1、. .雌激素誘導miRNA-29表達在CCl4誘導大鼠肝損害中的保護作用背景：雌激素estradiol，E2緩解CCl4誘導肝纖維化的潛在機制仍不清楚。結果：miRNA-29在CCl4處理的雌雄大鼠中的表達存在差異。E2和表達miRNA-29a/b的腺病毒可以增加肝內miRNA-29a/b水平且緩解CCl4誘導肝纖維化。結論：E2通過誘導miRNA-29a/b抑制CCl4誘導肝損害。意義：了解miRNA-29對肝纖維化的作用/調控并提供新的治療靶點。摘要：以前研究說明雌性動物比雄性動物更容易耐受CCl4誘導肝纖維化，E2可以抑制CCl4誘導的肝纖維化。然而，這種現象的潛在機制仍沒有完全說明。本

2、研究報道E2誘導miRNA-29表達對CCl4誘導肝損害的作用。在用CCl4處理的雌雄大鼠中，肝內miRNA-29表達存在差異。尤其在CCl4處理4周后的雄性而非雌性大鼠肝內miRNA-29a和miRNA-29b表達明顯下降。在雄性大鼠肝內miRNA-29a和miRNA-29b表達下調與肝纖維化進展早期相關，結果顯示相對于雌性大鼠，雄性大鼠的纖維化標志物表達增加。此外，在雌性大鼠E2比雄性大鼠一直保持更高水平。TGF-1在大鼠肝癌細胞IAR20和正常肝細胞中減少miRNA-29a/b表達。相反，E2通過抑制NF-B信號通路提高miRNA-29a/b表達，NF-B信號通路負性調控miRNA-29

3、表達。進一步研究發現E2和靜注表達miRNA-29的腺病毒可以顯著增加miRNA-29a/b水平和緩解CCl4誘導肝損害大鼠的肝臟纖維化標志物表達。總之，E2通過誘導肝內miRNA-29抑制CCl4誘導肝損害。纖維化以過量沉積細胞外基質ECM為特征，尤其是膠原。肝纖維化是慢性肝病的一種常見結局，最終可能進展為肝硬化和肝衰竭。CCl4誘導肝纖維化與不同病因引起的人肝纖維化有一些共同特征；相應地， CCl4誘導肝纖維化已作為纖維化模型1-3。本課題目的是研究雌雄大鼠對CCl4的不同纖維化反映及E2抑制肝纖維化的潛在機制。以前研究已在動物中觀察到對非酒精性纖維化誘導因素如CCl4表現出性別差異4，雌

4、性動物相對于雄性大鼠更耐受CCl4誘導肝纖維化。通過研究這些差異，數個研究已證實E2抑制CCl4誘導肝纖維化動物模型具有保護作用5-7。Yasuda等6報道E2降低I型和II型前膠原以及金屬蛋白酶抑制劑-1TIMP-1mRNA水平。也有研究發現在卵巢切除后的雌性大鼠，用E2替代治療抑制纖維化，而用E2特異性抗體或卵巢切除雌性大鼠中E2的保護作用消失，E2水平也明顯下降。Liu等5報道17-E2緩解肝纖維化、改善肝功能指標為ALT和AST。Shimizu等8在大鼠肝星狀細胞HSC中觀察到E2抑制肝纖維化的保護作用可能與抑制HSC激活有關。雖然E2作為強大的內源性抗氧化劑，通過抑制活性氧化劑或間接

5、調控細胞因子和其他生長因子的合成和釋放，到達抑制肝纖維化作用，但E2抑制肝纖維化的潛在機制仍沒有完全說明。微小RNAmiRNA是長約22nt的非編碼RNA，與細胞靶基因mRNA的3非編碼區序列不完全互補配對調控轉錄后基因表達9-11。以前研究已說明miRNA在細胞各個過程中起作用，包括細胞增殖、分化和凋亡。大量研究報道miRNA異常表達會導致多種疾病的發生開展。許多報道說明miRNA在HSC激活過程中起著重要的作用。對激活型大鼠HSC中miRNA表達分析證實了miRNA表達上調或下調12。也有研究證實過表達的miR-16和miR-15通過下調線粒體相關抗凋亡蛋白Bcl-2，導致caspases

