對親和探針對目的分子雙識別，繼而產生可擴增的檢測信號，從而將對蛋白質的檢測轉變成為對DNA 的檢測，實現了微量蛋白的分析。是一種研究蛋白定量、定位、相互作用、修飾以及功能的新蛋白分析技

2、術。PLA反應原理1.當識別同一抗原上的兩個抗體結合到抗原，則抗體上偶聯寡核苷酸序列彼此靠近。2.溶液中可以與這兩個探針末端互補的連接片段的作用下，形成有一個斷裂點的dsDNA片段。3.在DNA連接酶的作用下形成完整的dsDNA。4.以連接完整的DNA作為模板，進行定量PCR的檢測；靶抗原的濃度與DNA模板的量成比例，進行蛋白定量轉化。PLA基本過程共分為3步：孵育：孵育：樣品與靶特異性抗體的一對鄰位探針共孵育連接：連接：結合到同一蛋白上的鄰位探針與連接片段雜交并發生鄰位連接反應，形成一個環狀的蛋白質一蛋白識別分子一單鏈DNA復合物擴增：擴增：qPCR擴增復合物中的單鏈DNA部分PLA類型PL

3、A可分為三種：均相（液相）、固相和原位均相（液相）、固相和原位。 均相（液相）均相（液相），待測樣品、探針、熒光PCR引物以及連接試劑加入同一管中進行熒光定量PCR，適用于微量蛋白質的快速檢測。 固相固相，待測蛋白預先固定于微孔板上，洗滌去除未結合分子，去除游離探針，檢測含量過低的蛋白。原位原位，鄰位探針與待測的2個具有相互作用的蛋白質分子分別結合，反應體系中加入的DNA短序列與探針上的DNA鏈互補，在連接酶的作用下形成環狀DNA，RCA擴增。蛋白互作、細胞或組織內定位的PLA方法。 PLAPLA類型根據抗體類型：直接直接PLA與間接間接PLAA圖直接PLA，B圖間接PLA，區別在于間接法用到

4、的探針為二抗連接的親和探針，一抗為捕獲抗體。PLA技術檢測蛋白的核心鄰位探針鄰位探針：不同的DNA單鏈與一對蛋白識別分子相結合形成，使其通過免疫吸附的方式結合到待測蛋白上。為什么說PLA的核心是一對鄰位探針？1.DNA與蛋白結合效率低。2.通過篩選（指數富集配體系統進化技術SELEX）技術，難以得到與蛋白分子高特異性、高親和力的核酸適體。3.核酸適體的種類有限，難以滿足PLA實驗要求。以上三個原因，限制了PLA的發展應用PLA探針的發展探針的發展： 核酸適體：從一個體外合成的隨機寡核苷酸文庫中篩選出與靶分子特異性結合的小分子DNA。缺點：盲目、過程繁瑣，核酸適配體種類有限。 化學法：多功能交換

5、試劑SMPB：抗體與巰基修飾的單鏈DNA結合。 生物法：streptavidin與biotin高親和力。PLA探針已經走向商業化，Solulink公司可定做抗體DNA復合探針，可直接用于PLA反應。PLA國內外研究現狀國外：國外：Olink公司在PLA方面做了較多基礎研究，并對PLA技術申請了專利。相關產品：Dolink（13000RMB）該技術平臺于2015年12月被sigma-Aldrich公司收購，目前該產品正是該公司網站上的主推產品。國內：國內：目前處于實驗室研究階段，無相關產品從2010年到2014年鄰位連接技術的文獻引用次數從41次到156次，到2015年關于PLA技術的報道為55

6、篇。Olink公司PLA技術Olink公司PLA技術應用領域蛋白質互作及其修飾的檢測細胞蛋白定位分析數字化定量采用熒光染色，沒有復雜判讀標準，極有可能取代免疫組化Olink公司PLA 檢測原理蛋白In Situ （原位）檢測抗體偶聯親和探針為正負鏈，再加入與正負鏈兩端同時互補的寡核苷酸序列（a，b），而這兩條鏈在探針鏈上存在一個斷裂點，在連接酶的作用，連接成為一個環狀DNA。以正鏈探針為引物，以環狀DNA為模板，進行滾環擴增(RCA)，得到單鏈的串聯PCR。定量方法Olink 采用了終點定量的方法，加入熒光雜交探針，在熒光顯微鏡下檢測。PLA的應用舉例1. 檢測穩定、瞬時和微弱的蛋白互作（可視

