1、枯草芽抱桿菌的分離及篩選微生物設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)枯草芽抱桿菌的分離及篩選1實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆湛莶菅勘U菌的分離篩選的基本原理，熟練掌握無菌接種技術(shù)、微生物分離篩選技術(shù)和微生物形態(tài)觀察技術(shù)。了解枯草芽抱桿菌的分布、營養(yǎng)、生長等特點(diǎn)，以及它所具有的產(chǎn)淀粉酶的功能。根據(jù)這些特點(diǎn)進(jìn)行分離和篩選，從而得到純菌株。2實(shí)驗(yàn)原理枯草芽抱桿菌屬革蘭氏陽性菌，芽抱0.60.9X.01.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽抱形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時(shí)，常形成皺酸。需氧菌。有的菌株是淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌；有的菌株具有強(qiáng)烈降解核甘酸的酶系。廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中

2、，易在枯草浸汁中繁殖，故名。選擇含淀粉豐富的土壤為最佳，80度的水浴處理樣品1小時(shí)，目的是殺死微生物營養(yǎng)體，殘留芽胞。利用稀釋涂步法，在淀粉的培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)1-3天后，觀察。然后，進(jìn)行初篩與純化，鑒定參照伯杰氏細(xì)菌手冊鑒定或者利用顯微鏡進(jìn)行革蘭氏染色，確認(rèn)是否為枯草芽抱桿菌。再復(fù)篩，測定其淀粉酶活，最后確定菌株。3實(shí)驗(yàn)材料3.1 選擇培養(yǎng)基本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行產(chǎn)淀粉酶的枯草芽抱桿菌的篩選，所以應(yīng)選淀粉培養(yǎng)基。配方:牛肉膏5.0g蛋白陳10.0g氯化鈉5.0g可溶性淀粉10.0g瓊脂20g蒸儲水1000ml調(diào)整pH至7.2配置時(shí)應(yīng)先把淀粉用少量蒸儲水調(diào)成糊狀，再加入到融化好的培養(yǎng)基中。3.2 溶液或試

3、劑牛肉膏1.25g蛋白陳2.5g氯化鈉1.25g可溶性淀粉2.5g瓊脂5g碘11克，碘原液2毫升，碘化鉀42克，可溶性淀粉2克，磷酸氫二鈉45.23克，檸檬酸8.068克，氯化鉆25克，重銘酸鉀3.34克，100毫升0.01NHCL。3.4 儀器或其他用品平板培養(yǎng)皿10個(gè)、試管15支、三角瓶2個(gè)、燒杯3個(gè)、稱量紙、高壓蒸汽滅菌鍋、干燥箱、包溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、無菌涂布器、電熱恒溫水浴、500ml量筒、顯微鏡、無菌吸管、無菌培養(yǎng)皿、無菌刻度吸管、酒精燈、記號筆、火柴、試管架、接種鉤、滴管等。4實(shí)驗(yàn)流程倒平板一制備梯度稀釋液一涂布一培養(yǎng)一初篩一復(fù)篩一純化一保存5實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備制備淀粉培養(yǎng)基，

4、無菌水，在121攝氏度下滅菌20min。倒平板。把接種工具，培養(yǎng)基，和其他用品全部在超凈工作臺上擺好，進(jìn)行紫外線滅菌30min。5.1 制備土壤稀釋液取土樣時(shí)最好選取如花壇等地方的土樣，選好采樣地點(diǎn)，鏟產(chǎn)去表層5cm,取515cm處。用無菌器具規(guī)范采樣幾十克，裝入無菌的塑料袋或紙袋中扎好，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、采樣環(huán)境等以備考證。采樣后應(yīng)盡快分離。振搖約二十分鐘，使土樣與水充分混合，將細(xì)胞分散。放入盛有99ml無菌水三角瓶中，常壓80度的水浴處理樣品1小時(shí)后，取出。用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取1ml加入另一盛有9m