6、3、8、9激活，從而抑制HSC增殖和誘導凋亡13。這些發現說明miRNA通過激活HSC在肝纖維化進展中起著重要的作用。miR-29家族包括關鍵膠原調節分子miR-29a和miR-29b也參與了組織纖維化14-16。在心肌梗死過程中，人和鼠的心臟邊界miR-29a和miR-29b表達下調17。此外，miR-29作為一個主要調節分子參與了肺纖維化15。最近，Roderburg等16在分析了CCl4誘導肝纖維化大鼠模型的miRNA調節基因芯片后，發現在CCl4誘導及膽管結扎后大鼠的肝臟中miR-29家族中所有成員均下調；此外，在細胞水平上，在大鼠HSC中過表達miR-29b引起膠原表達下調。在目前的

7、研究中，我們發現了在E2抑制CCl4誘導大鼠肝纖維化中的保護作用與雌雄大鼠肝臟中miR-29不同表達水平之間存在相關的特點，并發現在經4周CCl4處理的雄性而非雌性小鼠的肝臟中miR-29miR-29a和miR-29b水平顯著下降，在雄性大鼠肝臟中miR-29a和miR-29b下調與肝纖維化加速進展密切相關，相對于雌性大鼠，雄性大鼠的膠原、SMA和TGF-1表達增加明顯。我們的結果也說明E2提高了培養的大鼠肝癌細胞IAR20中miR-29a/b表達水平，同時在雌性大鼠中E2一直較雄性大鼠保持了更高水平。進一步研究發現用E2處理和轉染表達miR-29a/b重組腺病毒提高miR-29a和miR-2

8、9b水平(Ad-miR-29a/b)顯著降低了大鼠肝臟中I型膠原和SMA表達水平，支持E2誘導miR-29a/b對CCl4誘導大鼠肝纖維化的保護作用。1、實驗過程1.1 動物模型動物培養和實驗程序完全符合美國國家*協會關于實驗動物使用的指導方針并得到*大學醫學動物保護委員會批準。本研究實用8周齡雌雄性Balb/c小鼠購自中國*大學實驗動物中心。50只雄性小鼠分成5組，10只/組。CCl4組：用橄欖油配成的100 mL/L CCl4腹腔注射，50µl/次，2次/周1；E2組：腹腔注射，1 mg/kg，2次/周，同時使用CCl4處理，方法同上5, 18；Ad-對照組和Ad-miR-29a

9、/b組：3×108/U腺病毒，尾靜脈注射，2次/周，同時使用CCl4處理，方法同上19；對照組：腹腔注射橄欖油，2次/周。12只雌性小鼠分成對照組和CCl4組，6只/組，每組治療同配對雄性小鼠處理。用CCl4處理4周或8周后殺死小鼠。肝組織用4%甲醛收集固定用作組織學檢測或立即液氮冰凍和保持-80用作RNA別離。丙氨酸氨基轉移酶ALT和天冬氨酸氨基轉移酶AST用ALT、AST試劑盒檢測;E2水平用酶聯免疫吸附試驗ELISA試劑盒檢測。1.2細胞培養和激活人胚胎腎細胞293 (HEK293)和鼠肝癌細胞系IAR20購自*細胞室。細胞用含10%新生小牛血清、100U/mL青霉素和100U

10、/mL鏈霉素的DMEM培養液于37，5恒溫CO2培養箱中進展培養。用膠原酶灌注小鼠肝組織中別離肝細胞后培養在完全培養基中。IAR20細胞和別離小鼠肝細胞放在6孔板，當細胞長至約90%時，它們培養在無血清培養基中，參加10ng/mL重組人TGF-1或100nM E2培養48h20。1.3 重組腺病毒構建及細胞感染表達miR-29a/b重組腺病毒由PCR檢測如圖Fig 1。所有miRNA前體系列擴增引物如下：miR-29a正鏈,5GACGGTACCTGGTGGAGAACAACTTCG3;miR-29a負鏈, 5CAGAAGCTTCATCAAACCTTCAATCCC3;miR-29b正鏈,5ACCA

