1、免疫組化基本技術免疫組化基本技術 主要內容主要內容一、實驗的設計一、實驗的設計二、石蠟切片的脫蠟至水二、石蠟切片的脫蠟至水三、內源性酶的消除方法三、內源性酶的消除方法四、四、IHC的非特異性染色的非特異性染色五、抗原的暴露和修復五、抗原的暴露和修復六、抗體的購置及注意事項六、抗體的購置及注意事項七、抗體最佳稀釋度的測定和保存七、抗體最佳稀釋度的測定和保存 八、顯示系統及襯染劑的選擇和配制八、顯示系統及襯染劑的選擇和配制 九、九、IHC常用緩沖液常用緩沖液一、實驗的設計一、實驗的設計 1.查閱相關文獻，列出要做的查閱相關文獻，列出要做的IHC指標，根據經費情況，選擇相指標，根據經費情況，選擇相關

2、公司購置特異性抗體和檢測試劑。關公司購置特異性抗體和檢測試劑。2.2.列出列出IHCIHC實驗操作流程，選擇何種實驗操作流程，選擇何種IHCIHC前前 處理方式。處理方式。3.3.通過預實驗尋找第一抗體的最佳稀釋度，通過預實驗尋找第一抗體的最佳稀釋度， 應設置何種對照。應設置何種對照。4.每批實驗應用同一稀釋度的一抗，孵育每批實驗應用同一稀釋度的一抗，孵育 時間和溫度，同一的顯色時間。時間和溫度，同一的顯色時間。5.列出陽性判定的標準列出陽性判定的標準6.預期達到的目標預期達到的目標組織與細胞材料的制備組織與細胞材料的制備1.1.手術切除標本的取材：手術切除標本的取材： 抗原在組織中的分布常不

3、均一，取材抗原在組織中的分布常不均一，取材時應考慮：主要病灶，病灶與正常組織交時應考慮：主要病灶，病灶與正常組織交界處，遠離病灶的正常組織。界處，遠離病灶的正常組織。組織大小：組織大小：長長1cm寬寬1cm厚厚0.20.3cm。2.2.各種小組織的活檢取材：各種小組織的活檢取材： 它不僅體積小，取材困難，不易取到它不僅體積小，取材困難，不易取到主要病灶，因此對標本的處理應特別慎重，主要病灶，因此對標本的處理應特別慎重，及時固定，包埋時要平整。及時固定，包埋時要平整。一、組織取材注意事項一、組織取材注意事項 1.組織要求離體后組織要求離體后30min內浸入固定液，內浸入固定液，尤其是開展分子生物

4、學工作。尤其是開展分子生物學工作。2.注意防止人為因素的影響注意防止人為因素的影響 刀和剪要快，刀要足夠長。刀和剪要快，刀要足夠長。3.組織塊的大小組織塊的大小 厚為厚為0.10.10.3cm0.3cm，大小可根據需要而定，大小可根據需要而定4.動物和人體組織的取材位置動物和人體組織的取材位置 要視研究目的，觀察部位而定要視研究目的，觀察部位而定5.取材時間取材時間 原則上，應盡快取材，但比較大的手原則上，應盡快取材，但比較大的手術標本如胃、肺、腸等器官，最好先固定術標本如胃、肺、腸等器官，最好先固定后取材。后取材。 6.注意包埋方向注意包埋方向 7.邊緣標記邊緣標記 8.保持材料的清潔保持材

5、料的清潔 9.切除不需要的部分切除不需要的部分10.明確編號，登記明確編號，登記11.骨組織還需脫鈣骨組織還需脫鈣二、組織標本的固定二、組織標本的固定 1.目的目的 (1)(1)防止組織細胞的死后變化，防止自溶防止組織細胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細胞的固有形態。和腐敗，以保持組織細胞的固有形態。 (2)(2)使細胞內的蛋白質、脂肪、糖和酶等使細胞內的蛋白質、脂肪、糖和酶等各種抗原成份轉變成不溶性物質，以保持它各種抗原成份轉變成不溶性物質，以保持它原有的結構與生活時相仿。原有的結構與生活時相仿。（3 3）使組織中的各種物質沉淀和凝固起）使組織中的各種物質沉淀和凝固起 來而產生不同的

