1、手性胺酰胺型液相色譜手性固定相的制備及幾種氨基酸衍生物的拆分第35卷2007年6月分析化學(FENXIHUAXUE)研究報告ChineseJournalofAnalyticalChemistry第6期845849手性胺酰胺型液相色譜手性固定相的制備及幾種氨基酸衍生物的拆分譚徐林侯士聰王敏(中國農業大學理學院應化系,北京100094)摘要用(月)一l一苯基2一對甲基苯基乙基胺(PrE)與一異亮氨酸制得含兩個手性中心的手性選擇劑,以琥珀酸酐作為連接臂,將手性選擇劑鍵合到氨基丙基硅膠上制得手性固定相.以正己烷一異丙醇為流動相,利用該固定相對氨基酸衍生物進行高效液相色譜手性拆分,并考察了流動相中異丙醇

2、含量對手性拆分的影響.結果表明,該手性固定相對所分析的氨基酸衍生物大部分都具有一定的拆分能力.當異丙醇含量為l%時,亮氨酸與苯丙氨酸的苯甲酰甲酯衍生物獲得基線分離.當異丙醇含量為20%時,亮氨酸,纈氨酸,丙氨酸,谷氨酸的3,5一二硝基苯甲酰甲酯衍生物獲得基線分離.關鍵詞手性固定相,高效液相色譜,氨基酸衍生物,手性拆分1引言簡單,快速地分析和制備手性化合物一直是藥物學家和有機化學家追求的目標.手性固定相(CSPs)高效液相色譜法(HPLC)因其簡單,快速和準確的優點,已成為分析和分離對映體的最重要的方法¨."刷型"手性固定相(brushtypeCSP)是HPLC手性

3、固定相中非常重要的一類,這類CSP一般通過一定的間隔臂,連接一個單分子層的手性有機分子到硅膠載體上而制得,因而被稱之為"刷型"CSP.Pirkle等最早開展這類手性固定相的研究,主要是將氨基酸的3,5一二硝基苯甲酸衍生物鍵合到硅膠上.徐修容等也將氨基酸的酰胺衍生物鍵合到硅膠上制得手性固定相并對氨基酸衍生物進行拆分.具有不對稱中心的手性固定相的研制,是手性色譜發展的前沿領域.最近的研究動向是對已有固定相進行結構的修飾和尋找新的廉價手性源.目前,未衍生的氨基酸的手性檢測用配體交換柱ll.或者配體交換毛細管電泳¨已滿足,也可用冠醚手性柱¨來進行手性拆分,但氨基

4、酸衍生物的手性檢測還有許多難點.本研究利用易得的手性原料(尺)一1一苯基2一對甲基苯基乙基胺與異亮氨酸縮合制得含兩個手性中心的手性選擇劑,通過鍵合將其連接到氨丙基硅膠上,制得未見報道的"刷型"手性固定相,用于拆分氨基酸衍生物獲得了較好結果.2實驗部分2.1儀器與試劑BrukerDPX300核磁共振儀(芬蘭Bruker公司);ElementarVarioEL元素分析儀(德國AnalysengeriteGmbH公司);CGY一100液相色譜裝柱機(北京福思源);1100系列高效液相色譜儀,包括G1311A型四元泵,G1314A型可變波長紫外檢測器(VWD)和化學工作站(美國安捷

5、倫公司).球形硅膠(青島美高化工廠),粒徑l0m,平均孔徑10nm,比表面390m/g;()一N一叔丁氧羰基異亮氨酸(上海吉爾生化股份),(尺)一1一苯基2一對甲基苯基乙基胺(江蘇揚農化工股份);2一乙氧基一1一乙氧碳酰基一1,2一二氫喹啉(EEDQ),氨丙基三乙氧基硅烷(Acros,美國);二環己基碳二酰亞胺(DCC),亮氨酸,正纈氨酸,丙氨酸,苯丙氨酸,蛋氨酸,絲氨酸,谷氨酸,精氨酸(北京化學試劑公司);其它試劑均購自北京化學試劑公司并經重蒸后使用.20061012收稿;200612-28接受Email: 分析化學第35卷2.2實驗方法2.2.1氨丙基硅膠(AP

6、S)的制備3.0g經酸活化的硅膠在100和P20存在下真空干燥10h.加入20mL干燥甲苯,裝上分水器,在120下回流分水3h.加入6.0mL氨丙基三乙氧基硅烷,回流9h,用G4砂芯漏斗過濾,依次用無水甲醇,甲苯和無水甲醇洗滌,抽干,在60下真空干燥10h.元素分析結果:C.3.42%;N.0.92%;H.1.22%.2.2.2手性固定相的制備合成路線如圖1所示.將2.31g(L).N.叔丁氧羰基異亮氨酸放人100mL的三口燒瓶中,加30mL四氫呋喃攪拌溶解,冰鹽浴至0C;然后滴加2.11g(R).PTE的15mL四氫呋喃溶液,再滴加2.10gDCC的15mL四氫呋喃溶液,保持在0C反應2h,