11、GATCTGCGTCACGGCTC AATGTC3; miR-29b 負鏈, 5AGGCTCGAGCAGGCTTGATGGAGTCTGCT3。片段克隆入載體AdTrack-巨細胞病毒(pAdTrack-CMV)21。表達miRNA的重組載體PCMV分為pCMV-miR-29a、pCMV-miR-29b、pCMV-control。插入序列均由核苷酸測序證實。過程22如下：重組載體與PmeI連接，經電穿孔共轉導結合到腺病毒質粒pAdEasy-1，最后導入大腸桿菌BJ5183。重組腺病毒質粒由同源性重組合成；選擇陽性株并擴增以制備DNA抽提，然后用PacI消化DNA；腺病毒質粒(pAd-miR-29

12、a, pAd-miR-29a,pAd-control)與PacI連接，用酒精沉淀凈化，然后轉導入HEK293裝入一25cm2培養瓶中。用20ul脂質體2000連接4µg質粒DNA并監測綠色熒光蛋白(GFP)表達23。在轉染12天后，收集細胞并離心10min，500g/min。然后3或4個循環在干冰中冰凍和37°C融化以從細胞中釋放出病毒，收集Ad-miR-29a、Ad-miR-29b、Ad-control ，然后擴增和用腺病毒-X病毒純化試劑盒純化，實時定量PCR檢測miR-29a/b水平22。用孔板形成實驗檢測HEK293細胞中腺病毒滴度。感染復數為總孔板形成單位與感染細

13、胞總數比率19。純化病毒滴度為3.0×108PFU/ml。正如附圖Fig 1描述，純化病毒成功感染細胞并表達miR-29a/b。所有病毒儲存在-80°C。1.4 組織病理檢查和免疫組化形態學研究方法：肝組織保存在4%甲醛中，嵌入石蠟并切成5um厚切片。一些切片按說明書用天狼星紅染色24, 25。肝纖維化組織學定量評估用NIH成像軟件測天狼星紅陽性面積26。其他組織切片用甲苯和酒精遞減沖洗。用免疫組化檢測SMA、I型膠原、TGF-1，簡單地說，就是在37°C用山羊血清阻斷后，然后在4°C用3種纖維化標志物蛋白抗體培育1夜，用PBS沖洗3次，然后在37

14、76;C用生物標記的抗兔二次抗體培育30min，再用3, 3'-二氨基苯胺-H2O2染色，在用蘇木精復燃，最后在光鏡下檢測。1.5 寡核苷酸和轉染表達小鼠NF-B基因轉錄激活的pBD-NF-B購自試劑盒。抗iB或NF-B p65的siRNA單核苷酸鏈購自基因制藥生物技術公司。轉染前24h IAR20細胞密度為1×106。按說明書用脂質體2000把iB siRNA、NF-B p65 siRNA、negative control (NC siRNA) 轉染如細胞。不管是否有E2，用24ug pBD-NF-bhuopCMV-control (control)/106細胞使NF-B過

15、表達。在轉染后48h收集總RNA和蛋白，以用于分析iB、NF-B p65 、miR-29a/b表達。1.6 定量實時PCR用Trizol試劑盒從肝組織抽提總RNA2ug，然后按照說明書用AMV逆轉錄試劑盒把RNA逆轉錄成20ul cDNA。在應用生物測序系統7300上用2ul cDNA樣本經實時PCR檢測。用于SMA、I型膠原、TGF-1 mRNA定量的正反引物序列如下：TGF-1正鏈, ATCCCGCCCACTTTCTAC;TGF-1負鏈,AGTTCAAT CCGCTGCTCG;-SMA 正鏈, TCGGATACTTCACGTCAGGA;-SMA負鏈,GTCCCAGACATCGGGAGTAA