6、折射率，造成光學來而產生不同的折射率，造成光學 上的差異，以便染色后易于鑒別和上的差異，以便染色后易于鑒別和 觀察。觀察。（4 4）固定劑兼有硬化作用、使組織硬化、）固定劑兼有硬化作用、使組織硬化、 增加組織硬度、便于制片。增加組織硬度、便于制片。（5 5）防止細胞過度收縮或膨脹而失）防止細胞過度收縮或膨脹而失 去其原有形態結構。去其原有形態結構。（6 6）經過固定的組織能對染料產生）經過固定的組織能對染料產生 不同的親和力而著色清晰，便不同的親和力而著色清晰，便 于辨認。于辨認。2.2.固定方法的選擇及注意事項固定方法的選擇及注意事項 (1)(1)大小大小 2cm2cm2cm2cm0.3cm

7、0.3cm (2) (2)及時固定及時固定(3)(3)固定時間固定時間 固定時間要視組織塊的厚固定時間要視組織塊的厚薄，固定液的種類及濃度，溫度而定，原薄，固定液的種類及濃度，溫度而定，原則上，組織塊大小與固定時間成正比，固則上，組織塊大小與固定時間成正比，固定液的穿透力及濃度與固定時間成反比。定液的穿透力及濃度與固定時間成反比。(4)(4)組織固定后必須徹底沖洗。組織固定后必須徹底沖洗。三、組織脫水、浸蠟及包埋三、組織脫水、浸蠟及包埋 1.1.目的目的 組織經固定和水洗后含大量水分組織經固定和水洗后含大量水分, ,需需用乙醇類試劑進行脫水用乙醇類試劑進行脫水, ,水脫完后水脫完后, ,組織內

8、含有大組織內含有大量的乙醇量的乙醇, ,還必須用能溶解乙醇的二甲苯來置換還必須用能溶解乙醇的二甲苯來置換, ,最后經浸蠟最后經浸蠟, ,組織細胞內被大量石蠟支稱組織細胞內被大量石蠟支稱, ,才使組才使組織能用于石蠟切片。織能用于石蠟切片。2.2.脫水劑的種類：脫水劑的種類：非石蠟溶劑的脫水劑和非石蠟溶劑的脫水劑和脫水兼石蠟溶劑的脫水劑。脫水兼石蠟溶劑的脫水劑。 常用的脫水劑常用的脫水劑:(1):(1)乙醇；乙醇；(2)(2)丙酮；丙酮；(3)(3)正丁醇；正丁醇；(4)(4)淑丁醇；淑丁醇；(5)(5)環乙酮；環乙酮；(6)(6)松脂醇；松脂醇；(7)(7)二氧陸環。二氧陸環。3.3.常用的透

9、明劑：常用的透明劑：(1)(1)二甲苯；二甲苯；(2)(2)甲苯；甲苯；(3)(3)苯；苯；(4)(4)香柏油；香柏油；(5)(5)苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；(6)(6)氯仿；氯仿；(7)(7)冬青油冬青油;(8);(8)苯胺油苯胺油4.4.原則原則 脫水方法甚多，一般需逐級進行脫水方法甚多，一般需逐級進行脫水，否則可引起組織強烈收縮，組織變脫水，否則可引起組織強烈收縮，組織變形。形。 在脫水完全的前提下，組織的透明必在脫水完全的前提下，組織的透明必須徹底，但不能過長，否則會引起組織切須徹底，但不能過長，否則會引起組織切片困難。片困難。5.5.常規石蠟包埋過程常規石蠟包埋過程(1)(1)脫水：脫

10、水：7575、8585乙醇，乙醇，9595、 乙醇，無水乙醇乙醇，無水乙醇、。(2)(2)透明：二甲苯透明：二甲苯、二甲苯、二甲苯、二甲苯、二甲苯(3)(3)浸蠟：石蠟浸蠟：石蠟、石蠟、石蠟、石蠟、石蠟(4)(4)石蠟包埋：修蠟塊，標號石蠟包埋：修蠟塊，標號四、組織切片四、組織切片 切片可分石蠟切片、冰凍切片、火切片可分石蠟切片、冰凍切片、火棉膠切片，棉膠切片，IHCIHC切片要求不同與常規切切片要求不同與常規切片，需連續有序，防止脫片等特殊要求。片，需連續有序，防止脫片等特殊要求。1.1.切片前的準備工作切片前的準備工作(1)(1)載玻片的清潔：載玻片的清潔：市售載玻片需經清市售載玻片需經清

