1、細胞培養的基本技術 申艷娜：申艷娜：辦公室：醫學檢驗學院病原生物學教研室辦公室：醫學檢驗學院病原生物學教研室E-mail: 2主要內容n 基本操作技術和要求基本操作技術和要求n 原代培養原代培養n 傳代培養和細胞系的維持傳代培養和細胞系的維持n 培養細胞生長性狀的觀察培養細胞生長性狀的觀察n 細胞凍存與細胞復蘇細胞凍存與細胞復蘇n 微生物污染的檢測與排除微生物污染的檢測與排除3一、基本操作技術和要求一、基本操作技術和要求n 1.培養前準備培養前準備實驗前要制定好實驗計劃和操作程序；計算好有關數據；準備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養室、超凈臺)內，然后開始消毒。5無菌操作n

2、 2.培養室和超凈臺的消毒培養室和超凈臺的消毒無菌培養室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面次(拖布要專用)，紫外線照射消毒3050min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。6無菌操作n 培養室和超凈臺的消毒消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內同時紫外線消毒。7無菌操作n 3.3.洗手和著裝洗手和著裝進入無菌培養室原則上需徹底洗手并按外科手術要求著裝；無菌服、帽子和口罩每次實驗后，均需清洗、消毒；操作前要用75酒精或0.2新潔爾滅消毒手和前臂。8無菌操作n 4

3、.4.無菌培養操作無菌培養操作火焰消毒n 在無菌環境進行培養或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經過燒灼進行。9n 無菌培養操作操作時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。10無菌操作n無菌培養操作工作臺面上的用品要放置有序、布局合理，一般酒精燈位于中間，右手使用的在右側，左手使用的在左側。移液管、尖吸管不應交叉使用，防止交叉污染。培養細胞的取材n取材的基本要求：1.盡快培養2.嚴格無菌操作3.減少對細胞的機械損傷4.去除壞死組織，避免組織塊干燥

4、5.培養液營養豐富6.易培養的組織成功率高7.詳細記錄取材的基本器材和用品1.眼科組織彎剪、彎鑷、手術刀2.小瓶裝無血清培養基、Hanks液3.小燒杯4.培養皿各部位組織的取材n皮膚和黏膜n內臟和實體瘤n血細胞n骨髓、羊水、胸水、腹水內細胞n鼠胚組織n雞胚組織組織材料的分離n細胞懸液的分離方法：血液、羊水、胸水、腹水等細胞懸液離心分離，5001000r/min，510min組織材料的分離n組織塊的分離方法1.機械分散法2.剪切分離法3.消化分離法機械分散法n纖維成分很少的組織，如腦組織、部分胚胎組織以及一些腫瘤組織。方法： 1.剪刀剪切，吸管反復吹打分散組織細胞。 2.組織放在注射器內通過針頭

5、壓出。 3.注射器針芯擠壓通過不銹鋼篩網（50目、200目、400目）剪切分離法n組織塊移植培養時，將組織剪成或切成小塊（1cm3）用眼科剪反復剪切組織至糊狀，吸取培養液反復吹打，低速離心去上清，再分離培養。消化分離法胰蛋白酶消化法n用于消化細胞間質較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等，同時也用于培養的細胞。npH 、溫度、濃度、組織塊大小和硬度。n0.10.5%，常用0.25%npH= 8n5mm3胚胎類軟組織， 0.25%胰蛋白酶，37，20-30min即可。n鈣、鎂離子及血清對胰蛋白酶有抑制作用。n分次消化nEDTA較胰蛋白酶緩和，從組織環境中吸取鈣、鎂離子，破壞組織的完整性。n0.02

6、%，用不含鈣、鎂離子的BSS配置。n不能被血清中和，用洗滌、離心方法去除。n胰蛋白酶與EDTA聯合使用提高效果，1:1或1:2消化分離法膠原酶法n膠原酶（collagenase）是從溶組織梭狀細胞芽孢桿菌提取制備的。對細胞間質有消化作用而對上皮細胞影響不大。n分為、型及肝細胞專用膠原酶型。n膠原酶型肝、骨、甲狀腺、心臟、唾液腺n膠原酶型廣泛n不分型的復合膠原酶腫瘤細胞n常用量200U/mL（1mg/ml）或0.03%0.3%。n37震蕩，腫瘤組織或致密結締組織4-48h，易消化組織1545min。二、原代培養n也叫初代培養，是從供體取得細胞后在體外進行的首次培養。n生物學特性最接近和反映體內生