16、;Col1a1正鏈,GCTCCTCTTAGGGGCCACT; Col1a1 負鏈, CCACGTCTCACCATTGGGG; -actin正鏈, GAGACCTTCAACACCCCAGC; -actin負鏈, ATGTCACGCACGATTTCCC。反響條件：95°C 5 min 95°C 15s, 58°C 30s, 72°C for 30s， 40 循環。熔點曲線分析是90°C (TGF-1), 85°C (-SMA and Col1a1) or 88°C (-actin)。在用-actin標準化后，每個樣本重復三次數據

17、的平均值作為計算基因表達變化27, 28。miRNAs 和U6 snRNA引物序列如下：mmu-miR-29a, UAGCA CCAUCUGAAAUCGGUUA; mmu-miR-29b,UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU; U6 snRNA, TGCTAATCTTCTCTGTATCGT。U6 snRNA定量作為內對照。1.7 蛋白免疫雜交印跡法Western用免疫印跡法檢測細胞核和細胞質抽提物29。簡單地說，細胞溶解物在冷放射免疫沉淀緩沖液10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1% sodium dodecyl sulfate, 1 mM DTT, 0.1 mM

18、PMSF, protease inhibitors, 1% Nonidet P-40, pH 8.0)擴增，然后在10000g /min離心5min。收集上清液用于細胞質抽提，細胞核漂浮于30ul高滲抽提緩沖液，16000g/min離心10min，上清液用于細胞核抽提。用微BCA蛋白測定試劑盒檢測細胞質和核溶解物中蛋白量。蛋白40ug在10%丙烯酰胺凝膠別離并電轉移至氟乙稀膜。然后在TBST (TBS plus 0.1% Tween-20)中用5%非脂干奶封閉1h。用原始抗iB、 NF-B p65、histone H1 或 GAPDH抗體檢測，然后用HRP共軛二次抗體檢測。1.8 統計學分析定

19、量RT-PCR重復三次，整個實驗重復數次。三個或以上實驗數據用means ±SEM表示。用T檢驗或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有統計學意義。2 結果2.1 CCl4誘導肝損傷雌雄大鼠情況和miRNA-29表達不同為了比較CCl4誘導雌雄小鼠肝纖維化情況，本實驗用50ulCCl4(100 ml/L 橄欖油)腹腔內注射到雌雄Balb/c小鼠，2次/w。如Figures 1A、1B所述，在CCl4處理4周后，大局部雄性小鼠均出現明顯肝纖維化損害，膠原纖維明顯上調(Fig. 1A, arrow)。相反，雌鼠未出現明顯損害。下一步我們檢測了CCl4處理組和

20、橄欖油對照組小鼠SMA(Fig. 1C)、I型膠原(Fig. 1D)、TGF-1(Fig. 1E)水平。與組織染色結果一致，結果說明肝纖維化只出現在雄性而非雌性小鼠，我們發現TGF-1在雌雄小鼠肝組織中均上調，SMA、I型膠原上調進出現在雄性而非雌雄小鼠。有趣的是，qRT-PCR檢測小鼠肝組織中miRNA表達水平，發現miRNA-29a和miRNA-29b,據報道14, 16其靶基因為I型膠原，在CCl4處理4周后的雄性而非雌性小鼠肝組織中明顯下調(Fig. 1, F and G)。以上結果說明CCl4誘導雌雄小鼠肝損傷后miRNA-29表達水平不同。Fig1.CCl4誘導肝損傷雌雄大鼠反響和

21、miRNA-29不同表達。A、 B：組織染色提示在CCl4處理的雄性而非雌性小鼠的早期階段呈現肝纖維化；C-E：CCl4處理組和橄欖油對照組小鼠SMA (C)、I型膠原(D)、TGF-1(E)mRNA水平；F-G：CCl4處理組和橄欖油對照組小鼠miRNA-29aF和miRNA-29b(G)表達改變情況。三個實驗數據用means ±SEM表示。用T檢驗或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有統計學意義。2.2 E2處理的鼠肝癌細胞中miRNA-29表達上調在CCl4處理4周后小鼠肝功能顯示雌雄性小鼠對CCl4處理反響不同。如表1所述，相對于單用橄欖油組，