11、潔液泡潔液泡24h24h，流水沖洗，系列乙醇浸泡，流水沖洗，系列乙醇浸泡，涼干涂膠。涼干涂膠。(2)(2)切片粘合劑的種類切片粘合劑的種類 多聚賴氨酸（分子量多聚賴氨酸（分子量300KD300KD）：）：0.5%0.5%濃度。濃度。 APESAPES試劑（試劑（3-3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干氨基、丙基三氧基硅烷）：干凈載玻片凈載玻片丙酮丙酮5min APES5min APES（1ml+50ml1ml+50ml丙酮）：丙酮）：用鑷子夾住浸入用鑷子夾住浸入APESAPES試劑試劑1 13 3次次純丙酮洗二次純丙酮洗二次干燥玻片干燥玻片用鋁箔包好，室溫或用鋁箔包好，室溫或44保存備用。保存備用。

12、鉻礬明膠液：鉻礬明膠液： 鉻礬鉻礬0.5g 0.5g 明膠明膠5g H5g H2 2O O2 2 1000ml 1000ml甲醛明膠液：甲醛明膠液： 4040甲醛甲醛2.5ml 2.5ml 明膠明膠0.5g H0.5g H2 2O O2 2 100ml 100ml2.2.切片要求及注意事項：切片要求及注意事項： (1)(1)連續切片按序貼在玻片的下連續切片按序貼在玻片的下1/31/3。 (2)52(2)526060烤片烤片18h18h。 (3)(3)切片厚切片厚2 24 4m m。 (4)(4)切片刀要快切片刀要快 (5)(5)編上號編上號 (6)(6)切片可在切片可在44保存數年（石蠟切片）

13、保存數年（石蠟切片）石蠟切片脫蠟至水石蠟切片脫蠟至水 冰凍切片從冰凍切片從-80-80取出，涼干或電吹風取出，涼干或電吹風吹干后可直接進行免疫組化標記。石蠟切吹干后可直接進行免疫組化標記。石蠟切片需經如下脫蠟才能做片需經如下脫蠟才能做IHCIHC。 二甲苯二甲苯10min10min，二甲苯，二甲苯10min10min，二甲苯二甲苯10min10min，無水乙醇，無水乙醇2min2min，9595乙醇乙醇2min2min，8585乙醇乙醇2min2min，7575乙醇乙醇2min2min，流水沖洗。，流水沖洗。五、內源性酶的消除方法五、內源性酶的消除方法(一一)內源性過氧化物酶的消除方法：內源性

14、過氧化物酶的消除方法： 1. 0.3%3%H2O2甲醇液甲醇液20min 2. 1 H2O2 20min 3. 3苯肼溶液苯肼溶液 37 1h 4. 0.075%鹽酸甲醇液鹽酸甲醇液 30min5.DAB-H5.DAB-H2 2O O2 2溶液中加溶液中加0.005M NaN30.005M NaN3 過碘酸過碘酸- -硼酸鈉：硼酸鈉：0.5%0.5%過碘酸過碘酸10min10min， 經洗后經洗后1 1硼酸鈉處理硼酸鈉處理10min10min。7.20mol/L-100mol/L7.20mol/L-100mol/L抗壞血酸抗壞血酸303060min60min。(二二)內源性堿性磷酸酶的消除方法

15、內源性堿性磷酸酶的消除方法 1. 101. 10醋酸醋酸 10min10min 2. 0.5mol/L 2. 0.5mol/L碳酸氫鈉（碳酸氫鈉（pH9.0pH9.0） 20min20min 3. 1mol/L 3. 1mol/L左旋咪唑左旋咪唑 20min20min( (三三) )內源性生物素的消除方法內源性生物素的消除方法 1.1.用用2-2-甲基甲基-D-D苷露糖飽和生物素苷露糖飽和生物素 2.2.先用先用2525g/mlg/ml卵白素孵育卵白素孵育15min15min，PBSPBS洗洗10min10min，移至生物素飽和液中處理，移至生物素飽和液中處理15min15min，PBSPBS

16、洗洗15min15min。六、酶消化和抗原修復六、酶消化和抗原修復 1.1.為什么要進行酶消化和抗原修復？為什么要進行酶消化和抗原修復？(1)(1)固定液的影響固定液的影響 自自18931893年年Ferdinand Ferdinand BlumBlum創立組織固定以來，為了避免組織固創立組織固定以來，為了避免組織固定液對抗原決定簇的影響，已經尋找到幾定液對抗原決定簇的影響，已經尋找到幾十種固定液，目的就是為了對一定抗原起十種固定液，目的就是為了對一定抗原起到保護作用，同時還能獲得良好的組織形到保護作用，同時還能獲得良好的組織形態結構。態結構。目前無一種固定液適用于所有的抗原，從目前無一種固定

