1、病理學常用技術的原病理學常用技術的原理及應用理及應用第一節第一節 大體與組織病理學技術大體與組織病理學技術 大體觀察大體觀察主要運用肉眼或輔以放大鏡、主要運用肉眼或輔以放大鏡、量尺和磅秤等工具，對大體標本及其病變性量尺和磅秤等工具，對大體標本及其病變性狀進行細致的觀察和檢測。狀進行細致的觀察和檢測。 組織和細胞學觀察組織和細胞學觀察 將病變組織制成切片將病變組織制成切片染色，或脫落、穿刺細胞涂片染色，顯微鏡染色，或脫落、穿刺細胞涂片染色，顯微鏡觀察。觀察。第二節第二節 組織化學與免疫組織化學組織化學與免疫組織化學 （一）（一） 組織化學組織化學 一般稱特殊染色，通過應用某些組織化一般稱特殊染色

2、，通過應用某些組織化學成分特異性結合的顯色試劑，顯示病變組學成分特異性結合的顯色試劑，顯示病變組織細胞的化學成分織細胞的化學成分( (如蛋白質、酶類、核酸、如蛋白質、酶類、核酸、糖類、脂類等）糖類、脂類等），從而加深對形態結構和代從而加深對形態結構和代謝改變的認識，弄清形態改變與代謝改變的謝改變的認識，弄清形態改變與代謝改變的關系。如過碘酸關系。如過碘酸SchiffSchiff反應（反應（PASPAS）或區別骨或區別骨EwingEwing肉瘤和淋巴瘤，前者胞漿內含有糖原呈肉瘤和淋巴瘤，前者胞漿內含有糖原呈陽性，后者陰性，磷鎢酸蘇木精染色可顯示陽性，后者陰性，磷鎢酸蘇木精染色可顯示橫紋肌肉瘤中瘤

3、細胞胞漿中的橫紋。橫紋肌肉瘤中瘤細胞胞漿中的橫紋。（二）免疫組織化學（二）免疫組織化學 是利用抗原抗體的特異性結合反應來檢測和定位組織或細胞中的某種化學物質的一種技術，有較高的敏感性和特異性，能將形態學改變與功能、代謝變化結合起來，直接在組織切片、細胞涂片、培養細胞爬片上定位某些蛋白質或多肽類物質，結合計算機圖像分析技術或激光掃描共聚顯微術等，對被檢物質進行定量分析。1 1、免疫組織化學染色方法、免疫組織化學染色方法 按標記物性質分按標記物性質分：熒光法、酶法、：熒光法、酶法、免疫金、銀及鐵標記技術等。免疫金、銀及鐵標記技術等。 按染色步驟分按染色步驟分：直接法、間接法。：直接法、間接法。 按

4、結合方式分按結合方式分：抗原：抗原- -抗體結合法、抗體結合法、親和連接法、標記的鏈親和素親和連接法、標記的鏈親和素- -生物生物素法等。素法等。2 2、免疫組化染色的質量控制和結果、免疫組化染色的質量控制和結果 陽性表達方式：陽性表達方式：（1 1）胞漿陽性）胞漿陽性（2 2）核周胞漿陽性）核周胞漿陽性（3 3）胞漿局限性點狀陽性）胞漿局限性點狀陽性（4 4）細胞膜陽性）細胞膜陽性（5 5）細胞核陽性）細胞核陽性肌動肌動蛋蛋白白雄雄激素受體激素受體CD3-T細胞細胞雌雌激素受體（激素受體（ER）影響免疫組化染色質量的因素：影響免疫組化染色質量的因素： 取材及固定取材及固定 抗體質量抗體質量

5、抗原封閉和修復抗原封閉和修復 技術操作技術操作3 3、免疫組化的應用、免疫組化的應用 大量商品化的單克隆和多克隆抗體出現、配套試劑盒的使用及方法學的不斷完善，使免疫組織化學染色已經成為醫學基礎研究和病理外檢中應用最為廣泛的技術手段之一。 免疫組化技術可用于各種蛋白質或肽類物質表達水平的檢測、細胞屬性的判定、淋巴細胞的免疫表型分析、細胞增殖和凋亡的研究，激素受體和耐藥基因蛋白表達檢測，以及細胞周期和信號轉導的研究等。 免疫組織化學染色技術也是非放射性原位雜交、原位PCR和原位末端標記DNA片段等技術的基礎。第三節第三節 電子顯微鏡技術電子顯微鏡技術 透射電子顯微鏡是最早、最廣泛應用于醫學領域的一

6、種電鏡，以后又相繼誕生了掃描電鏡、超高壓電鏡等。電鏡的使用大大地開闊了我們的視野，看清了細胞膜和細胞漿內的各種細胞器和細胞核的細微結構及其病理變化，并由此產生了亞細胞結構病理學，又稱超微結構病理學。電鏡技術的應用 在生命科學領域可用于胚胎及組織發生學方面的研究和觀察；在臨床上可用于多種疾病亞細胞結構病變的觀察和診斷，特別是腎小球疾病及肌病的診斷，以及一些疑難腫瘤的組織來源和細胞屬性判定，如一些去分化、低分化或多向分化腫瘤的診斷和鑒別診斷；最早關于細胞凋亡的形態學描述也是源于電鏡的觀察。 隨著電鏡技術的不斷發展，以及與其他方法的綜合使用，還出現了免疫電鏡、電鏡細胞化學技術、電鏡圖像分析技術及全息

