1、乳酸菌檢驗操作規范培訓乳酸菌檢驗操作規范培訓質量管理部質量管理部目錄目錄一、一、乳酸菌乳酸菌二、儀器設備二、儀器設備三、三、 培養基培養基四、無菌室準備四、無菌室準備五、接種培養五、接種培養六、菌落計數六、菌落計數七、乳酸菌在改良七、乳酸菌在改良MC培養基上菌落特征培養基上菌落特征八、過氧化氫酶試驗八、過氧化氫酶試驗一、一、乳酸菌乳酸菌1 1、乳酸菌的概念、乳酸菌的概念乳酸菌一詞并非生物分類學名詞，而是指乳酸菌一詞并非生物分類學名詞，而是指能夠利用發酵性糖類產生大量乳酸的一類能夠利用發酵性糖類產生大量乳酸的一類微生物的統稱。微生物的統稱。通常將乳酸細菌之類群稱為乳酸菌。通常將乳酸細菌之類群稱為

2、乳酸菌。2 2、乳酸菌主要分布、乳酸菌主要分布乳桿菌屬（乳桿菌屬（LactobacillusLactobacillus） 鏈球菌屬（鏈球菌屬（StreptococcusStreptococcus）明串珠菌屬（明串珠菌屬（LeuconostocLeuconostoc）片球菌屬（片球菌屬（PediococcusPediococcus）雙歧桿菌屬（雙歧桿菌屬（BifidobacteriumBifidobacterium）（一）乳桿菌屬（一）乳桿菌屬（LactobacillusLactobacillus）1乳桿菌屬的形態特征乳桿菌屬的形態特征 細胞呈桿狀，多為長桿狀、短桿狀及棒桿狀，一細胞呈桿狀，多為

3、長桿狀、短桿狀及棒桿狀，一般成短鏈排列。革蘭氏染色陽性，通常不運動，般成短鏈排列。革蘭氏染色陽性，通常不運動，無芽孢。無芽孢。2乳桿菌屬的生物學特點乳桿菌屬的生物學特點 化能異養型，營養要求嚴格，生長繁殖需要多種化能異養型，營養要求嚴格，生長繁殖需要多種氨基酸、維生素、肽、核酸衍生物。氨基酸、維生素、肽、核酸衍生物。 厭氧、耐氧性厭氧或兼性厭氧厭氧、耐氧性厭氧或兼性厭氧 生長最適生長最適pH為為5.56.2，在，在pH5的環境中可生長，的環境中可生長，而中性或初始堿性條件下生長速率降低。而中性或初始堿性條件下生長速率降低。生長溫度范圍，生長溫度范圍，253，最適生長溫度，最適生長溫度3040。

4、 3乳桿菌屬的代表種乳桿菌屬的代表種 3.1保加利亞乳桿菌（保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）細胞形態長桿狀，兩端鈍圓。細胞形態長桿狀，兩端鈍圓。固體培養基生長的菌落呈棉花狀，易與其它乳酸固體培養基生長的菌落呈棉花狀，易與其它乳酸菌區別。菌區別。能利用葡萄糖、果糖、乳糖進行同型乳酸發酵產能利用葡萄糖、果糖、乳糖進行同型乳酸發酵產生生D型乳酸（有酸澀味，適口性差），不能利型乳酸（有酸澀味，適口性差），不能利用蔗糖。用蔗糖。該菌是乳酸菌中產酸能力最強的菌種。該菌是乳酸菌中產酸能力最強的菌種。蛋白質分解力較弱，發酵乳中可產生香味物質蛋白質分解力較弱，發酵乳中可產生香味物質乙醛。乙醛。最適生長

5、溫度最適生長溫度3745，溫度高于，溫度高于50或低于或低于20不生長。不生長。常作為發酵酸奶的生產菌。常作為發酵酸奶的生產菌。 3.2嗜酸乳桿菌（嗜酸乳桿菌（L.acidophilus） 細胞形態比保加利亞乳桿菌小，呈細長桿狀，能細胞形態比保加利亞乳桿菌小，呈細長桿狀，能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖進行同型乳酸發利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖進行同型乳酸發酵產生乳酸。酵產生乳酸。最適生長溫度最適生長溫度37，20以下不生長，耐熱性差。以下不生長，耐熱性差。蛋白質分解力較弱。蛋白質分解力較弱。 最適生長最適生長pH 5.56.0，耐酸性強，能在其它乳酸，耐酸性強，能在其它乳酸菌不能生長的酸性環境