17、液適用于所有的抗原，從組織細微結構的保存，穩定、簡便和廉價組織細微結構的保存，穩定、簡便和廉價綜合評估上，甲醛最優。綜合評估上，甲醛最優。 甲醛使蛋白質發生凝固，自身和之甲醛使蛋白質發生凝固，自身和之間會發生交聯，交聯時會使蛋白質的四間會發生交聯，交聯時會使蛋白質的四級和三級結構的折疊方向發生改變，使級和三級結構的折疊方向發生改變，使蛋白質苯環結構上的抗原決定簇發生改蛋白質苯環結構上的抗原決定簇發生改變，而影響檢測。變，而影響檢測。(2)(2)抗體制備的影響抗體制備的影響2.2.酶消化酶消化 (1)(1)原理：原理： 1)1)去除覆蓋于抗原決定簇表面的雜去除覆蓋于抗原決定簇表面的雜蛋白蛋白 2

18、)2)斷交聯斷交聯(2)(2)蛋白酶的種類蛋白酶的種類 胰蛋白酶胰蛋白酶0.05%0.05%0.10.1胰蛋白酶加入胰蛋白酶加入等量的氯化鈣，用等量的氯化鈣，用0.1N NaoH0.1N NaoH調調pHpH至至7.87.8。消化時間消化時間37 30min37 30min。胃蛋白酶胃蛋白酶 0.4%0.4%胃蛋白酶，用胃蛋白酶，用0.1N HCI0.1N HCI稀稀釋，消化時間釋，消化時間37 3037 30180min180min。蛋白酶蛋白酶K K 20 20g/mlg/ml，用，用pH8.0 0.5M pH8.0 0.5M Tris-HCITris-HCI配制，消化時間配制，消化時間3

19、7 2037 2040min40min。鏈酶蛋白酶鏈酶蛋白酶 0.1%0.1%，用，用pH 7.4,0.5M pH 7.4,0.5M Tris-HclTris-Hcl稀釋，消化時間稀釋，消化時間37 137 14h4h。無花果蛋白酶無花果蛋白酶 0.1%0.1%濃度，用濃度，用0.2M 0.2M pH7.4 PBSpH7.4 PBS稀釋，消化時間稀釋，消化時間37 3037 3060min60min。(3)(3)原則及注意事項原則及注意事項 胃蛋白酶和菠蘿蛋白酶主要用于細胞胃蛋白酶和菠蘿蛋白酶主要用于細胞間質抗原的檢測前消化，其余蛋白酶均為間質抗原的檢測前消化，其余蛋白酶均為細胞內抗原的顯示消

20、化。細胞內抗原的顯示消化。 在配制和使用時應考慮到酶激活的最在配制和使用時應考慮到酶激活的最佳佳pHpH值，消化溫度、濃度和孵育時間。值，消化溫度、濃度和孵育時間。3.3.熱誘導的抗原修復：熱誘導的抗原修復：抗原修復抗原修復(Antigen (Antigen Retrieval;AR)Retrieval;AR)是以高溫、高壓對常規固定是以高溫、高壓對常規固定的石蠟切片進行抗原修復或復原的一種非的石蠟切片進行抗原修復或復原的一種非蛋白酶消化以提高抗原抗體陽性檢測的一蛋白酶消化以提高抗原抗體陽性檢測的一種方法和技術手段。種方法和技術手段。(1)(1)依據：依據：4040年代美國學者年代美國學者Fr

21、aenkel-Fraenkel-conratconrat等實驗證實，甲醛和蛋白水解交聯等實驗證實，甲醛和蛋白水解交聯過程中氨基酸側鏈上的某些基團過程中氨基酸側鏈上的某些基團( (抗原決定抗原決定簇簇) )如咪唑、吲哚等基團受到影響，通過如咪唑、吲哚等基團受到影響，通過120120高溫或強堿處理后，可使交聯打開。高溫或強堿處理后，可使交聯打開。(2)(2)修復方式：微波修復方式：微波969610min10min2 2；直接加溫直接加溫100100，15min15min；水浴鍋；水浴鍋100100，15min15min；高壓鍋；高壓鍋/ /消毒鍋消毒鍋120120，5min5min；真空加熱真空加