7、長特性，適合做藥物測試、細胞分化等試驗研究。n原代培養的組織由多種細胞成分組成，細胞間存在很大差異，生物學特征不穩定，需對細胞傳代后做對比性試驗研究。組織塊培養法n適用于組織量少的原代培養，如牙髓細胞培養。n取材修剪沖洗n剪切成1mm3小塊n移入培養瓶（可預先涂布薄層血清或鼠尾膠原）n分布組織小塊間距5mm （50ml培養瓶放2030塊組織塊）n翻轉培養瓶并加適量培養液，37靜止2-4hn翻正培養瓶進行培養（動作輕巧，液體緩慢覆蓋培養塊）n原代細胞生長（3-5天換液去除漂浮組織塊和血細胞）消化培養法 組織消化分散法器官培養26三、傳代培養和細胞系的維持n原代培養：也稱初代培養從供體取得組織細胞

8、后在體外進行的首次培養，是建立細胞系的第一步。n傳代培養細胞培養過程中，細胞增殖而數量增加，單層培養細胞相互匯合，覆蓋整個培養瓶，需進行分離培養。細胞由原培養瓶內分離稀釋后傳到新的培養瓶的過程稱傳代。進行一次分離再培養稱之為傳一代。27細胞傳代方法n 1.貼壁細胞的消化法傳代：采用酶消化法傳代。步驟：（1）吸除瓶內舊培養液（2）加入消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）（3）37或室溫以上消化2-5 min（顯微鏡下觀察胞質回縮、細胞間隙變大終止消化）（4）吸走消化液，加入含血清的培養液（5）用吸管反復吹打形成細胞懸液（6）計數，接種在新的培養瓶內。細胞傳代培養消化法n2.懸浮細胞的消化法傳代：

9、采用直接傳代或離心收集細胞后傳代。（1）直接傳代：使懸浮細胞沉淀在瓶底，將上清吸掉1/22/3，用吸管吹打形成細胞懸液在傳代。（2）離心傳代：收集到離心管中8001000r/min，5min，去上清，加新培養液吹打稱細胞懸液，傳代接種。n3.部分貼壁細胞：直接吹打或消化傳代n原代培養物經首次傳代成功后即為細胞系，由原先存在于原代培養物中的細胞世系組成。如果不能繼續傳代或傳代數有限，稱為有限細胞系（finite cell line）；如果具有無限生存能力，則稱為連續細胞系（continuous cell line）。細胞系31細胞系的維持：“換液、傳代、凍存”1.細胞系檔案要記錄好2.在維持傳代

10、時要注意保持規律性3.多種細胞系傳代避免交叉污染4.要有充足的凍存儲備培養細胞的純化n1.自然純化：利用某一種類細胞的增殖優勢，去除其他細胞，達到細胞純化的目的。n成纖維細胞具有增殖優勢。n惡性腫瘤可以通過此方法。2.人工純化：利用人為手段造成對某一細胞生長有利的環境條件，抑制其他細胞生長，從而達到純化細胞的目的。n酶消化法：成纖維細胞易消化n機械刮除法：分區或分片生長n反復貼壁法：貼壁速度不同，成纖維細胞先貼壁n克隆法：單個細胞分別克隆生長n培養基限定法：條件培養基或限定性培養基篩選n流式細胞儀分離法n免疫磁珠分離法培養細胞生長性狀的觀察培養細胞生長性狀的觀察n1.1.常規觀察常規觀察n2.