7、顯微術等。 電鏡技術也有其局限性，如電鏡設備昂貴、樣本制備較復雜、實驗費用較高；另外，由于樣本取材少，觀察范圍有限，有時還可能會遺漏信息；當用于輔助腫瘤外檢診斷時，只能判定組織或細胞的來源，不能確定腫瘤的良惡性。第四節原位多聚酶鏈式反應技術第四節原位多聚酶鏈式反應技術 原位多聚酶鏈式反應技術是多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術的一部分，是在體外經酶促反應將某一特定DNA序列進行高效、快速擴增，它可將單一拷貝或低拷貝的待測核酸以指數的形式擴增而達到常規方法可檢測的水平。原位PCR(in situ PCR)技術是將PCR的高效擴增與原位雜交的細胞及組織

8、學定位相結合，在冷凍或石蠟包埋組織切片、細胞涂片或培養細胞爬片上來檢測和定位核酸的技術。原位原位PCRPCR技術方法技術方法 原位PCR技術有直接法原位PCR、間接法原位PCR、原位反轉錄PCR和原位再生式序列復制反應等方法，其中應用相對較廣泛的是間接原位PCR方法。 主要程序有組織固定、預處理(如蛋白酶K和RNA酶消化)、原位擴增及擴增產物的原位雜交和檢測等。由于使用原位雜交技術對擴增產物作檢測，使該方法的特異性較直接法高。原位原位PCRPCR技術的應用及存在的問題技術的應用及存在的問題 應用：原位PCR技術能用于低拷貝的內源性基因的檢測和定位，可用于基因突變、基因重排和染色體易位等的研究和

9、觀察；還可用于外源性基因的檢測和定位，如對各種感染性疾病病原的基因檢測，如EB病毒、人乳頭狀瘤病毒、肝炎病毒、巨細胞病毒和人免疫缺陷病毒基因組及結核、麻風桿菌基因的檢測等；在臨床上還可用于對接受了基因治療患者體內導人基因的檢測等。存在的問題：存在的問題： 特異性不高，特別是假陽性的問題。產生的原因有引物與模板的錯配、在擴增中因細胞內受損傷DNA的修復而形成的非特異性序列和特異性擴增序列的彌散等。 技術操作復雜，影響因素太多。 需要特殊的設備，即原位PCR儀，價格昂貴。第五節核酸原位雜交第五節核酸原位雜交 原位雜交是核酸分子雜交的一部分，是原位雜交是核酸分子雜交的一部分，是將組織化學與分子生物學

10、技術相結合來檢測將組織化學與分子生物學技術相結合來檢測和定位核酸的技術。用標記了的已知序列的和定位核酸的技術。用標記了的已知序列的核苷酸片段作為探針核苷酸片段作為探針，通過雜交直接在組織通過雜交直接在組織切片、細胞涂片或培養細胞爬片上檢測和定切片、細胞涂片或培養細胞爬片上檢測和定位某一特定的靶位某一特定的靶DNADNA或或RNARNA的存在。其生物的存在。其生物化學基礎是化學基礎是DNADNA變性、復性和堿基互補配對變性、復性和堿基互補配對結合。根據所選用的探針和待檢靶序列的不結合。根據所選用的探針和待檢靶序列的不同，有同，有DNA-DNADNA-DNA雜交、雜交、DNA-RNADNA-RNA

11、雜交和雜交和RNA-RNARNA-RNA雜交。雜交。 探針的選擇和標記探針的選擇和標記 用于原位雜交的探針有雙鏈cDNA探針、單鏈cDNA探針、單鏈cRNA探針和合成的寡核苷酸探針等。 探針的長度以50-300個堿基為宜，用于染色體原位雜交的探針可為1.21.5kb。探針標記物有放射性同位素如3H、35S、32p等，這類探針的敏感性高；非放射性探針標記物有熒光素、地高辛和生物素等，其敏感性不如放射性標記探針，但有性能穩定、操作簡便、成本低和耗時短等優點。原位雜交的主要程序原位雜交的主要程序 實驗材料：常規石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、細胞涂片和培養細胞爬片等。 主要程序：包括雜交前準備、預處

12、理、雜交、雜交后處理-清洗和雜交體的檢測等。 應注意的問題：DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交，需滅活RNA酶處理；使用雙鏈cDNA探針和/或待測靶序列是DNA時，需進行變性處理使DNA解鏈；雜交溫度應低于雜交體的解鏈溫度(Tm)25度左右；對照實驗：有組織對照、探針對照、雜交反應體系對照和檢測系統的對照等，根據具體情況選用。 熒光原位雜交熒光原位雜交 可以用直接法或間接法進行，直接法以熒光素直接標記已知DNA探針，間接法以非熒光標記物標記已知DNA探針，再橋連一個熒光標記的抗體。 本法是一種DNA-DNA雜交，實驗材料可以是間期細胞、分裂中期的染色體，也可以是冰凍或石蠟切片等。探針有不同