22、CCl4處理雄性小鼠顯示血清ALT、AST水平明顯提高，分別為31.3 ± 6.90 IU/L、32.3 ± 2.07 IU/L, 208.76 ± 20.6 IU/L、207.9 ± 23.3 IU/L。相反，相對于單用橄欖油組，盡管CCl4處理雌性小鼠血清ALT、AST水平也增高，但明顯低于雄性大鼠水平。亦如所期望的，檢測E2水平顯示雌性小鼠E2水平顯著高于雄性，不計是否用CCl4或橄欖油處理(CCl4處理組小鼠雌性：雄性為149.5 ± 23.7 pg/ml：40.1 ± 3.40 pg/ml; 橄欖油組小鼠雌性：雄性為132.

23、2 ± 12.3 pg/ml：40.5 ± 7.65 pg/ml)。表1.在有否CCl4處理雌雄性小鼠早期階段4w肝損害不同情況實驗數據用means ±SEM表示。P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有統計學意義。尤其在CCl4處理階段雌性小鼠高水平E2與miRNA-29a/b相關性提示E2參與miRNA-29a/b表達。以前研究顯示一些miRNA如miR-181a、miR-26a與E2有關30。相應地，我們檢測了E2是否調控miRNA-29。本實驗，我們用E2或者TGF-1刺激鼠肝癌細胞IAR20。TGF-1作為陰性對照組，顯示可以減少miRN

24、A-29水平下降16。Fig.2A示相對于對照組，E2處理組提高增加miRNA-29a和miRNA-29b水平(倍數分別是20 和10, p < 0.01)。與之前研究相似，我們也觀察發現TGF-1明顯降低小鼠肝細胞的miR-29a 和miR-29b水平(Fig. 2B)。我們進一步研究E2和TGF-1調節原代培養正常鼠肝細胞miR-29作用(Fig. 2, C and D)。結果顯示在正常鼠肝細胞中E2明顯提高miR-29a 和miR-29b水平(Fig. 2C)，而TGF-1下調miR-29a 和miR-29b水平(Fig. 2D)。Fig2.小鼠肝癌細胞IAR20 (A 、B) 和

25、原代培養正常鼠肝細胞(C、D)受E2和TGF-1刺激后miR-29a 和miR-29b表達水平變化情況。A、C：E2刺激IAR20(A)和原代培養正常鼠肝細胞(C)后miR-29a 和miR-29b表達水平增高；B、D：TGF-1刺激IAR20(B)和原代培養正常鼠肝細胞(D)后miR-29a 和miR-29b表達水平下降。三個實驗數據用means ±SEM表示。用T檢驗或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有統計學意義。2.3 E2通過阻斷NF-B通路提高肝內miR-29a/b表達水平 E2在調控炎癥反響中起著廣泛的作用。與E2調控有關的轉錄因子如NF

26、-B、STAT-131, 32。有趣的是，之前研究也報道NF-B可以負性調控miR-29a 和miR-29b表達33。為了解是否NF-B參與E2上調miR-29a 和miR-29b表達，我們檢測了有無E2處理IAR20細胞核中NF-B p65水平。如Figure 3A所示E2明顯減少細胞核標志蛋白NF-B p65水平，而組蛋白H1未受影響。相反，TGF-1現在增加IAR20細胞核中NF-Bp65水平(Fig.3B)。Fig3. E2抑制和TGF-1誘導IAR20 細胞NF-B聚集。Western blot分析顯示100nM E2 (A) 或10ng/mL TGF-1 (B)作用48h后細胞核抽