7、然后自然升溫到室溫繼續反應15h.過濾除去不溶的副產物,濾液旋蒸脫溶除去四氫呋喃得產物2(白色).加入80mL二氯甲烷溶HR/NyCOOH:(1)(R)PTE,0/,而l.c.'.入HB.c,NH/4)TFA,DCM0OHN,H.OOv/(CH:)NHllH圖1手性固定相的合成路線Fig.1Reactionschemeforthepreparationofchiralstationaryphase解,經5%的HC1溶液,飽和NaHCO溶液,飽和NaC1溶液洗滌后,用無水NaSO干燥.將干燥好的溶液濾人100mL的三口燒瓶中,冰鹽浴至0C,滴加5mL三氟乙酸,攪拌反應30min旋蒸脫溶得

8、產物3(白色固體).將固體溶于40mL無水吡啶中,冰鹽浴至0C,滴加1.1g琥珀酸酐的15mL吡啶溶液,然后室溫攪拌反應24h.旋蒸脫溶除去吡啶得白色固體,用乙酸乙酯/石油醚(2-1,V/V)重結晶得產物4(白色固體).將2.15g產物4溶于30mL無水四氫呋喃中,冰鹽浴至0C,加入3.0g氨丙基硅膠(APS),加入2.0g(EEDQ),反應24h.濾掉溶液,固體用四氫呋喃,無水甲醇,乙醚洗滌,60C真空干燥6h得手性固定相.2.3色譜條件色譜柱為不銹鋼柱(4.6mm×250mm,i.d.).3.0g固定相分散于30mL四氯化碳中,超聲波處理12min,采用高壓勻漿法裝柱,裝柱壓力為

9、37.5MPa,頂替液為正己烷/異丙醇(90:10,V/V).色譜分離均在室溫下進行,流動相經過濾,超聲脫氣后使用,流速為1.0mL/min.氨基酸衍生物參照文獻13制備,用正己烷/異丙醇(90:10,V/V)溶解后進樣,檢測波長均為254nm.色譜柱死時間用1,3,5.三叔丁基苯測定,為2.69min.3結果與討論3.1手性固定相的表征各中間體產物都經核磁共振氫譜確證其結構.產物2:H-NMR(CDC1,300MHz),7.317.22,(m,5H),7.026.93,(m,4H),6.34(d,1H,J=7.11),5.24(d,1H,J=6.72),4.92(s,1H),3.883.83

10、(m,1H),3.073.01(m,2H),2.28(S,3H),1.851.83(m,1H),1.43(S,9H),1.25(S,1H),0.95(S,1H),0.800.78(m,6H);產物3:H-NMR(CDC13,300MHz),7.67(d,1H,J=8.46),7.607.20(m,5H),7.046.90(m,4H),5.265.19(m,1H),3.21(d,1H,J=3.84),3.122.98(m,2H),2.28(S,3H),1.941.86(m,1H),1.271.19(m,1H),1.030.88(m,1H),0.860.76(m,6H);產物4:H.NMR(DMS

11、O,300MHz),l2.01(S,1H),8.35(d,1H,J=,e,卜第6期譚徐林等:手性胺酰胺型液相色譜手性固定相的制備及幾種氨基酸衍生物的拆分8478.58),7.72(d,1H,J:9.05),7.387.19(m,5H),7.147.02(m,4H),5.064.98(m,1H),4.204.14(m.1H),2.952.80(m,2H),2.412.26(m,4H),2.23(s,3H),1.531.51(m,1H).1.141.11(m,1H),0.890.86(m,1H),0.680.54(m,6H).手性固定相元素分析結果:C.11.62%:N.2.35%;H.1.88%

12、.3.2手性固定相的手性拆分能力評價用氨基酸衍生物對手性固定相的拆分能力進行初步評價.以正己烷和異丙醇為流動相,手性樣品在固定相上的拆分結果見表1和表2.氨基酸衍生物的結構見圖2.化合物l7的結構見圖2(thestructure0fracematesl一7isshowninFig.2);k容量因子(capacityfactor);d:分離因子(selectivityfactor);Rs:分離度(resolutionfactor).表2,v_3,5一二硝基苯甲酰氨基酸甲酯衍生物在手性固定相上的拆分結果化合物813的結構見圖2(thestructureofracemates8一I3isshowni

13、nFig.2).olR=CHCH(CH).亮氰酸(1eucine);2R=CH!CHCH,正纈氨酸(nor-varine);3R=CH,丙氨酸(alanine):4R=cH:CH苯氧酸(PheyIa】anjne):5R=CH!CH,SCH,蚩氨酸(methionine);6R=CH2OH,絲氧酸(serine);7.R=CH,CH,COOH.谷氨酸(glutamicacid);圖2外消旋化合物的結構oNO18R=cH:CH(CH,)2,亮氨酸0eucine);9R=CH,CH,CH,正纈氨酸(nor-varine);10R=CH,丙氨酸(alanine);l】R=CH,OH.絲氨脧(serin