11、2.活細胞的觀察活細胞的觀察n3.3.細胞生長狀況的觀察細胞生長狀況的觀察35常規觀察常規觀察n 細胞經原代培養后及傳代或換液后均需細胞經原代培養后及傳代或換液后均需進行連續的、動態性觀察。進行連續的、動態性觀察。n 每日或隔日觀察一次，并做好相關記錄。每日或隔日觀察一次，并做好相關記錄。活細胞形態活細胞形態數量數量移動情況移動情況36常規觀察常規觀察1.1.培養液培養液2.2.細胞生長概況細胞生長概況3.3.細胞形態變化細胞形態變化4.4.微生物污染微生物污染37常規觀察常規觀察培養液培養液n 顏色顏色和和透明度透明度的變化的變化n 正常培養液的顏色正常培養液的顏色新鮮培養基，桃紅色，新鮮培

12、養基，桃紅色，pHpH為為7.2-7.47.2-7.4產生代謝產物，淺黃色，偏酸產生代謝產物，淺黃色，偏酸n 培養液很快變黃原因培養液很快變黃原因 細菌污染細菌污染 培養瓶洗刷不徹底培養瓶洗刷不徹底 接種細胞密度過大接種細胞密度過大38常規觀察常規觀察細胞生長增殖細胞生長增殖n潛伏期或適應期：細胞系潛伏期或適應期：細胞系24h24h以內；原以內；原代培養幾天代培養幾天- -幾周。幾周。n對數生長期：長滿對數生長期：長滿80%80%及時傳代；培養及時傳代；培養液變黃。液變黃。n平臺期平臺期: :細胞粗糙，細胞內顆粒狀堆積細胞粗糙，細胞內顆粒狀堆積物，細胞脫落。物，細胞脫落。39常規觀察常規觀察細

13、胞形態變化細胞形態變化生長狀態良好的細胞生長狀態良好的細胞透明度大透明度大折光性強折光性強輪廓不清輪廓不清有時可見到細胞分裂相有時可見到細胞分裂相40成纖維型細胞形態成纖維型細胞形態41上皮型細胞形態42常規觀察常規觀察微生物污染微生物污染n微生物污染一般發生在傳代、微生物污染一般發生在傳代、換液和加藥后。在進行上述換液和加藥后。在進行上述操作后操作后24244848小時要密切注小時要密切注意是否有污染發生。意是否有污染發生。43常規觀察常規觀察微生物污染微生物污染細菌污染：培養液渾濁、可見細菌；細菌污染：培養液渾濁、可見細菌；霉菌、真菌污染：培養液渾濁、可見菌絲；霉菌、真菌污染：培養液渾濁、

14、可見菌絲；支原體污染：培養液不渾濁，細胞生長變支原體污染：培養液不渾濁，細胞生長變緩慢、胞質內顆粒增多，有中毒表現。緩慢、胞質內顆粒增多，有中毒表現。44主要內容主要內容n 培養細胞的常規觀察培養細胞的常規觀察n 活細胞的觀察活細胞的觀察n 細胞生長狀況的觀察細胞生長狀況的觀察45活細胞的觀察活細胞的觀察n 相差顯微鏡觀察相差顯微鏡觀察46主要內容n 培養細胞的常規觀察培養細胞的常規觀察n 活細胞的觀察活細胞的觀察n 細胞生長狀況的觀察細胞生長狀況的觀察細胞計數n培養的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數。計數結果以每毫升細胞數表示。細胞計數的原理和方法與血細胞計數

15、相同。n 血細胞計數板：手工計數細胞n 電子細胞計數儀：自動計數細胞計數：n1、準備計數板：用無水乙醇或95%乙醇清潔計數板及蓋片，擦拭干凈，將蓋玻片蓋在計數板上。 n2、制備單細胞懸液：保證細胞密度大于104個/ml。n3、加樣：將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間。不要溢出蓋玻片也不能溢入兩側的玻璃槽內，不要有氣泡。 n4、計數：在顯微鏡下，用10物鏡觀察計數板四角大方格中的細胞數，壓線細胞只計左側和上方的。n5、計算： 公式：細胞數/ml(4大格細胞總數/ 4)104 n注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計 算，若細胞團占10%以上，說明分散