27、提物檢測NF-B p65 和組蛋白H1水平。用波段掃描軟件分析Western blot圖。三個實驗數據用means ±SEM表示。用T檢驗或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有統計學意義。下一步我們準備驗證E2上調miR-29a/b中NF-B作用。如圖4所示，我們試圖了解提高或阻斷NF-B活性后IAR20細胞中miR-29a 和miR-29b表達情況。當細胞轉染iB一種在細胞漿使NF-B成無活性復合物的抑制蛋白特異性siRNA ，iB的mRNA (Fig. 4A)和蛋白(Fig. 4B) 均減少34, 35，而NF-B p65水平明顯增加(Fig.4C

28、)。NF-B活性增加明顯抑制miR-29a (Fig. 4D)和miR-29b (Fig. 4E)表達。相反，當通過在IAR20細胞中轉染NF-B p65特異性siRNA直接阻斷NF-B活性，發現細胞中總NF-B p65(Fig. 4F)和NF-B p65 (Fig. 4G)減少。然而，在NF-B p65siRNA轉染后降低了NF-B活性的細胞中miR-29a (Fig. 4H)和miR-29b (Fig. 4I)水平明顯減少。Fig4. NF-B負性調控miR-29a 和miR-29b表達。A：IAR20細胞轉染陰性對照(NC) siRNA或iB siRNA 單核苷酸，轉染48h后用qRT-

29、PCR檢測iB mRNA 水平；B：用免疫印跡法檢測iB水平，GAPDH作為對照；C：Western blot檢測核裂解液中NF-B p65 和組蛋白H1水平；D、E：用qRT-PCR檢測檢測miR-29a (D) and miR-29b (E) 水平；F、G：轉染NC siRNA或NF-B p65 siRNA到IAR20細胞48h后細胞漿提取物F和核提取物G中NF-B p65、GAPDH 、組蛋白H1水平；H、I：轉染NC siRNA或NF-B p65 siRNA到IAR20細胞中miR-29a (H)和miR-29b (I)水平。三個實驗數據用means ±SEM表示。用T檢驗或

30、方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有統計學意義。相反，E2處理的IAR20細胞中NF-B、NF-B p65水平一直保持高水平(Fig. 5, A 、B)，而miR-29a 和miR-29b水平沒有提高(Fig. 5, C、D)。以上結果說明E2通過阻斷NF-B活性提高miR-29a 和miR-29b水平。Fig5. NF-B過表達阻斷E2對IAR20細胞中miR-29表達。A：在有否E2作用下轉染pBD-NF-B到IAR20細胞48h， Western blot檢測核裂解物中NF-B p65和組蛋白H1；B：A板中NF-B p65水平量；C、D：A板中IAR20

31、細胞中 miR-29a (C)和miR-29b (D) 。三個實驗數據用means ±SEM表示。用T檢驗或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有統計學意義。2.4 通過靜注Ad-miR-29a/b提高miR-29水平緩解CCl4誘導雄性鼠肝纖維化 E2和TGF-1對miR-29表達的相反作用，分別表達促進和抑制功能，對于CCl4誘導鼠肝纖維化，提示miR-29在調節肝纖維化中起著關鍵作用。因此，我們下一步了解小鼠肝組織中miR-29能否阻止或緩解CCl4誘導鼠肝纖維化。本實驗我們用腺病毒構建了表達miR-29a和miR-29b的載體(Ad-miR-29

32、a/b) ，然后在CCl4處理2周后靜注Ad-miR-29a/b如雄性小鼠體內36。2次/w靜注Ad-miR-29a/b，連續注射6周19。如圖6A所示，用CCl4+Ad-miR-29a/b處理雄性小鼠肝組織中miR-29a和miR-29b水平明顯高于單用CCl4處理或CCl4+對照腺病毒載體組。組織化學檢測顯示相對于腺病毒載體對照組，Ad-miR-29a/b處理可以明顯緩解CCl4誘導肝損傷(Fig. 6, B、 C)。Fig6. 通過靜注Ad-miR-29a/b提高miR-29水平緩解CCl4誘導雄性鼠肝纖維化。A：在CCl4處理期在雄性小鼠靜注Ad-miR-29a/b提高miR-29a和