5、l無菌水的試管中，混合均勻，以此類推，制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀釋度的土壤溶液。5.2 涂布將上述每種培養(yǎng)基的三個(gè)平板底面分別用記號筆寫上10-3、10-4、10-5三種稀釋度，然后用無菌吸管分別由10-3、10-4、10-5三管土壤稀釋液中各吸取0.2ml,小心地滴在對應(yīng)平板培養(yǎng)基表面中央位置。用無菌涂布器涂布。右手拿無菌涂布器平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展，使之分布均勻。室溫下靜置510min,使菌液浸入培養(yǎng)基。5.3 培養(yǎng)將淀粉培養(yǎng)基平板倒置于30C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)13d。5.4 初篩觀察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黃色，將這樣的菌種單

6、個(gè)菌落分別挑取少許細(xì)胞接種到培養(yǎng)基上，置于30的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需要再一次進(jìn)行分離純化。(如不能用肉眼更好的觀察，可對其進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，與標(biāo)準(zhǔn)菌種比較。)5.8 復(fù)篩測定其淀粉酶活。5.8.1 試劑和器材1、試劑：(1)碘原液：稱取碘11克，碘化鉀22克，加水溶解，稀釋至500毫升。(2)稀碘液：取碘原液2毫升，加碘化鉀20克，稀釋至500毫升，此試劑隨配隨用。(3) 2%淀粉液：稱取干燥過的可溶性淀粉2克，加5毫升蒸儲水，攪拌混和，冉徐徐傾入70毫升煮沸的蒸儲水中。繼續(xù)煮沸2分鐘，冷卻至室溫，加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH為6)(4)檸檬酸緩沖液：稱取磷酸氫二

7、鈉(N&HPO412H2O)45.23克，檸檬酸(C6H8。7H2O)8.068克，加水溶解，稀釋至1000毫升。(5)標(biāo)準(zhǔn)比色液：稱取氯化鉆(C0CL2-6H2O)25克和重銘酸鉀3.34克溶于100毫升0.01NHCL,其五倍稀釋作標(biāo)準(zhǔn)。(6)樣品：細(xì)菌-a淀粉酶2、器材(1)電熱恒溫水浴(2)試管(3)量筒(4)吸量管(1ml)5.8.2 操作方法：1、取試管1支，力口20毫升2%淀粉，混勻，在30c水浴中，使管內(nèi)溫度達(dá)到30C。2、將淀粉酶0.5ml加到30c的淀粉液中，混勻，在30c水浴中保溫，自加入記時(shí)，經(jīng)5分鐘后取反應(yīng)液1毫升，加入盛有5毫升稀碘液的試管中?；靹?，目測比色

8、，每隔一定時(shí)間重復(fù)測定，直至呈色與標(biāo)準(zhǔn)比色顏色相同為止，記錄反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間。3、計(jì)算。在上述條件下，每一小時(shí)催化1毫升2%可溶性淀粉水解的酶量，定為一個(gè)酶活力單位。5.9 純化并保存菌種保存時(shí)一般都需要不受雜菌污染，菌種變異很少，并能盡量保持細(xì)菌的形態(tài)和生理性狀不發(fā)生變化。同時(shí)，做好以下工作：(1)做好菌種保存記錄，注明菌種名稱，分離年月日、分離者姓名、分離地點(diǎn)等。(2)防止雜菌污染及意外事故，把菌種保存在23只試管中備用。(3)原始菌種妥善保存。6結(jié)果與分析6.1 分離到枯草芽抱桿菌菌的株數(shù)6.2 枯草芽抱桿菌產(chǎn)酶活性大小及形態(tài)觀察鑒定結(jié)果【注明參考文獻(xiàn)，格式參考學(xué)術(shù)論文樣式】枯草芽抱桿菌的

