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文檔簡介

1、實驗六 紙層析鑒定轉(zhuǎn)氨基作用 n 層析是利用不同物質(zhì)，不同的理化性 質(zhì)如吸附力、分子形狀、大小、極性、分配系數(shù)的不同而建立起來的技術(shù)。所有層析系統(tǒng)都有兩相組成。既固定相和流動相。固定相既固體物質(zhì)或是固定于固體物質(zhì)上的成分。流動相既可以流動的物質(zhì) 如：水或溶液等。混合物要經(jīng)過此兩相與其作用，最后分離。 本實驗以丙氨酸和-酮戊二酸為底物，加肝勻漿保溫后，用紙層析法檢查谷氨酸的出現(xiàn)以證明轉(zhuǎn)氨基作用。 n 紙層析屬于分配層析。以濾紙為支持物，濾紙纖維與水親合力強，吸收2022 %的水。而且其中67 %的水是以氫鍵形式與纖維素的羥基結(jié)合，在一般情況下很難脫去，而濾紙纖維與有機溶劑的親和力甚弱。所以紙層析

2、是以濾紙纖維結(jié)合水作為固定相，以有機溶劑作為流動相。 n 在用紙層析法分離氨基酸時，由于各種氨基酸在此二相中的分配系數(shù)不同，各有一定的遷移率。丙氨酸屬于非極性中性氨基酸，易溶于有機溶劑，而谷氨酸屬于極性酸性氨基酸，易溶于水，因此在紙層析體系中谷氨酸和丙氨酸相比而言，丙氨酸更易溶于流動相，因此遷移距離遠。n 本實驗用圓盤濾紙進行水平型層析，層析結(jié)束后利用氨基酸與茚三酮共加熱，生成藍紫色化合物的茚三酮法顯色，觀察色斑，判定結(jié)果。【操作】【操作】 1、肝勻漿的制備：新鮮的動物肝臟1g，在研缽中用剪刀剪碎，加入9ml冰冷的0.01M pH7.4磷酸緩沖液迅速研成勻漿。 （已經(jīng)制備好，直接取用） 2、保

3、溫：取干燥小試管（或離心管）二支，分別標明測定管與對照管，按下表操作： 試 劑 測定管 對照管 肝勻漿 0.5ml 0.5ml （置37水浴保溫5min） （置沸水浴5min） 0.1M丙氨酸 0.5ml 0.5ml 0.1M -酮戊二酸 0.5ml 0.5ml 0.01M pH7.4磷酸緩沖液 1.5ml 1.5ml 充分混勻，置37水浴保溫45分鐘，保溫完畢，立即將測定管放入沸水浴中5min以終止反應(yīng)。 3、層析：取直徑10cm圓形濾紙一張，用圓規(guī)半徑1cm同心圓，通過圓心作相互垂直的線， 然后半徑每次增加0.5cm畫同心圓至濾紙邊緣。n在濾紙圓心處打一孔（如鉛筆芯大小）另取同類濾紙約1cm，下一半剪成須狀，卷成圓筒，如燈芯，插入小孔，（勿使突出濾紙面）。將層析液放入干燥表面皿中，并將表面皿置于直徑10cm培養(yǎng)皿正中，將濾紙平放在培養(yǎng)皿中，燈芯浸入溶劑中，將另一個培養(yǎng)皿反蓋上，可見溶劑沿芯上升到濾紙，再向四周擴展，約25分鐘后暈染的邊緣距濾紙邊緣約1cm時即可取出，用鉛筆標記層析液前沿，用吹風機吹干。 4、顯色：將上訴濾紙平放在培養(yǎng)皿中，用噴霧器噴上0.5%茚三酮溶液用熱風吹，此時可

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