6、中生長繁殖。菌不能生長的酸性環境中生長繁殖。嗜酸乳桿菌是能夠在人體腸道定殖的少數有益微嗜酸乳桿菌是能夠在人體腸道定殖的少數有益微生物菌群之一，其代謝產物有機酸和抗菌物質生物菌群之一，其代謝產物有機酸和抗菌物質乳桿菌素可抑制病原菌和腐敗菌的生長。乳桿菌素可抑制病原菌和腐敗菌的生長。 （二）鏈球菌屬（二）鏈球菌屬（Streptococcus）1鏈球菌屬的形態特征鏈球菌屬的形態特征 細胞呈球形或卵圓形，成對或成鏈排列。革蘭氏細胞呈球形或卵圓形，成對或成鏈排列。革蘭氏染色陽性，無芽孢，一般不運動，不產生色素。染色陽性，無芽孢，一般不運動，不產生色素。2鏈球菌屬的生物學特點鏈球菌屬的生物學特點 化能異養

7、型，同型乳酸發酵產生右旋乳酸；化能異養型，同型乳酸發酵產生右旋乳酸；兼性厭氧型，接觸酶反應陰性，厭氧培養兼性厭氧型，接觸酶反應陰性，厭氧培養生長良好。生長良好。 3鏈球菌屬的代表種鏈球菌屬的代表種 嗜熱鏈球菌（嗜熱鏈球菌（St.thermophilus） 細胞形態呈鏈球狀。細胞形態呈鏈球狀。能利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖進行發酵產生乳能利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖進行發酵產生乳酸酸 。蛋白質分解力較弱，在發酵乳中可產生香味物質雙蛋白質分解力較弱，在發酵乳中可產生香味物質雙乙酰。乙酰。 該菌主要特征是能在高溫條件下產酸，最適生長溫該菌主要特征是能在高溫條件下產酸，最適生長溫度度4045，溫度低于

8、，溫度低于20不產酸。耐熱性強，能不產酸。耐熱性強，能耐耐6568的高溫。的高溫。（三）明串珠菌屬（三）明串珠菌屬（Leuconostoc） 菌落一般小于菌落一般小于1.0mm，光滑、圓形、灰白色，光滑、圓形、灰白色 細胞球形或豆狀，成對或成鏈排列細胞球形或豆狀，成對或成鏈排列 。革蘭氏染色陽性，不運動，無芽孢。革蘭氏染色陽性，不運動，無芽孢。（四）雙歧桿菌屬（四）雙歧桿菌屬（Bifidobacterium） 1雙歧桿菌屬的形態特征雙歧桿菌屬的形態特征 細胞呈多樣形態：細胞呈多樣形態：Y字型、字型、V字型、彎曲狀、勺型，字型、彎曲狀、勺型，典型形態為分叉桿菌典型形態為分叉桿菌 革蘭氏染色陽性，

9、亞甲基蘭染色菌體著色不規則。革蘭氏染色陽性，亞甲基蘭染色菌體著色不規則。無芽孢和鞭毛，不運動。無芽孢和鞭毛，不運動。 2雙歧桿菌屬的生物學特點雙歧桿菌屬的生物學特點 化能異養型，對營養要求苛刻，生長繁殖需要多化能異養型，對營養要求苛刻，生長繁殖需要多種雙歧因子種雙歧因子 。能利用葡萄糖、果糖、乳糖和半乳糖，生成乳酸能利用葡萄糖、果糖、乳糖和半乳糖，生成乳酸和乙酸及少量的甲酸和琥珀酸。和乙酸及少量的甲酸和琥珀酸。 蛋白質分解力微弱。蛋白質分解力微弱。專性厭氧，但不同菌種或菌株對氧的敏感性存在專性厭氧，但不同菌種或菌株對氧的敏感性存在差異，多次傳代培養后，菌株的耐氧性增強。差異，多次傳代培養后，菌

