1、INTRACELLULAR COMPARTMENT AND PROTEINS SORTING第十二章內膜系統（細胞內功能區隔與蛋白質分選）第一節 蛋白質分選的基本原理第二節 膜泡運輸第三節 內質網第四節 高爾基體第五節 溶酶體與過氧化物酶體定義：結構、功能和發生上相關的內膜形成的細胞結構稱為細胞內膜系統。功能：區隔化；增加內表面積，提高代謝和調節能力。系統發生上內膜起源于質膜的內陷和內共生。個體發生上新細胞的內膜系統來源于原有內膜系統的分裂，具有epigenetic的特性。 細胞內合成的蛋白質、脂類等物質之所以能夠定向的轉運到特定的細胞器取決于兩個方面： 其一是蛋白質中包含特殊的信號序列信號序

2、列（signal sequence）。 其二是細胞器上具特定的信號識別裝置識別裝置（分選受體，sorting receptor）。一、蛋白質分選信號信號序列（signal sequence）：引導蛋白質定向轉移的線性序列，通常15-60個氨基酸殘基，對所引導的蛋白質沒有特異性要求。信號斑（signal patch）：存在于完成折疊的蛋白質中，構成信號斑的信號序列之間可以不相鄰，折疊在一起構成蛋白質分選的信號。signal sequence and signal patch二、蛋白質分選運輸機制1、門控運輸（gated transport）：如通過核孔復合體的運輸。2、跨膜運輸（transmem

3、brane transport）：蛋白質通過跨膜通道進入目的細胞器。3、膜泡運輸（vesicular transport）：蛋白質在內質網或高爾基體中被包裝成衣被小泡，選擇性地運輸到靶細胞器。第二節 胞內膜泡運輸細胞內膜系統之間的物質傳遞常常通過膜泡運輸方式進行。大多數運輸小泡是在膜的特定區域以出芽的方式產生。其表面具有一個籠子狀的由蛋白質構成的衣被（coat）。這種衣被在運輸小泡與靶細胞器的膜融合之前解體。衣被小泡在細胞內沿微管運輸。與膜泡運輸有關的馬達蛋白有3類，在這些馬達蛋白的牽引下，可將膜泡運到特定的區域。動力蛋白（dynein），趨向微管負端；驅動蛋白（kinesin），趨向微管正端

4、；肌球蛋白（myosin），趨向微絲的正極。一、衣被類型已知三類：1.籠形蛋白（clathrin）2.COPI3.COPII主要作用：1.選擇性的將特定蛋白聚集在一起，形成運輸小泡；2.如同模具一樣決定運輸小泡的外部特征。三種衣被小泡的功能衣被類型 GTP酶組成與銜接蛋白運輸方向clathrinARFClathrin重鏈與輕鏈，AP2質膜內體Clathrin重鏈與輕鏈，AP1高爾基體內體Clathrin重鏈與輕鏈，AP3高爾基體溶酶體，植物液泡COP IARFCOP高爾基體內質網COP IISar 1Sec23/Sec24復合體，Sec 13/31復合體，Sec 16內質網高爾基體（一）籠形蛋

5、白衣被小泡相關運輸途徑：質膜內體；高爾基體內體；高爾基體溶酶體、植物液泡。結構：3個重鏈和3個輕鏈，形成具有3個曲臂的形狀。許多籠形蛋白的曲臂部分交織在一起，形成具有5邊形網孔的籠子。銜接蛋白(adaptin)：目前至少發現4種，結合不同的受體。 Clathrin coated vesiclesDeep-etch view of a typical clathrin latticeSelective transport by clathrin coated vesicles當籠形蛋白衣被小泡形成時，可溶性蛋白dynamin聚集成一圈圍繞在芽的頸部，將小泡柄部的膜盡可能地拉近（小于1.5nm），

6、從而導致膜融合，掐斷（pinch off）衣被小泡。 （二）COP I衣被小泡功能：負責回收、轉運內質網逃逸蛋白（escaped proteins）返回內質網，由7種蛋白組成。回收信號：Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）。COP I也介導高爾基體不同區域間的蛋白質運輸。 COP I VesiclesCop I and II VesiclesLys-Asp-Glu-Leu（KDEL）（三）COP衣被小泡介導從內質網到高爾基體的物質運輸。形成的部位稱為內質網出口，該處無核糖體。主要亞基：Sar1GTP、Sec23/Sec24、Sec13/Sec31。多數跨膜蛋白直接與COP II結合，少數