22、熱10min10min；直接烤片法。；直接烤片法。(3)(3)修復介質：修復介質： 0.01M pH6.00.01M pH6.0檸檬酸緩檸檬酸緩沖液沖液(CB)(CB)；0.05mTris-HCL(pH1-120.05mTris-HCL(pH1-12系系列列););0.01M pH7.0 PBS;0.01M pH7.0 PBS;2%2%硫酸鋁；硫酸鋁；2 2硝酸鋁；生理鹽水；蒸餾水。硝酸鋁；生理鹽水；蒸餾水。認為修復介質種類和溶液的摩爾濃度對修認為修復介質種類和溶液的摩爾濃度對修復效果影響較小，而復效果影響較小，而pHpH值則影響較大。緩值則影響較大。緩沖液以沖液以CBCB和和Tris-HCL

23、Tris-HCL較常見。較常見。(4)(4)溫度與修復時間的關系：許多的實驗結溫度與修復時間的關系：許多的實驗結果表明，溫度高修復時間短，呈正相關。果表明，溫度高修復時間短，呈正相關。例如，例如，Ki-67Ki-67、P-gpP-gp的檢測，利用同一切片，的檢測，利用同一切片，達到相同的染色結果如下步驟：達到相同的染色結果如下步驟：100 100 20min20min；90 40min90 40min；80 60min80 60min；70 20h70 20h。(5)(5)選擇最佳的修復方法選擇最佳的修復方法(6)AR(6)AR應注意的問題：高溫應注意的問題：高溫ARAR因其機理尚因其機理尚不

24、清楚，對某些存在的問題或現象不可能不清楚，對某些存在的問題或現象不可能用設計對照的方法加以解決或解釋清楚，用設計對照的方法加以解決或解釋清楚，例如，有些抗體在冰凍切片上不表達，或例如，有些抗體在冰凍切片上不表達，或表達率很低，但石蠟切片用表達率很低，但石蠟切片用ARAR后，卻能很后，卻能很好地表達；好地表達；某些應表達在胞漿或膜上的抗原，經過量某些應表達在胞漿或膜上的抗原，經過量修復后，絕大部分表達在核內；某些應表修復后，絕大部分表達在核內；某些應表達在核內的抗原，經過量修復后出現在細達在核內的抗原，經過量修復后出現在細胞漿內。因此對結果的判斷要作出客觀的胞漿內。因此對結果的判斷要作出客觀的分

25、析。在操作過程中還應注意如下問題：分析。在操作過程中還應注意如下問題：熱處理后應注意自然冷卻；熱處理后應注意自然冷卻；熱處理液不要讓其煮干；熱處理液不要讓其煮干；不要任何抗原的檢測都使用該方法；不要任何抗原的檢測都使用該方法；一批抗原的檢測其溫度和時間一定保一批抗原的檢測其溫度和時間一定保 持一致；持一致；形態學結構的改變：一般經高溫修復后形態學結構的改變：一般經高溫修復后胞漿無明顯的破壞，而對細胞核內影響較胞漿無明顯的破壞，而對細胞核內影響較大，會出現核破裂，蘇木素淡染等現象。大，會出現核破裂，蘇木素淡染等現象。如果在常用的修復液無法得到陽性結果，如果在常用的修復液無法得到陽性結果，或經修復

26、后抗原定位發生改變，可改用某或經修復后抗原定位發生改變，可改用某些不常用的修復液，或加一些螯合劑，如些不常用的修復液，或加一些螯合劑，如EDTAEDTA和和EGTAEGTA等可改善某些抗原的修復。等可改善某些抗原的修復。七、抗體的購置及注意事項七、抗體的購置及注意事項 1.1.抗體的購置抗體的購置 目前商品化抗體已有目前商品化抗體已有上千種，一種抗體可以有數家公司生產，上千種，一種抗體可以有數家公司生產，其質量的好壞也存在很大差異，首先應選其質量的好壞也存在很大差異，首先應選擇一家好的生產公司，根據文獻提供的信擇一家好的生產公司，根據文獻提供的信息，選擇所需試劑的型號。息，選擇所需試劑的型號。

27、2.2.購置抗體的注意事項購置抗體的注意事項 (1)(1)種屬：單克隆抗體，多克隆抗體種屬：單克隆抗體，多克隆抗體 (2)(2)能否用于石蠟切片能否用于石蠟切片 (3)(3)稀釋度稀釋度 (4)(4)特異性，交叉反應特異性，交叉反應 (5)(5)用何種組織前處理形式用何種組織前處理形式 (6)(6)包裝單位，價格包裝單位，價格3.3.抗體的大致分類抗體的大致分類 (1)(1)癌基因與抗癌基因標記物；癌基因與抗癌基因標記物； (2)(2)細胞凋亡標記物；細胞凋亡標記物； (3)(3)各種信號傳導標記物各種信號傳導標記物 (4)(4)各種正負調控基因標記物各種正負調控基因標記物 (5)(5)細胞增