33、miR-29b水平；B、C：靜注Ad-miR-29a/b保護肝組織。三個實驗數據用means ±SEM表示。用T檢驗或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有統計學意義。Ad-miR-29a/b抑制CCl4誘導鼠肝纖維化的效果可以用纖維化標志物，如TGF-1、-SMA 和I型膠原。如Figure 7A所示Ad-miR-29a/b減少CCl4誘導的-SMA 和I型膠原mRNA，但在Ad-對照載體為變化；免疫組化結果證明(Fig. 7B) Ad-miR-29a/b減少CCl4誘導的-SMA 和I型膠原蛋白。Figure 7Ad-miR-29a/b減少CCl4誘

34、導鼠-SMA 和I型膠原水平。A：有否CCl4或Ad-miR-29 a/b處理的-SMA 和I型膠原、TGF-1 mRNA水平；B：免疫組化顯示有否CCl4或Ad-miR-29 a/b處理的-SMA 和I型膠原、TGF-1蛋白水平。三個實驗數據用means ±SEM表示。用T檢驗或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有統計學意義。2.5 E2通過提高miR-29表達水平保護CCl4誘導鼠肝損傷既然E2可以上調鼠肝細胞中miR-29表達，我們下一步了解E2保護CCl4誘導鼠肝纖維化是否通過上調miR-29。本實驗采用腹腔內注射E2 (1 mg/kg)，2次

35、/w5, 18。如圖8A所示與培養細胞所得結果相一致，E2可以抑制CCl4誘導miR-29。鼠肝組織免疫組化(Fig. 8, B and C) 顯示相對于對照組，E2可以緩解CCl4誘導肝纖維化組織。接下來我們我們檢測了在有無E2處理鼠肝組織中-SMA 和I型膠原、TGF-1表達和定位。如Figure 8D所示，E2處理雄性小鼠后減少了肝組織中-SMA 和I型膠原mRNA水平。免疫組化結果(Fig. 2)顯示E2可以明顯抑制CCl4誘導-SMA 和I型膠原蛋白水平。Figure 8.E2保護CCl4誘導鼠肝纖維化。A：E2上調肝組織中miR-29a和miR-29b水平；B、C：E2緩解CCl4

36、誘導鼠肝纖維化；D：在有無E2及CCl4處理鼠肝組織中-SMA 和I型膠原、TGF-1 mRNA水平。三個實驗數據用means ±SEM表示。用T檢驗或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有統計學意義。在CCl4處理8周后肝功能分析進一步顯示Ad-miR-29a/b和E2保護CCl4誘導鼠肝纖維化(Table 2)。本研究結果說明，在在CCl4處理8周后肝功能明顯受損，ALT、AST水平分別從31.74 ± 6.91 IU/L、32.08 ± 2.52 IU/L增高到408.76 ± 44.8 IU/L、407.9 

37、7; 53.7 IU/L。相反，用CCl4和Ad-miR-29a/b或E2處理(135.6 ± 26.9 IU/L、188.3 ±40.3 IU/L, Ad-miR-29a/b；186.7 ± 35.5 IU/L、200.95 ± 45.6 IU/L, for E2)小鼠ALT、AST明顯低于單用CCl4處理組。表2.每組雄性小鼠8周時CCl4誘導肝損傷情況實驗數據用means ±SEM表示。用T檢驗或方差分析得出P值<0.05 (*)和<0.01 (*)有統計學意義。3 討論肝纖維化是由一系列信號傳導調節并引起ECM沉積的復雜過程

38、37-39。資料說明一些慢性肝病進展在男女性別上存在差異40。慢性病毒性肝炎的主要并發癥肝纖維化或肝硬化男性發病率明顯多于女性37, 40。通常，男性進展為肝硬化比女性更普遍29, 41。相反，女性對酒精性肝損傷比男性更敏感42。雖然肝臟不是一個典型的性激素靶器官，卻含有雌激素受體并受E2作用27, 28, 43。因此，性激素在肝纖維化發病中起作用44, 45。以前研究說明E2治療可以抑制CCl4或二甲基亞硝胺誘導肝纖維化5, 6。但是調控非酒精性纖維化性別差異的具體機制仍沒有完全說明。本研究結果說明E2提高miR-29表達水平，并作為E2抑制肝纖維化的保護作用的潛在機制。首先，CCl4誘導雌