16、不好，需重新制備細胞懸液。50細胞生長狀況的觀察細胞生長狀況的觀察n 細胞生長曲線細胞生長曲線n細胞生長曲線：以培養時間為橫坐標，細胞數為縱坐標，連接成的曲線。標準的細胞生長曲線近似”S”形：滯留期、對數生長期、平臺期（生長抑制）。n細胞對數生長期：在生長曲線上細胞數量增加1倍時間為細胞倍增時間，此區間即細胞對數生長期，細胞傳代、試驗等多應在此期間進行。52細胞生長狀況的觀察細胞生長狀況的觀察細胞分裂指數：是計算分裂細胞占全部細胞中細胞分裂指數：是計算分裂細胞占全部細胞中比列的方法，用以表示比列的方法，用以表示細胞增殖的旺盛程度。細胞增殖的旺盛程度。細胞貼壁率：適用于觀察貼壁細胞，主要反映細胞

17、貼壁率：適用于觀察貼壁細胞，主要反映細胞的細胞的生存能力生存能力和部分底物材料的生物相容性。和部分底物材料的生物相容性。細胞生長狀況的觀察細胞周期0Count 200 400 600 8001000DNA contentn研究細胞動力學、細胞的研究細胞動力學、細胞的DAN合成代謝和合成代謝和有絲分裂。每一個增值過程都要經過一個有絲分裂。每一個增值過程都要經過一個周期來進行，包括：周期來進行，包括：n有絲分裂期（有絲分裂期（M期）期）n分裂間期（生長期）：生長前期（分裂間期（生長期）：生長前期（G1)、DNA合成期（合成期（S）、生長后期（）、生長后期（G2）54細胞生長狀況的觀察細胞生長狀況的

18、觀察n 細胞周期細胞周期細胞周期和細胞群體倍增時間不同細胞周期和細胞群體倍增時間不同n倍增時間倍增時間是指在對數生長期細胞數量增加一倍所是指在對數生長期細胞數量增加一倍所需的時間。需的時間。n細胞周期細胞周期是指一個細胞的分裂生長周期時間，一是指一個細胞的分裂生長周期時間，一般情況下短于細胞倍增時間。般情況下短于細胞倍增時間。55細胞生長狀況的觀察細胞生長狀況的觀察n 細胞周期細胞周期流式細胞儀測定法流式細胞儀測定法56主要內容n 無菌操作無菌操作n 傳代培養和細胞系的維持傳代培養和細胞系的維持n 培養細胞生長性狀的觀察培養細胞生長性狀的觀察n 細胞凍存與細胞復蘇細胞凍存與細胞復蘇n 微生物污

19、染的檢測與排除微生物污染的檢測與排除57細胞凍存與細胞復蘇n 概述概述細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規工作。細胞細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少人力、經費，凍存與細胞傳代保存相比可以減少人力、經費，減少污染，減少細胞生物學特性變化，最大限度減少污染，減少細胞生物學特性變化，最大限度的保存細胞活力。的保存細胞活力。58細胞凍存與復蘇原則：慢凍快融細胞凍存與復蘇原則：慢凍快融 當細胞直接降到零度以下，可引起：細胞當細胞直接降到零度以下，可引起：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶，會造成細胞膜、細胞器的

20、損傷胞內形成冰晶，會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。和破裂。n凍存細胞時要緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不凍存細胞時要緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶。致產生大的冰晶。n復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。晶的重結晶。59低溫保護劑的應用低溫保護劑的應用采用甘油或二甲基亞砜（采用甘油或二甲基亞砜（DMSODMSO）做保護劑。）做保護劑。常用常用DMSODMSO，一種滲透性保護劑，易穿透細胞，提高，一種滲透性保護劑，易穿透細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點。延緩凍結過程，胞膜對水的通透性，降低冰點。延

21、緩凍結過程，能使細胞內水分滲出細胞外，在胞外形成冰晶，能使細胞內水分滲出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。60細胞凍存方法細胞凍存方法1.1.預先配制凍存液：含預先配制凍存液：含20%20%血清培養基，血清培養基，10%DMSO10%DMSO，DMSODMSO液用培養液配好，避免因臨時配制產熱而傷害細胞。液用培養液配好，避免因臨時配制產熱而傷害細胞。2.2.取對數生長期細胞（凍存前一天換液），經胰酶消化取對數生長期細胞（凍存前一天換液），經胰酶消化后，加入適量凍存液，用吸管吹打制成細胞懸液（后，加入適量凍存液，用吸管吹打制成