9、鑒定實(shí)驗(yàn)1、形態(tài)的觀察(形狀、顏色、質(zhì)地、透明度等)(1)單個(gè)菌體的形態(tài)(2)群體形態(tài)的觀察2、革蘭氏染色3、芽抱染色4、菌體大小測量5、枯草芽抱桿菌的生理生化鑒定:、過氧化氫酶測定1、原理：過氧化氫酶能催化過氧化氫分解成水和氧2、試劑：310%過氧化氫:肉湯瓊脂培3、操作步驟：將測試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，30培養(yǎng)12天。取一干凈載玻片，在上面加一滴310%的過氧化氫，挑取一環(huán)培養(yǎng)12天的菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡(氧氣)出現(xiàn)，記作過氧化氫酶陽性,無氣泡者為陰性。也可將液直接加入斜面上，觀察氣泡的產(chǎn)生。二、需氧性試驗(yàn)1、原理：不同種類的芽抱桿菌對氧氣的需求性常有差異，因此本實(shí)驗(yàn)可

10、作為鑒定芽抱桿菌的一個(gè)較重要指標(biāo)。2、培養(yǎng)基：半固體培養(yǎng)基3、操作步驟：用一小環(huán)的肉湯菌液穿刺接種到上述培養(yǎng)基中（必須穿刺到管底），一般于30培養(yǎng)3-7天觀察結(jié)果。若芽抱桿菌在瓊脂柱表面生長為好氧菌，沿著穿刺線上生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌三、乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)1、原理：本實(shí)驗(yàn)是測定芽抱桿菌（或其他細(xì)菌）發(fā)酵葡萄糖的變化。有些芽抱桿菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，并將產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為中性化合物，如乙酰甲基甲醇或的“瓜基起作用，生成紅色化合物，即表示2,3-丁二醇。乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中可被空氣中的氧氣氧化成二乙酰，后者與蛋白陳中精氨酸所含V.P.試驗(yàn)陽性。若在培養(yǎng)基中加入少量肌酸以補(bǔ)充胴基，可加速反應(yīng)。反

11、應(yīng)式如下：2丙酮酸一乙酰甲基甲醇+2二氧化碳；-2H乙酰甲基甲醇二乙酰；+KOH縮合二乙酰+NH=C（NH2）2紅色化合物2、培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基：蛋白陳5g,葡萄糖5g,NaCl5g,蒸儲水1000ml。調(diào)節(jié)PH6.5,每管分裝45ml,0.06MPa（8lbf/in2）30min滅菌試劑：3、步驟：1.接種與培養(yǎng)將芽抱桿菌測試菌接種于上述培養(yǎng)液中，一般于30攝氏度培養(yǎng)4天。2.結(jié)果觀察在培養(yǎng)4天后，取培養(yǎng)液（約2ml）和等量的40%NAOH相混合，如少量肌酸（約0.51mg）,充分振蕩，25min后如培養(yǎng)液呈紅色，即為V.P.試驗(yàn)陽性，有時(shí)須放置更長時(shí)間才出現(xiàn)紅色反應(yīng)。四、淀粉水解1、原理：許多芽抱桿菌產(chǎn)生淀粉酶，能將培養(yǎng)基中的淀粉水解成無色糊精等小分子物質(zhì)或進(jìn)一步水解為麥芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。2、培養(yǎng)基及試劑：培養(yǎng)基：在肉湯瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分裝于三角瓶。0.1MPa（15lbf/in2）20min滅菌備用。試劑：3、步驟：將培養(yǎng)基融化后，冷卻至50攝氏度左右，倒成平板，凝固后取菌種點(diǎn)鐘于平板上（每皿點(diǎn)鐘2點(diǎn)），一般于30攝氏度培養(yǎng)2-4天,形成菌落后，在平板上滴加盧哥爾氏碘液，以鋪滿菌落為度，平板呈藍(lán)色，而菌落周圍如有五色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。盧哥爾氏碘液40%NAOH（或KOH）