39、雄性小鼠肝纖維化存在差異。雖然CCl4長期誘導8-10w將導致雌雄性小鼠肝纖維化8-10，但相對于雄性小鼠，肝功能及免疫組化結果示CCl4誘導4w時雌性小鼠更容易耐受肝纖維化。第二，雌性小鼠的E2水平高于雄性小鼠，且用E2治療雄性小鼠可以明顯減少CCl4誘導肝纖維化。最后，E2刺激可以明顯減少IAR20細胞中miR-29a 和miR-29b 表達水平。有趣的是，E2誘導miR-29a 和miR-29b 表達情況與TGF-1結果相反，肝纖維化誘導因子TGF-1減少miR-29a 和miR-29b 表達。總之，本研究結果說明miR-29與E2抑制CCl4誘導鼠肝纖維化的保護作用之間相關。進一步研究

40、發現E2提高miR-29表達可能是通過抑制NF-B信號通路。相反，TGF-1可以提高IAR20細胞核中NF-B p65蛋白量，E2可以明顯減少細胞核中NF-B p65水平(Fig. 3)。NF-B與miR-29a/b之間的反比關系也證實之前報道的NF-B通路負性調控miR-29表達33。研究已發現在肝纖維化發病過程中，miR-29家族主要是miR-29a 和miR-29b的靶基因為ECM主要成分之一膠原14-16。許多細胞可以合成膠原蛋白，但主要是間質細胞如成纖維細胞。隨著組織損傷，持續激活成纖維細胞表型并抗凋亡，成纖維細胞分化成肌成纖維細胞，最終開展成纖維化39。在細胞水平上，miR-29過

41、表達可以減少HSC中膠原及阻斷纖維化開展過程。我們研究結果miR-29可以抗鼠肝纖維化。在CCl4誘導早期階段，雌性小鼠肝組織中miR-29a 和miR-29b水平高于雄性小鼠，這可能與雌性小鼠肝纖維化程度低于雄性小鼠有關。通過轉染Ad-miR-29a/b直接提高小鼠肝組織中miR-29水平，可以明顯緩解CCl4誘導肝纖維化。此外，本研究發現miR-29作為數個促纖維化或抗纖維化調節因子的一個常見下游靶標。亦如Fig2所示，E2可以明顯誘導小鼠肝細胞miR-29a 和miR-29b表達，而TGF-1降低miR-29a 和miR-29b水平。最近Roderburg等16說明在肝纖維化過程中，不同

42、上游信號因子TGF-1、LPS可以減少miR-29表達水平，提示參與肝纖維化的炎癥信號通路中調控網絡下游比TGF-1/ miR-29/膠原通路更復雜。結果說明miR-29參與抑制CCl4誘導鼠肝纖維化的保護作用，提示miR-29作為肝纖維化動態過程的一個根本調節劑。Maillot等30研究說明E2信號誘導miRNA表達廣泛改變，如miR-26a 、miR-181a，在E2相關功能上起著關鍵作用，也支持我們的發現miR-29對E2敏感。然而，目前關于E2調控miRNA包括miR-29潛在機制仍不清楚及尚需進一步研究。總之，應用CCl4誘導鼠肝纖維化模型，研究說明miR-29參與抑制CCl4誘導鼠

43、肝纖維化的保護作用。通過E2或直接轉染Ad-miR-29a/b提高鼠肝組織中miR-29表達可以顯著緩解肝纖維化，減少血清ALT、AST水平、I型膠原和-SMA陽性區域。在肝纖維化中，肝細胞中E2誘導miR-29表達可以作為一種新的抗纖維化調節機制。參考文獻1.Domenicali, M., et al., A novel model of CCl4-induced cirrhosis with ascites in the mouse. J Hepatol, 2021. 51(6): p. 991-9.2.Akiyoshi, H. and T. Terada, Mast cell, myof

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