22、細胞懸液（5-105-10）10106 6 個個/ml)/ml)。3.3.加入加入1-1.5ml1-1.5ml凍存細胞液于凍存管中，密封后標記冷凍凍存細胞液于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。細胞名稱和冷凍日期。程序降溫儀程序降溫儀標準程序為：降溫速率標準程序為：降溫速率-1-2/min；當溫度達；當溫度達-25以下以下時，可增至時，可增至-5-10/min；到；到-100時，則可迅速浸入液氮中。時，則可迅速浸入液氮中。細胞凍存盒：內部充滿細胞凍存盒：內部充滿異丙醇，放入異丙醇，放入-70冰冰箱中，箱中，-1/min的降的降溫速率凍存細胞。溫速率凍存細胞。62細胞凍存一般程序細胞凍存

23、一般程序1.1.先將凍存管放入先將凍存管放入44冰箱，約冰箱，約10min10min。2.2.接著置于接著置于-20-20冰箱，約冰箱，約303060min60min。3.3.置于置于-80-80超低溫冰箱中放置超低溫冰箱中放置1216h1216h。4.4.置于液氮罐中長期保存。置于液氮罐中長期保存。63細胞凍存簡易程序 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降降1 122的速度，在的速度，在30-40min30-40min內降至液內

24、降至液氮表面，停氮表面，停30min30min后，直接投入液氮中。后，直接投入液氮中。液氮罐65 1. 1.取生長狀態好的細胞消化制成細胞懸液取生長狀態好的細胞消化制成細胞懸液2.2.離心洗滌離心洗滌3.3.加含加含10%DMSO10%DMSO的凍存液的凍存液4.4.加入凍存管加入凍存管5.5.程序降溫程序降溫6.-706.-70放置放置2-3h2-3h7.7.移入液氮中移入液氮中8.8.記錄記錄細胞凍存步驟：細胞凍存步驟：細胞復蘇步驟：細胞復蘇步驟：1.1.從液氮中取出冷凍管，立即放入從液氮中取出冷凍管，立即放入3737水浴水浴中，使其融化（中，使其融化（1 1分鐘左右）分鐘左右）2.2.消

25、毒凍存管開封后將細胞移入離心管加消毒凍存管開封后將細胞移入離心管加1010倍培養液離心洗滌倍培養液離心洗滌3.3.計數，接種培養瓶培養，次日換液計數，接種培養瓶培養，次日換液68培養細胞的運輸培養細胞的運輸n冷凍儲存運輸：干冰冷凍儲存運輸：干冰/ /液氮液氮n充液法充液法 選擇生長良好的細胞，棄去舊培養基，補充新培養選擇生長良好的細胞，棄去舊培養基，補充新培養液至培養瓶頸部，保留微量空氣，瓶口用封口膜封口，液至培養瓶頸部，保留微量空氣，瓶口用封口膜封口，運輸。運輸。 若運輸時間較短（數小時），可將細胞附著面朝上，若運輸時間較短（數小時），可將細胞附著面朝上，或將培養液倒盡，貼身運輸。或將培養液

26、倒盡，貼身運輸。69主要內容主要內容n 無菌操作無菌操作n 傳代培養和細胞系的維持傳代培養和細胞系的維持n 培養細胞生長性狀的觀察培養細胞生長性狀的觀察n 細胞凍存與細胞復蘇細胞凍存與細胞復蘇n 微生物污染的檢測與排除微生物污染的檢測與排除培養細胞的污染n不僅指微生物，而且包括所有混入培養環境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物。n 包括微生物、細胞和化學物質。71微生物污染的檢測微生物污染的檢測n微生物污染的種類可分成細菌、真菌、病毒和支原體。微生物污染的種類可分成細菌、真菌、病毒和支原體。n無菌操作技術不當、無菌操作技術不當、 操作室環境不佳操作室環境不佳 、 污染之血清污染之血清和