28、殖及調控標記物；細胞增殖及調控標記物； (6) (6)凝集素類標記物凝集素類標記物 (7)(7)激素受體標記物激素受體標記物 (8)(8)病毒性標記物病毒性標記物 (9)(9)各類腫瘤標記物各類腫瘤標記物 (10)(10)耐藥基因標記物耐藥基因標記物八、抗體最佳稀釋度的測定和保存八、抗體最佳稀釋度的測定和保存 1.1.直接測定法直接測定法一抗稀釋度一抗稀釋度 特異性染色特異性染色 非特異性染色非特異性染色 1:50 + + 1:100 + + 1:200 + + 1:400 + + 1:500 + () 陰性對照陰性對照 () ()2.2.棋盤法棋盤法3.3.抗體稀釋液抗體稀釋液 抗體稀釋液是

29、從事抗體稀釋液是從事IHCIHC工作實驗室必備，其制備方法如下：工作實驗室必備，其制備方法如下：1 1克克明膠明膠( (紅、綠紅、綠) )溶在溶在300ml 0.2M pH7.6 TBS300ml 0.2M pH7.6 TBS中，加溫，攪拌使其溶解，待其冷卻后，中，加溫，攪拌使其溶解，待其冷卻后，加入加入1 1克牛血清白蛋白和克牛血清白蛋白和100mg NaN3100mg NaN3，44保存。保存。4.4.抗體的保存抗體的保存 商品化一抗或自制一抗商品化一抗或自制一抗均需加入防腐劑，在均需加入防腐劑，在44中保存一年其質量中保存一年其質量不會有太多的改變，如一次購置量大，可不會有太多的改變，如

30、一次購置量大，可10l/10l/支分裝，標上號，支分裝，標上號，-40-40保存備用。保存備用。用抗體稀釋液稀釋一抗可在用抗體稀釋液稀釋一抗可在44中保存一年。中保存一年。 十、顯示系統及襯染劑的選擇和配制十、顯示系統及襯染劑的選擇和配制 ( (一一) )顯示系統顯示系統 目前用于目前用于IHC的標記酶主要有的標記酶主要有HRP，AKP，其顯示系統分別為：，其顯示系統分別為：1.HRP1.HRP常用的發色基因：常用的發色基因： (1)3(1)3、3 3- -二氨基聯苯胺鹽酸鹽二氨基聯苯胺鹽酸鹽(3(3、3 3-diaminbezidine;DAB);-diaminbezidine;DAB);

31、(2)3- (2)3-氨基氨基-9-9-乙基卡吧唑乙基卡吧唑(3-amino-(3-amino-9-ethlylcarbazde;AEC);9-ethlylcarbazde;AEC);(3)(3)四甲基聯苯胺；四甲基聯苯胺；(4)(4)鹽酸對苯二胺；鹽酸對苯二胺；(5)4-(5)4-氯氯-1-1-萘酚；萘酚；(6)(6)高香草酸高香草酸(7) (7) 萘酚派若寧萘酚派若寧2.AKP2.AKP常用的發色基團：常用的發色基團： (1)BCIP(1)BCIP（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚基磷酸吲哚基磷酸) )NBT(NBT(硝基四氮唑藍硝基四氮唑藍) )； (2) (2) 萘酚萘酚AS-

32、BIAS-BI磷酸鹽快紅或快磷酸鹽快紅或快藍。藍。3.3.配制方法配制方法 (1)DAB:50mg DAB(1)DAB:50mg DAB溶在溶在0.01M pH7.6 0.01M pH7.6 100ml Tris-Hcl100ml Tris-Hcl中，加入中，加入0.03% H0.03% H2 2O O2 2，顯，顯色色8 812min12min，終產物為不溶性棕褐色顆粒，終產物為不溶性棕褐色顆粒狀。狀。(2)AEC:(2)AEC:取取40mg AEC40mg AEC溶在溶在5ml5ml二甲基甲酰二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，加入胺中，待完全溶解后，加入0.05mol/L 0.05mol/L pH5.5pH5.5醋酸鹽緩沖液醋酸鹽緩沖液50ml50ml，最后加入，最后加入0.03% H0.03% H2 2O,O,終產物為紅色可溶性。終產物為紅色