14、e);12R=CH,CHCOOH.谷氨酸(glutamicacid);13R=(cH2),NHC(NH)NH:,精氨酸(arginine).上述結果表明,除絲氨酸,谷氨酸的苯甲酰甲酯衍生物和精氨酸的3,5一二硝基苯甲酰甲酯衍生物未能獲得拆分外,其它的氨基酸衍生物獲得了較好的拆分.由表1可知,隨異丙醇含量的減少,溶質的容量因子增大,分離因子增大;而分離度也隨之增大.這是由于隨異丙醇濃度的減少,流動相的極性降低,固定相與溶質之間作用力增強.當流動相中異丙醇含量為1%時,亮氨酸,苯丙氨酸甲酯的苯甲酰衍生物獲得基線分離,其分離因子和分離度分別為1.18,2.53和1.11,1.60.而對于氨基酸3,5

15、一二硝CooCR人NHHCooCR,NH848分析化學第35卷dl41618201517l9l8202224303540t/mint/mint/mint/min圖3N-苯甲酰基氨基酸甲酯衍生物的手性拆分色譜圖Fig.3ChromatogramsofenantioseparationofN-benzamideOmethylesterderivativesofaminoacidsa.亮氨酸(1eucine);b.正纈氨酸(norvMine);C.苯丙氨酸(Phenylalanine);d.蛋氨酸(methionine);流動相(mobilephase):正已烷/異丙醇(nhexane/isopro

16、pano1)99:1,(wv);流速(flowrate):1.0mL/min;檢測波長(detectorwavelength):254am.基苯甲酰甲酯衍生物,流動相中異丙醇的含量對分離因子的影響不明顯.當流動相中異丙醇含量為20%時,亮氨酸,纈氨酸,丙氨酸,谷氨酸甲酯的3,5.二硝基苯甲酰衍生物都能獲得基線分離.圖3是亮氨酸(a),正纈氨酸(b),苯丙氨酸(c)和蛋氨酸(d)的苯甲酰甲酯衍生物手性拆分色譜圖.普遍認為,鍵合型小分子手性固定相拆分機理為氫鍵作用,7r.7r作用和偶極.偶極作用.本研究氨基酸衍生物的分離可能主要依賴于這些作用.氨基酸衍生物分子中含有苯環,酰胺和酯基,與手性固定相的

17、苯環和羰基可分別發生7r?7r作用和氫鍵作用.兩個對映體由于結合力的差異導致復合物的穩定性不同,因而有不同的洗脫順序,達到分離的目的.流動相中極性成分異丙醇和樣品分子競爭與手性固定相的作用,加快洗脫,所以增加異丙醇的含量可減少保留時間,同時手性選擇作用也隨之減小.在亮氨酸,正纈氨酸,丙氨酸中,尺基團逐漸變小,其容量因子反而逐漸變大,分離因子卻變小,說明氨基酸衍生物與手性固定相之間還存在立體阻礙作用,這種作用對手性識別有影響.References1YuShilin(于世林).MethodsandApplicationsofHighPeormaneeLiquidChromatography(高效液

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21、陳娟娟),ZhangDatong(張大同),ShenBaochun(沈報春),ZhangXuejun(張雪君),XuBeijia(徐貝佳),XuXiuzhu(徐秀珠).ChineseAna1.Chem.(分析化學),2,006,34(11):15351540SatoK,NakanoH,HoboT.Chromatogr.A,1994,666:463470234567890123第6期譚徐林等:手性胺酰胺型液相色譜手性固定相的制備及幾種氨基酸衍生物的拆分84914PirldeWH.PochapskyTC,MahlerGS,CoreyDE,RenoDS,AlessiDM.,.Org.Chem.,19

22、86,51(25):4991500oPreparationofAmideChiralStationaryPhaseContainingChiralAmineforHighPerformanceLiquidChromatographyandTanXuLin,HouShiCong,WangMin(CollegeofScience,DepartmentofAppl&dChemistry,ChinaAgriculturalUniversity,Beifing100094)AbstractAchiralselectorwhichcontainingtwochiralcenterswasp

23、reparedbycondensationof(R)-1-phenyl一2-(4一methylpheny1)ethylaminewithL-isoleucine.TheL(Boc)-isoleucinewasreactedwith(R)-PTEusingOCCascondensingagentindrytetrahydrofuranatOCfor2handthenatroomtemperaturefor15h.Theinsolublebyproductwasfiltered.Thefiltratewasconcentratedinvacuum,dilutedwithmethylenechlor

24、ideandwashedwith5%HC1solution,saturatedaqueousNaHCO3,andsaturatedNaC1.Theorganicphasewasseparated,driedoveranhydrousNa2SO4overnight.TheBocgroupwassubsequentlycleavedwithtrifluoroaceticacidtoaffordthechiralselector.Thechiralselectorwascovalentlybondedtoaminopropylsilicagelforpreparationofthechiralsta

25、tionaryphaseusingsuccinicanhydrideasconnectingspacer.ThechiralstationaryphasewasappliedtotheenantioseparationofaminoacidderivativesbyHPLCusingn-hexane/isopropanolasmobilephase.Theeffectoftheconcentrationofisopropanolinmobilephaseonenantioseparationwasinvestigated.Theresultsshowedthatthechiralstationaryphasepossessedtheenanti0selecjvitytoaminoacidderivatives.Whentheconcentrationofisopr