27、污染之細胞等是主要的污染源和污染之細胞等是主要的污染源 。n嚴格之無菌操作技術嚴格之無菌操作技術 、清潔的環境、清潔的環境 、與品質良好之、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。 72細菌和真菌的污染和檢測細菌和真菌的污染和檢測肉眼直接觀察法肉眼直接觀察法培養檢查法培養檢查法顯微鏡觀察法顯微鏡觀察法真菌污染真菌污染培養液中形成白色或淺黃色漂浮物培養液中形成白色或淺黃色漂浮物肉眼可見，短期內培養液不混濁肉眼可見，短期內培養液不混濁鏡下可見在細胞之間有綜合交錯穿行的絲狀、管狀及鏡下可見在細胞之間有綜合交錯穿行的絲狀、管狀及樹枝狀菌絲，并懸浮

28、漂蕩在培養液中，也可通過染色樹枝狀菌絲，并懸浮漂蕩在培養液中，也可通過染色加以判斷加以判斷。73細胞被霉菌污染的鏡檢圖細胞被白色念球菌污染的鏡檢圖細胞被真菌污染的鏡檢圖細胞污染的電鏡照片細菌污染細菌污染多為大腸桿菌、白色葡萄球菌、假單胞菌等污染多為大腸桿菌、白色葡萄球菌、假單胞菌等污染污染后，培養基顏色短期變黃，出現渾濁污染后，培養基顏色短期變黃，出現渾濁鏡下可見大量圓球狀顆粒漂浮物，細胞生長停止并有中鏡下可見大量圓球狀顆粒漂浮物，細胞生長停止并有中毒表現毒表現可通過革蘭染色和肉湯接種加以鑒定可通過革蘭染色和肉湯接種加以鑒定多發生在接種的多發生在接種的48h48h以內以內7677支原體的污染和

29、檢測支原體的污染和檢測支原體高污染率的原因：支原體高污染率的原因：n支原體最小直徑支原體最小直徑0.20.2 m m，無細胞壁，約有，無細胞壁，約有1%1%可透可透過濾菌器過濾菌器(0.22-0.45 (0.22-0.45 m) m)；n 支原體污染時，沒有明顯的肉眼或一般光學顯支原體污染時，沒有明顯的肉眼或一般光學顯微鏡可觀察到的特征變化微鏡可觀察到的特征變化 ；n過去缺乏簡單、快速且可靠的檢測方式，研究人過去缺乏簡單、快速且可靠的檢測方式，研究人員忽略污染問題。員忽略污染問題。7878 支原體的污染和檢測支原體的污染和檢測支原體的檢測支原體的檢測n相差顯微鏡觀察法相差顯微鏡觀察法n熒光染色

30、法熒光染色法n電鏡檢查電鏡檢查nDNADNA分子雜交檢查或支原體培養分子雜交檢查或支原體培養79病毒的污染和檢測病毒的污染和檢測細胞的直接觀察細胞的直接觀察動物接種檢查動物接種檢查電子顯微鏡觀察電子顯微鏡觀察免疫學檢查免疫學檢查PCRPCR技術技術8282微生物污染的防治微生物污染的防治抗生素抗生素加溫處理加溫處理動物體內接種動物體內接種巨噬細胞吞噬法巨噬細胞吞噬法n1. 什么是原代培養？簡述原代培養方法的分類及主要操什么是原代培養？簡述原代培養方法的分類及主要操作步驟。作步驟。 n2. 何謂傳代培養？簡述貼壁細胞的傳代操作步驟。何謂傳代培養？簡述貼壁細胞的傳代操作步驟。n4. 什么是冷凍保存

31、？影響細胞冷凍保存效果的因素有哪什么是冷凍保存？影響細胞冷凍保存效果的因素有哪些？些？n5. 凍存的細胞一般如何復蘇？凍存的細胞一般如何復蘇？n6. DMSO使用時應注意哪些事項？使用時應注意哪些事項？ n7.運送細胞的比較簡便的方法是哪一種，簡述其過程。運送細胞的比較簡便的方法是哪一種，簡述其過程。 n8. 簡述細胞污染的概念及種類簡述細胞污染的概念及種類.n9. 細胞培養中常見有哪些微生物污染，有何主要特征？細胞培養中常見有哪些微生物污染，有何主要特征？ n10. 細胞計數的操作要領及計算公式是什么？細胞計數的操作要領及計算公式是什么？正常組織細胞的培正常組織細胞的培養養 正常組織細胞的培