7、跨膜蛋白和多數可溶性蛋白通過受體與COP II結合。分選信號位于跨膜蛋白胞質面，形式多樣，有些包含雙酸性基序DEXDE ，如Asp-X-Glu。COP II VesiclesCOPII Coated vesicle二、衣被形成衣被召集GTP酶為G蛋白。包括ARF和SAR 1，調節因子有：鳥苷酸交換因子（ GEF）；GTP酶激活蛋白（GAP）。ARF參與高爾基體上clathrin與COP I衣被的形成。SAR 1參與內質網上COP II衣被的形成。衣被召集GTP酶存在于細胞質。ER上形成COPII小泡時，SAR1釋放GDP，結合GTP而激活。激活的SAR 1暴露出一條脂肪酸的尾巴，插入ER膜，促

8、進衣被蛋白的核化和組裝。活化的SAR1可激活磷脂酶D，將一些磷脂水解，使衣被蛋白牢固地結合在膜上。當小泡從膜上釋放后，衣被很快就解體。Coat assembly三、膜泡運輸的定向機制（一）SNAREs 介導運輸小泡與靶膜的融合。分為v-SNAREs和t-SNAREs。具有一個螺旋結構域，相互纏繞形成跨SNAREs復合體，將小泡與靶膜拉在一起。SNAREsSNAREs in vesicle transport神經細胞中，SNAREs負責突觸小泡的停泊和融合。破傷風毒素和肉毒素能選擇性地降解SNAREs，阻斷神經傳導。病毒融合蛋白的工作原理與SNAREs相似，介導病毒與宿主質膜的融合。 HIV f

9、usion proteinSNAREs的分離：由NSF催化，以ATP為能量，插入幾個適配蛋白將SNAREs復合體分開，以便開始下一輪的轉運。（二）RabsRabs也叫targeting GTPase，屬于G蛋白，起分子開關作用。已知30余種，不同膜上具有不同的Rabs。Rabs促進和調節運輸小泡的停泊和融合。Rabs還有許多效應因子，幫助運輸小泡聚集和靠近靶膜，觸發SNAREs抑制因子。 Rabs in docking四、受體介導的內吞批量內吞（Bulk-phase endocytosis）：非特異性的攝入細胞外物質，穴樣內陷（caveolae）是發生批量內吞的部位。受體介導的內吞 (rece

10、ptor mediated endocytosis)是一種選擇濃縮機制。LDL、運鐵蛋白、生長因子、胰島素等都通過RME轉運。 衣被小窩（coated pits）是質膜內凹的部位，相當于分子過濾器(約占肝細胞表面積2%)。受體、籠形蛋白和銜接蛋白大量集中于此處。受體胞質端的Tyr-X-X-是銜接蛋白識別的信號，X為任何氨基酸，為分子較大的疏水氨基酸(如Phe、Leu、Met)。受體同配體結合后啟動內化作用，衣被開始組裝。Clathrin coated piton the cytosolic face of a cell低密脂蛋白的吸收：膽固醇主要在肝細胞中合成，以低密脂蛋白（low-densi

11、ty lipoproteins，LDL）釋放到血液。LDL顆粒芯部含有被長鏈脂肪酸酯化的膽固醇分子。周圍由磷脂和膽固醇構成的脂單層包圍，有一個較大的Apo-B蛋白（配體）。LDL ParticleLDL endocytosis細胞需要膽固醇時，合成LDL跨膜受體蛋白。受體與LDL顆粒結合后，形成衣被小泡；進入細胞質的衣被小泡隨即脫掉成籠蛋白衣被，成為平滑小泡，同早期內體融合，內體中PH值低，使受體與LDL顆粒分離；再經晚期內體將LDL送人溶酶體。在溶酶體中，LDL被水解成游離的膽固醇。The receptor-mediated endocytosis of LDLLDL Endocytosis

12、受體回收途徑：大部分返回原來的質膜結構域，如LDL受體；有些進入溶酶體被消化，如EGF的受體，稱為受體下行調節（receptor down-regulation）；有些被運至質膜不同的結構域，形成穿胞運輸（transcytosis）。Transcytosis五、外排作用組成型的外排途徑：由TGN區分泌囊泡向質膜運輸，通過default pathway完成轉運。更新膜蛋白和膜脂、形成ECM、營養成分或信號分子。調節型外排途徑：如激素或酶儲于分泌泡內，當細胞在受到胞外信號刺激時，分泌泡釋放出去。The constitutive and regulated secretory pathways第三節