10、株的耐氧性增強。生長溫度范圍生長溫度范圍2545，最適生長溫度，最適生長溫度37。生長生長pH值范圍值范圍4.58.5，最適生長起始，最適生長起始pH值值6.57.0，不耐酸，酸性環境（，不耐酸，酸性環境（pH5.5）對菌體存活不）對菌體存活不利。利。 3、代表種、代表種 人體腸道中共有人體腸道中共有8種，其中數量最多的種，其中數量最多的5種為：種為：兩歧雙歧桿菌（兩歧雙歧桿菌（B.bifidum）嬰兒雙歧桿菌（嬰兒雙歧桿菌（B.infantis）青春雙歧桿菌（青春雙歧桿菌（B.adolescentis）長雙歧桿菌（長雙歧桿菌（B.longum）短雙歧桿菌短雙歧桿菌(B.breve)4、雙歧桿

11、菌功能、雙歧桿菌功能是人體腸道有益菌群，它可定殖在宿主的腸粘膜是人體腸道有益菌群，它可定殖在宿主的腸粘膜上形成生物學屏障上形成生物學屏障 具有拮抗致病菌、改善微生態平衡、合成多種微具有拮抗致病菌、改善微生態平衡、合成多種微生素、提供營養、抗腫瘤、降低內毒素、提高免生素、提供營養、抗腫瘤、降低內毒素、提高免疫力、保護造血器官、降低膽固醇水平等重要生疫力、保護造血器官、降低膽固醇水平等重要生理功能，其促進人體健康的有益作用，遠遠超過理功能，其促進人體健康的有益作用，遠遠超過其它乳酸菌。其它乳酸菌。 二、檢測儀器設備二、檢測儀器設備 冰箱：冰箱：04恒溫培養箱：恒溫培養箱：361恒溫水浴鍋：恒溫水浴

12、鍋：461微生物顯微鏡微生物顯微鏡架盤藥物天平：架盤藥物天平：0g500g，精確至，精確至0.5g三角瓶：三角瓶：500ml滅菌刻度吸管：滅菌刻度吸管：1ml、10ml 滅菌平皿：直徑滅菌平皿：直徑90mm三、三、 培養基培養基 1、改良、改良MC培養基培養基 成分：大豆蛋白胨，成分：大豆蛋白胨，5g；牛肉浸膏，；牛肉浸膏，5g;酵母酵母浸膏，浸膏，5g；葡萄糖，；葡萄糖，20g；乳糖，；乳糖， 20g；碳酸；碳酸鈣，鈣， 10g；瓊脂，；瓊脂，15g；蒸餾水，；蒸餾水，1000mL；1的中性紅溶液，的中性紅溶液，5mL；硫酸多粘菌素；硫酸多粘菌素B，10萬萬IU。 11515分鐘高壓滅菌備用

13、。分鐘高壓滅菌備用。2、培養基的準備、培養基的準備使用前，將滅菌培養基用微波爐或水浴鍋使用前，將滅菌培養基用微波爐或水浴鍋加熱溶解，在加熱溶解，在4045水浴中保溫待用。水浴中保溫待用。四、無菌室準備四、無菌室準備無菌室使用前后，用紫外燈照射無菌室使用前后，用紫外燈照射3040min。將。將工作服、工作帽和工作鞋放入無菌室進行滅菌，工作服、工作帽和工作鞋放入無菌室進行滅菌，進入無菌室前換上工作服、工作帽和工作鞋。進入無菌室前換上工作服、工作帽和工作鞋。超凈工作臺面，使用前用超凈工作臺面，使用前用75%酒精擦拭消毒后，酒精擦拭消毒后，用紫外燈照射用紫外燈照射4045min；操作結束后，用潔凈；操

14、作結束后，用潔凈抹布將操作臺面擦拭干凈后，用抹布將操作臺面擦拭干凈后，用75%的酒精棉球的酒精棉球進行擦拭，開啟紫外燈照射進行擦拭，開啟紫外燈照射4045min。五、接種培養五、接種培養 以無菌操作，用以無菌操作，用1ml滅菌刻度吸管吸取滅菌刻度吸管吸取1ml樣品原液，注入含有滅菌生理鹽水的試管樣品原液，注入含有滅菌生理鹽水的試管內，充分振搖，制成內，充分振搖，制成1:10的稀釋液。的稀釋液。注意：刻度吸管尖端不要觸及試管內生理注意：刻度吸管尖端不要觸及試管內生理鹽水。鹽水。用用1ml滅菌刻度吸管吸取滅菌刻度吸管吸取1ml1:10的稀釋液，注的稀釋液，注入含有滅菌生理鹽水的試管內，振搖試管，混