7、化）Fig. 1 培養48 h的大鼠胚胎海馬神經元，原位顯示ER （雌激素受體）與DYX1C1在神經突觸中的互作。紅色：ER alpha/DYX1C1復合物；綠色：actin蛋白；藍色：細胞核PLA的應用舉例2.檢測蛋白的翻譯后修飾Fig. 2 EGF（表皮細胞生長因子）刺激前后，用免疫熒光染色和PLA方法檢測U343細胞中EGFR磷酸化水平的變化。PLA方法可以檢測到EGFR的激活，而IF方法則不能。紅色：磷酸化的EGFR蛋白；藍色：細胞核傳統分析方法需要：凝膠電泳、質譜、高效液相色譜法和免疫組化結合。PLA的應用舉例3.高靈敏度的檢測低豐度蛋白的表達Fig. 3 分別用免疫熒光和PLA方法

8、檢測A431細胞中EGFR的表達。與IF方法相比，PLA方法的信噪比高出100倍。紅色：EGFR蛋白；藍色：細胞核如果需要在天然狀態下對蛋白質進行研究，必需對目的蛋白質進行過表達、標記或遺傳修飾。PLA的應用舉例4.數字化定量 在定量過程中，可以對細胞和組織的圖像進行分析。通過細胞核的自動檢測，以及細胞質大小的估算，研究者能夠對組織或細胞群中的蛋白質表達水平進行單細胞統計學分析。Stadler, Charlotte, et al. (2012) Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation fo

9、r protein localization in mammalian cells. Nature. doi:10.1038/nmeth.2377二、PEA（鄰位延伸技術） 鄰位延伸分析技術（PEA）， 不需要額外的寡核苷酸將探針拉近連接，其兩條探針末端含有5bp配對堿基，在延伸酶的作用下形成雙鏈模板，利用qPCR進行檢測，有效的避免探針的損失。PEA相關的產品國外：國外：Olink擁有該技術的相關專利，并推出了相關產品 產品品牌：Proseek Multiplex 蛋白高通量檢測國內：國內：未見相關報道左圖：抗體識別正確且鄰位探針可以形成互補結構 中圖：抗體交叉反應，但鄰位探針無法形成互補結

10、構 右圖：PEA反應過程，采用微流控芯片qPCR系統檢測Olink公司PEA技術特點Olink 公司 PEA 特點：1.qPCR定量采用微流控芯片，實現了蛋白高通量的定量檢測（96樣本x96種抗體探針對）：可以同時檢測96個樣本，和96組引物(探針)；實現了多個指標的高通量檢測。2.樣本加樣可實現自動化3.樣本加樣量少：體積1uL、血清、血漿等4.檢測靈敏度 優于ELSA ，檢測濃度可到達fg/mL（10-15），較寬檢測線性范圍（105）反應區引物（探針）孔引物（探針）孔樣本孔樣本孔PEA技術的應用左圖：PEA 檢測IL-18線性范圍：0.24-31250pg/mL右圖：ELISA 檢測IL

11、-18 線性范圍：78-5000pg/mL細胞因子IL-18的檢測Olink公司基于PLA與PEA的服務Olink 公司提供下面幾個方面的服務： 心血管疾病標志物物的檢測 神經疾病方面標志物物的檢測 腫瘤相關標志物（92種腫瘤相關蛋白）的研究服務 主要是用于科研服務，尚未發現臨床試驗報道三、國內基于PCR信號放大技術-CytoploRare CFDA 2016年01月11日批準了國內首個通過PCR信號放大檢測肺癌循環腫瘤細胞試劑盒-CytoploRare （靶向PCR CTC）格諾思博生物科技有限公司（南通）格諾思博生物科技有限公司（南通）用途：定量檢測肺癌血清中葉酸受體陽性循環腫瘤細胞，用于

12、肺癌的輔助診斷與療效評估。CytoploRare 技術特點1. 免疫磁珠反向富集循環細胞2. 循環細胞與偶聯寡核苷酸探針的葉酸分子結合；3.洗滌；4.將與細胞結合的葉酸-寡核苷酸探針從細胞上解離下來；5.含有寡核苷酸探針的洗脫液加入25uL的PCR mix 溶液中；6. 進行qPCR （Taqman 探針法），計算樣本中寡核苷酸的濃度；并依據標準曲線轉換為CTC units相對單位。免疫磁珠反向富集CTC檢測示意圖CytoploRare 用于臨床上圖：肺癌CTC 檢測在臨床應用方面，靈敏度73.2%、特異性84.1%，優于其他常用標志物。不同檢測技術的比較優點優點缺點缺點PLA高靈敏度探針存在損失PEA高靈敏度探針不存在損失免疫PCR高靈敏度非特異性吸附、檢測背景信號高ELISA技術平臺成熟樣品量大、手工操作，干擾因素多WB技術平臺成熟操作復雜，難以做成商品化總結基于PCR信號放大檢測方法，