32、養正常組織細胞的培養 n表皮細胞表皮細胞在人和動物體內，表皮細胞生長在膠原基質膜在人和動物體內，表皮細胞生長在膠原基質膜上，并從基質膜獲取生長分化所需要的物質，上，并從基質膜獲取生長分化所需要的物質，因此體外培養培養需要使用某些基質、培養液因此體外培養培養需要使用某些基質、培養液及包括滋養層在內的一些添加物。及包括滋養層在內的一些添加物。幾種細胞培養方法舉例幾種細胞培養方法舉例無菌切取皮膚標本，用無菌切取皮膚標本，用DBSSDBSS沖洗沖洗3 35 5遍。遍。將標本的上皮層面朝下放入干燥的培養皿中，加將標本的上皮層面朝下放入干燥的培養皿中，加數滴數滴PBSPBS使之濕潤，用彎剪盡可能除凈皮下脂

33、肪使之濕潤，用彎剪盡可能除凈皮下脂肪和結締組織，將標本切成大約和結締組織，將標本切成大約1cmX2cm1cmX2cm的小塊。的小塊。用無用無Ca2+Ca2+、Mg2Mg2+ +的的PBS PBS 沖洗標本至少沖洗標本至少3 3次，將標次，將標本放入胰蛋白酶溶液中或中性分散酶本放入胰蛋白酶溶液中或中性分散酶IIII中，中，44放置放置15-48h15-48h，或，或37 1-3h37 1-3h。幾種細胞培養方法舉例幾種細胞培養方法舉例幾種細胞培養方法舉例幾種細胞培養方法舉例表皮層和真皮層分離時表皮層和真皮層分離時,表皮層為棕色，真皮層表皮層為棕色，真皮層為白色，觀察到表皮與真皮分離時將其移入到為

34、白色，觀察到表皮與真皮分離時將其移入到另一另一10cm塑料平皿，真皮向下，用塑料平皿，真皮向下，用5ml血清完血清完全培養液沖洗，用彎鑷輕輕將表皮剝脫，放入全培養液沖洗，用彎鑷輕輕將表皮剝脫，放入含含20ml培養液的培養液的50ml離心管中，反復吹打，離心管中，反復吹打，過過100目尼龍篩，使角化上皮細胞分離。目尼龍篩，使角化上皮細胞分離。n滋養層細胞制備滋養層細胞制備在已形成單層的在已形成單層的3T33T3細胞培養瓶中加入絲裂霉細胞培養瓶中加入絲裂霉素，使素，使3T33T3細胞不在分裂增殖，即可作為表皮細胞不在分裂增殖，即可作為表皮細胞的黏附滋養細胞。細胞的黏附滋養細胞。n黏壁劑包被黏壁劑包

35、被用用0.01%0.01%的膠原蛋白鋪于培養瓶的底部，過夜，的膠原蛋白鋪于培養瓶的底部，過夜，棄上清，棄上清，4040烘干，制成膠原蛋白黏附膜，紫烘干，制成膠原蛋白黏附膜，紫外線照射外線照射2h2h消毒備用。消毒備用。幾種細胞培養方法舉例幾種細胞培養方法舉例90幾種細胞培養方法舉例幾種細胞培養方法舉例n 臍靜脈血管內皮細胞臍靜脈血管內皮細胞取健康產婦分娩正常新生兒后取健康產婦分娩正常新生兒后6 6小時以內的臍小時以內的臍帶，立即浸泡在含青霉素、鏈霉素的帶，立即浸泡在含青霉素、鏈霉素的D-HanksD-Hanks液中，洗去外部血污。在超靜工作臺上剪去液中，洗去外部血污。在超靜工作臺上剪去有鉗子夾

36、痕、扭曲、凝血塊、穿孔段后分離有鉗子夾痕、扭曲、凝血塊、穿孔段后分離出出10-1510-15厘米一段。厘米一段。91幾種細胞培養方法舉例幾種細胞培養方法舉例n 臍靜脈血管內皮細胞臍靜脈血管內皮細胞用注射器吸取用注射器吸取 HanksHanks液，充分清洗臍靜脈，液，充分清洗臍靜脈，用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈管腔內緩慢注入管腔內緩慢注入0.10.1I I型膠原酶型膠原酶8-10ml8-10ml，靜，靜脈充盈后，用另一只血管鉗夾住防膠原酶返脈充盈后，用另一只血管鉗夾住防膠原酶返流。置入流。置入3737培養箱內消化培養箱內消化1010分鐘。分鐘。n以