13、 內質網Porter等于1945年發現于培養的小鼠成纖維細胞，因最初看到的是位于細胞質內部的網狀結構，故名endoplasmic reticulum，ER。一、形態與組成約占細胞總膜面積的一半，是封閉的網絡系統。分為RER和SER。RER呈扁平囊狀，排列整齊，有核糖體附著。SER呈分支管狀或小泡狀，無核糖體附著。細胞不含純粹的RER或SER，它們分別是ER連續結構的一部分。 RERSERER膜含60%的蛋白和40%的脂類，PC含量較高，SM含量較少，沒有或很少含膽固醇。ER約有30多種膜結合蛋白，另有30多種位于內質網腔。其中葡糖-6-磷酸酶是標志酶，核糖體結合糖蛋白（ribophorin）只

14、分布在RER，P450酶系只分布在SER。 二、ER的功能（一）蛋白質合成內質網上合成的蛋白主要有：1.向細胞外分泌的蛋白、如抗體、激素；2.膜的整合蛋白；3.需要與其它細胞組分嚴格分開的酶，如溶酶體的各種水解酶；4.需要進行修飾的蛋白，如糖蛋白。Blobel等（1975）提出信號假說，認為蛋白質N端的信號肽，指導蛋白質轉至內質網上合成，獲1999年諾貝爾生理醫學獎。Blobel with members of his laboratoryGnter Blobel蛋白質轉移到內質網合成涉及以下成分：1.信號肽，位于N端，約1630個氨基酸，含有6-15個連續排列的帶正電荷的非極性氨基酸，又稱開

15、始轉移序列。2.信號識別顆粒（SRP），屬于RNP，由6種多肽和一個7S RNA組成。能與信號序列結合，導致蛋白質合成暫停。AA Sequences of ER Signal Peptides3.SRP受體，內質網膜的整合蛋白，異二聚體，可與SRP特異結合。4.停止轉移序列，與內質網膜的親合力很高，阻止肽鏈繼續進入網腔，成為跨膜蛋白。5.轉位因子，由3-4個Sec61蛋白構成的通道，每個Sec61由3條肽鏈組成。 Translocation of proteins across ER蛋白質轉入內質網合成的過程：信號肽與SRP結合肽鏈延伸終止SRP與受體結合SRP脫離信號肽肽鏈在內質網上繼續合成

16、信號肽切除肽鏈延伸至終止。這種肽鏈邊合成邊向內質網腔轉移的方式，稱為co-translation。Insertion of Transmembrane protein into the ER membrane（二）蛋白質的修飾與加工包括糖基化、羥基化、酰基化、二硫鍵形成等，幾乎所有內質網上合成的蛋白質最終被糖基化。糖基化的作用：使蛋白質能夠抵抗消化酶的作用；賦予蛋白質傳導信號的功能；某些蛋白只有在糖基化之后才能正確折疊。糖基一般連接在4種氨基酸上，分為2種：N-連接的糖基化：與天冬酰胺殘基的NH2連接，糖為N-乙酰葡糖胺。O-連接的糖基化：與Ser、Thr和Hyp的OH連接，連接的糖為半乳糖或

17、N-乙酰半乳糖胺，在高爾基體上進行。內質網上進行N-連接的糖基化。糖的供體為核苷糖，如GDP-甘露糖、UDP-N-乙酰葡糖胺。糖分子首先被糖基轉移酶轉移到膜上的磷酸長醇分子上，裝配成寡糖鏈。再被寡糖轉移酶轉到Asn-X-Ser或Asn-X-Thr的Asn上。 Protein glycosylation in RERProtein glycosylation in RERProtein glycosylation in RER（三）新生肽鏈的折疊、組裝和運輸蛋白質折疊是在hsp70家族的ATP酶的作用下完成的 。無法正確折疊的蛋白被轉入溶酶體降解，約90%的新合成T細胞受體亞單位和Ach受體都被