13、的類型，如重復序列探針、位點特異性探針和全染色體探針等，目前已有大量商品化的熒光標記探針。 原位雜交技術的應用原位雜交技術的應用 原位雜交可應用于：原位雜交可應用于：細胞特異性mRNA轉錄的定位可用于基因圖譜、基因表達和基因組進化的研究；感染組織中病毒DNARNA的檢測和定位；癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉錄水平的表達及其變化的檢測；基因在染色體上的定位；檢測染色體的變化，如染色體數量異常和染色體易位等；分裂間期細胞遺傳學的研究，如遺傳病的產前診斷和某些遺傳病基因攜帶者的確定，某些腫瘤的診斷和生物學劑量測定等。第六節第六節 顯微切割術顯微切割術 顯微切割術是90年代初發展起來的一門新技術，

14、能夠從組織切片或細胞涂片上的任一區域內切割下幾百個、幾十個同類細胞，甚至單個細胞，再進行有關的分子生物學方面的研究，如PCR，PCR-SSCP及比較基因組雜交等。 材料：材料：冰凍或石蠟包埋組織切片或細胞涂片。切片的厚度為4-10um，冰凍切片需經甲醛或乙醇固定。用于顯微切割的組織切片必須染色，以便于進行目標細胞群或單一細胞的定位。操作方法：有手工操作法和激光顯微切割法。激光捕獲顯微切割技術的基本原理是：將組織切片放在倒置顯微鏡的載物臺上，激光束從切片的上方垂直照射下來，落在要切割的區域。該區的乙烯乙酸乙烯酯膜受激光照射后，瞬間溫度升高并與其下方的細胞相粘連；當將膜揭起來時，與之相連的細胞也隨

15、之被完好地從切片上切割下來；將帶有細胞的膜放入試管內經蛋白酶消化使細胞與膜分開，同時也將細胞裂解，獲得待提物質，如DNA、RNA或蛋白質等。 意義：意義：可從構成復雜的組織中獲得某一特定的同類細胞或單個細胞，適用于腫瘤的分子生物學研究，如腫瘤的克隆性分析、腫瘤發生和演進過程中各階段細胞基因改變的比較研究和腫瘤細胞內某些酶活性的定量檢測等。不足之處是技術難度大；需特殊的設備，激光器造價高。第七節 生物芯片技術 (一)基因芯片 基因芯片又稱DNA芯片(DNA chip)，是指固著在固相載體上的高密度的DNA微點陣。就是將大量靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度地排列在如硅片、玻璃片、聚丙烯或尼龍膜等

16、載體上，這就是基因芯片。一套完整的基因芯片分析系統包括芯片陣列儀、激光掃描儀、計算機及生物信息軟件處理系統等。基因芯片的分類和工作原理基因芯片的分類和工作原理 按基因芯片的功能分：表達譜基因芯片、診斷芯片和檢測芯片，前者主要用于基因功能的研究；后兩者可用于遺傳病、代謝病和某些腫瘤的診斷或病原微生物的檢測等。 表達譜基因芯片檢測的基本原理：用不同的熒光染料通過逆轉錄反應將不同組織的mRNA分別標記制成探針，將探針混合后與芯片上的DNA片段進行雜交、洗滌，用特有的熒光波長掃描芯片，得到這些基因在不同組織或細胞中的表達譜圖片，再通過計算機分析出這些基因在不同組織中表達差異的重要信息。基因芯片的應用：

17、基因芯片的應用： 基礎研究方面有基因表達譜分析、基因分型、基因突變的檢測、新基因的尋找、遺傳作圖和重測序等；臨床上可用于抗生素和抗腫瘤藥物的篩選和疾病的診斷等方面。 利用基因芯片可以大規模、高通量地對成千上萬個基因同時進行研究，從而解決了傳統的核酸印跡雜交技術操作復雜、自動化程度低、操作序列數量少和檢測效率低等問題。 實驗材料是從新鮮組織或培養細胞中提取的mRNA，對外周血或培養細胞樣本的研究相對容易，對實體瘤的研究受到限制。蛋白質芯片蛋白質芯片 蛋白質芯片是繼基因芯片之后發展起來的對基因功能產物表達水平檢測的技術。也是在一個載體上點布高密度不同種類的蛋白質，再用熒光標記的已知抗體或配體與待測樣本中的抗體或配體一起同芯片上蛋白質競爭結合，在掃描儀上讀出熒光強弱，再經計算機分析計算出待測樣本結果。 檢測容量已達一萬三千多個點，并實現了整個過程全自動化檢測，具有高效率、低成本的特點，尤其適合于蛋白表達的大規模、多種類篩查，并能用于受體配體、多種感染因素的篩查和腫瘤