37、以1 15X105X105 5個細胞的密度接種在適量個細胞的密度接種在適量DMEMDMEM或或FADFAD培培養液中，養液中，3737培養培養1-31-3天，細胞貼壁后，沖洗未貼天，細胞貼壁后，沖洗未貼壁細胞。壁細胞。n傳代培養：傳代培養：0.05%-0.1%0.05%-0.1%的的EDTAEDTA孵育孵育10-30min10-30min，細，細胞變圓后，在用胞變圓后，在用0.1%0.1%的胰蛋白酶和的胰蛋白酶和0.05%EDTA0.05%EDTA消化，消化，吸管吹打是細胞完全脫壁。吸管吹打是細胞完全脫壁。幾種細胞培養方法舉例幾種細胞培養方法舉例93幾種細胞培養方法舉例幾種細胞培養方法舉例n

38、臍靜脈血管內皮細胞臍靜脈血管內皮細胞松開一端血管鉗，將含有內皮細胞的消化液松開一端血管鉗，將含有內皮細胞的消化液收集到離心管中，然后注入含收集到離心管中，然后注入含1010胎牛血清胎牛血清的的RPMI1640RPMI1640培基終止消化并沖洗血管，以便培基終止消化并沖洗血管，以便獲取更多的內皮細胞。獲取更多的內皮細胞。94幾種細胞培養方法舉例幾種細胞培養方法舉例n 臍靜脈血管內皮細胞臍靜脈血管內皮細胞將沖洗液一并注入離心管，以將沖洗液一并注入離心管，以1000 rpm1000 rpm離心離心 l0l0分鐘，棄上清液，加分鐘，棄上清液，加RPMI 1640RPMI 1640培養液，接培養液，接種

39、于種于50ml50ml一次性塑料培養瓶中，置一次性塑料培養瓶中，置3737培養箱培養箱內，在內，在5 5C0C02 2 24 24小時后換液一次，除去紅細小時后換液一次，除去紅細胞和未貼壁的細胞繼續培養，隔兩天換液一次。胞和未貼壁的細胞繼續培養，隔兩天換液一次。95幾種細胞培養方法舉例幾種細胞培養方法舉例n 臍靜脈血管內皮細胞臍靜脈血管內皮細胞96幾種細胞培養方法舉例幾種細胞培養方法舉例n 臍靜脈血管內皮細胞臍靜脈血管內皮細胞97幾種細胞培養方法舉例幾種細胞培養方法舉例n 人滑膜細胞人滑膜細胞將手術取下的新鮮的滑膜組織置于無菌的平將手術取下的新鮮的滑膜組織置于無菌的平皿中，剔除脂肪組織，用含青

40、、鏈霉素的皿中，剔除脂肪組織，用含青、鏈霉素的D-D-HanksHanks洗滌兩次，用眼科剪將滑膜組織充分剪洗滌兩次，用眼科剪將滑膜組織充分剪碎，吸入螺口管中，碎，吸入螺口管中，1200rpm/min1200rpm/min，離心，離心1010分分鐘。鐘。98幾種細胞培養方法舉例幾種細胞培養方法舉例n 人滑膜細胞人滑膜細胞 離心后，棄上清，加入一倍體積的離心后，棄上清，加入一倍體積的0.40.4IIII型膠原酶，置于型膠原酶，置于37 537 5CO2CO2培養箱中消化培養箱中消化6060分鐘（每分鐘（每1515分鐘吹打一次）。初次消化后，分鐘吹打一次）。初次消化后，離心棄上清，再加入一倍體積的離心棄上清，再加入一倍體積的0.250.25胰蛋胰蛋白酶繼續消化白酶繼續消化3030分鐘。最后加入含分鐘。最后加入含1515血清血清的的RPMI1640RP