18、降解，而從未到達靶膜。COP II介導由ER輸出的膜泡運輸。（四）內質網的其它作用1.合成磷脂、膽固醇等，經膜泡運輸轉運至高爾基體、質膜等，或借磷脂轉移蛋白（PTP）形成水溶性復合物，轉至其他膜上。2.解毒，如肝細胞的細胞色素P450酶系。3.參與甾體類激素的合成。4.使葡糖6-磷酸水解，釋放糖至血液中。5.儲存鈣離子，作為細胞內信號物質，如肌質網。6.提供酶附著的位點和機械支撐作用。發現于1855年，1889年，Golgi用銀染法，在貓頭鷹的神經細胞內觀察到了清晰的結構，因此定名為高爾基體。一、形態與組成由扁平囊泡堆積而成，有極性。通常48個(某些藻類較多)扁平囊在一起，構成高爾基體的主體(

19、Golgi stack)。分布于ER與細胞膜間，呈弓形或半球形。凸出的一面對著ER稱為順面（cis face），凹進的一面對著質膜稱為反面（trans face）。Structure of the Golgi ComplexDistribution，nucleus green，Golgi body red膜含有約60%的蛋白和40%的脂類，具有一些和ER共同的蛋白成分。PC的含量介于ER和質膜之間，中性脂類有膽固醇，膽固醇酯和甘油三酯。主要的酶有糖基轉移酶、磺基-糖基轉移酶、氧化還原酶、磷酸酶、蛋白激酶、甘露糖苷酶、轉移酶和磷脂酶等。 標志酶為糖基轉移酶。二、功能區隔1.cis Golgi n

20、etwork，CGN是入口區域。2.medial Golgi，多數糖基修飾，糖脂的形成以及與高爾基體有關的糖合成均發生此處。3.trans Golgi network，TGN是出口區域，參與蛋白質的分類與包裝，最后輸出。 Golgi network高爾基體不同區域的細胞化學反應：嗜鋨反應：cis面膜囊被特異地染色；TPP酶：trans面的膜囊；NADP酶：顯示中間的膜囊；CMP酶：trans面的囊狀和管狀結構。三、主要功能1、參與細胞分泌活動RER上合成蛋白質進入ER腔COPII運輸泡進入CGN在medial Gdgi中加工在TGN形成運輸泡與質膜融合、排出。高爾基體依據信號序列或信號斑對蛋白

21、質分類。2、蛋白質的糖基化O-連接的糖基化，糖的供體為核苷糖。3、進行膜的轉化功能內質網上合成的新膜脂轉移至高爾基體后，經過修飾和加工，形成運輸泡與質膜融合。4、將蛋白水解為活性物質如將胰島素C端切除；或將神經肽前體降解為活性片段。5、參與形成溶酶體。6、植物細胞壁的形成，合成纖維素和果膠質。第五節 溶酶體與過氧化物酶體Lysosome為de Duve與Novikoff 1955年發現。過氧化物酶體peroxisome由J. Rhodin1954在鼠腎小管上皮細胞中發現。 一、溶酶體的結構含酸性水解酶（最適pH=5），執行細胞內消化。具有異質性，酸性磷酸酶是標志酶。膜有質子泵，溶酶體內pH值低

22、。膜蛋白高度糖基化。1、初級溶酶體（primary lysosome）由高爾基體分泌形成，含多種酸性水解酶。2、次級溶酶體（secondary lysosome）是正在進行或完成消化作用的溶酶體，分為自噬溶酶體和異噬溶酶體。3、殘體（residual body）又稱后溶酶體（post-lysosome），已失去酶活性，僅留未消化的殘渣，故名。可通過外排作用排出細胞，也可能留在細胞內逐年增多，如表皮細胞的老年斑，肝細胞的脂褐質。Secondary lysosome肝細胞脂褐質肝細胞脂褐質二、溶酶體的功能1.細胞內消化：如從LDL釋放膽固醇，單細胞真核生物利用溶酶體的消化食物。2.自體吞噬：清除無

23、用的生物大分子，衰老細胞、細胞器、個體發育中多余的細胞。3.防御作用：如巨噬細胞。4.參與分泌過程的調節：如將甲狀腺球蛋白降解成有活性的甲狀腺素。5.形成精子的頂體。 三、溶酶體的發生在高爾基體的trans面以出芽的方式形成：前溶酶體蛋白N-連接的糖基化進入高爾基體磷酸轉移酶識別信號斑將N-乙酰葡糖胺磷酸轉移在12個甘露糖殘基上在中間膜囊切去N-乙酰葡糖胺形成M6P配體與trans膜囊上M6P受體結合通過clathrin衣被包裝成運輸小泡與晚期的內體融合，受體解離切除甘露糖殘基上的磷酸 。The recognition of a lysosomal hydrolase in Golgi and mannose phosphorylation Transport of newly synthesized hy