15、入含有滅菌生理鹽水的試管內，振搖試管，混合均勻。合均勻。注意：吸取稀釋液前，用刻度吸管吹打，使稀注意：吸取稀釋液前，用刻度吸管吹打，使稀 釋混合均勻。刻度吸管尖端不要觸及管內稀釋釋混合均勻。刻度吸管尖端不要觸及管內稀釋液。液。另取另取1ml滅菌刻度吸管，按上述操作順序，滅菌刻度吸管，按上述操作順序，做做10倍遞增稀釋液，如此每遞增一次，即倍遞增稀釋液，如此每遞增一次，即換用換用1支支1ml滅菌刻度吸管。滅菌刻度吸管。在無菌操作條件下，用在無菌操作條件下，用1ml滅菌刻度吸管吸滅菌刻度吸管吸取選定的樣品稀釋液或原液至滅菌平皿內。取選定的樣品稀釋液或原液至滅菌平皿內。 同上對同一樣品重復操作，即每

16、個選定的適同上對同一樣品重復操作，即每個選定的適當的樣品稀釋液做兩個平皿。當的樣品稀釋液做兩個平皿。 按以上步驟，以按以上步驟，以1ml滅菌生理鹽水作為空白操滅菌生理鹽水作為空白操作對照。作對照。 在無菌操作條件下，將約在無菌操作條件下，將約15ml的改良的改良MC培培養基傾入樣品平皿中，將平皿置于操作臺面養基傾入樣品平皿中，將平皿置于操作臺面上輕輕轉動，使樣品和培養基混合均勻。上輕輕轉動，使樣品和培養基混合均勻。 接種培養操作錄像接種培養操作錄像檢測檢測乳酸菌檢測乳酸菌檢測.MPG討論討論錄像中存在細節問題：錄像中存在細節問題：1、拿平板前先消毒手、拿平板前先消毒手2、倒培養基前要對培養基的

17、瓶進行消毒，、倒培養基前要對培養基的瓶進行消毒，可以酒精棉球消毒和酒精燈外焰消毒。可以酒精棉球消毒和酒精燈外焰消毒。待培養基凝固后，將平皿翻轉，即有培養待培養基凝固后，將平皿翻轉，即有培養基的一面向上。基的一面向上。 將所有平皿置于將所有平皿置于361培養箱中，培養培養箱中，培養723h，觀察乳酸菌菌落特征。，觀察乳酸菌菌落特征。 六、菌落計數六、菌落計數 選取菌落數在選取菌落數在30300之間的平皿進行計數。之間的平皿進行計數。 計數后，隨機挑取五個菌落進行革蘭氏染色，顯計數后，隨機挑取五個菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡檢查并做過氧化氫酶試驗。微鏡檢查并做過氧化氫酶試驗。 革蘭氏陽性，過氧化氫酶

18、陰性，無芽孢的球菌或革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性，無芽孢的球菌或桿菌可定為乳酸菌。桿菌可定為乳酸菌。根據證實為乳酸菌菌落計算出該皿內的乳酸菌數，根據證實為乳酸菌菌落計算出該皿內的乳酸菌數，乘以其稀釋倍數即得每毫升樣品中乳酸菌數。乘以其稀釋倍數即得每毫升樣品中乳酸菌數。例如檢樣例如檢樣10-4的稀釋液在改良的稀釋液在改良MC平板上，生成可平板上，生成可疑菌落為疑菌落為35個，取五個鑒定，證實為乳酸菌的是四個，取五個鑒定，證實為乳酸菌的是四個，則個，則1ml樣品中乳酸菌數為：樣品中乳酸菌數為：35*4/5*104=2.8*105。 七、乳酸菌在改良七、乳酸菌在改良MC培養基上菌落特征培養基上菌落特征菌體菌體改改 良良 MC桿菌桿菌平皿底為粉紅色，菌落較小，圓形、平皿底為粉紅色，菌落較小，圓形、紅色、邊緣似星狀，直徑紅