1、第五章第五章 薄層色譜法和薄層色譜法和高效液相色譜高效液相色譜法法 教學目標教學目標n1、掌握薄層色譜法和高效液相色譜法。薄層色譜法和高效液相色譜法。n2、掌握薄層色譜法和高效液相色譜法在天然藥物化、掌握薄層色譜法和高效液相色譜法在天然藥物化學中的應用。學中的應用。n3、掌握中藥有效成分結構鑒定方法。、掌握中藥有效成分結構鑒定方法。第一節薄層色譜法第一節薄層色譜法一、定義：一、定義： 是把固定相均勻地涂在一塊玻璃板或塑料板上，形成是把固定相均勻地涂在一塊玻璃板或塑料板上，形成一定厚度的薄層并使其具有一定的活性，在此薄層上一定厚度的薄層并使其具有一定的活性，在此薄層上進行色譜分離，這種方法稱為進

2、行色譜分離，這種方法稱為薄層色譜。薄層色譜。二、特點二、特點n 簡單，易行，價格低廉簡單，易行，價格低廉n 分析快速分析快速n 在色譜板上檢測樣品，不會丟失組分在色譜板上檢測樣品，不會丟失組分n 可用多種顯色劑可用多種顯色劑n 可在同一塊板上同時分離多個樣品可在同一塊板上同時分離多個樣品n 所需樣品量少所需樣品量少n 靈敏度高靈敏度高三、基本原理三、基本原理利用作為固定相的吸附劑對混合物中各種成分吸附能力的大小的不利用作為固定相的吸附劑對混合物中各種成分吸附能力的大小的不同，使各成分得到相互分離。同，使各成分得到相互分離。四、固定相（吸附劑）四、固定相（吸附劑） 硅膠硅膠H H（不含粘合劑）（

3、不含粘合劑） 硅膠硅膠Q Q（含有（含有15153535石膏作為粘合劑）石膏作為粘合劑） HF HF254254（含在（含在254nm254nm波長紫外光下顯熒光的無機熒光劑）波長紫外光下顯熒光的無機熒光劑） HF HF254+365nm254+365nm五、制備與分析五、制備與分析n 鋪層鋪層n 點樣點樣n 展開展開n 顯色顯色n對于樣品的酸堿性，如果試樣與吸附劑一為酸性一為堿性，則有可能會發生酸堿反應而產生不可逆吸附，使分離過程難以進行。故吸附劑與的酸堿性應與試樣保持一致。硅膠稍帶酸性，氧化鋁稍帶堿性，可以將二者：混合制成中性的吸附劑，或用稀堿液制備薄層使硅膠薄層成堿性，或用稀酸液制備薄層

4、使氧化鋁薄層成酸性或在展開劑加酸堿來調其酸堿性溶劑、吸附劑的選擇規律n記住一個圖六、應用六、應用 1、有機合成、有機合成1: 硝基苯標準樣品硝基苯標準樣品2: 反應前混合液反應前混合液3: 反應液反應液4: 苯胺標準樣品苯胺標準樣品 可在可在254nm下進行下進行A：反應開始前：反應開始前B：反應：反應10minC：反應：反應20minD：反應：反應30min31 214441133ABCD2、控制中藥制劑的質量、控制中藥制劑的質量 選擇與確定對照品選擇與確定對照品 制備供試液制備供試液 對色譜分離條件進行優選對色譜分離條件進行優選舉例說明舉例說明甲康寧顆粒中五味子醇甲的薄層色譜圖甲康寧顆粒中

5、五味子醇甲的薄層色譜圖1:對照品對照品 2:藥材藥材 3:制劑制劑 4:陰性對照陰性對照12 3 4第二節第二節 高效液相色譜法高效液相色譜法 高壓液相、高速液相色譜法（特點：高壓液相、高速液相色譜法（特點：高高 壓、高速、高靈敏度）壓、高速、高靈敏度） 為了解決固定液的流失，研制了化學為了解決固定液的流失，研制了化學鍵合固定相鍵合固定相 將十八烷基將十八烷基C18H37 高壓泵高壓泵 進樣器和色譜柱進樣器和色譜柱 檢測器檢測器貯液器貯液器高壓泵高壓泵進樣器進樣器色譜柱色譜柱餾分收集器餾分收集器檢測器檢測器記錄儀記錄儀制備：制備：盡可能多的獲得樣品純組分盡可能多的獲得樣品純組分 分析型色譜柱：

6、（內徑分析型色譜柱：（內徑45mm，長，長2550cm）半制備：半制備：（內徑（內徑910mm，長，長2550cm）制備柱制備柱: （內徑（內徑2022mm，長，長25cm）制備柱上樣量分析柱上樣量制備柱上樣量分析柱上樣量dc2:制備柱內徑制備柱內徑 L2：制備柱長：制備柱長dc1:分析柱內徑分析柱內徑 L1：分析柱長：分析柱長121222LdLdcc流量的放大比：流量的放大比：制備柱流量分析柱流量制備柱流量分析柱流量2122ccdd塔板數：塔板數： 2212)(54. 5)(16YtwtnRbR21YtR: 保留時間保留時間wb：峰寬峰寬 半峰寬：峰高一半時的寬度半峰寬：峰高一半時的寬度分離

7、度分離度w: 為峰寬為峰寬R1.5 兩峰完全分離兩峰完全分離2112)(2wwttRR第三節第三節 天然藥物化學成分天然藥物化學成分結構測定的一般步驟：結構測定的一般步驟：一、測定程序一、測定程序n純度純度(可以用薄層，但必須是三種不同的展開系統來證明可以用薄層，但必須是三種不同的展開系統來證明）n分子式的測定（分子式的測定（元素分析、高分辨質譜元素分析、高分辨質譜）n化合物功能基和分子骨架的推定（化合物功能基和分子骨架的推定（紫外光譜紫外光譜UI、紅外光譜紅外光譜IR、質譜質譜MS、核磁共振譜核磁共振譜NMR）n化合物結構式的確定化合物結構式的確定（還可測定試樣的旋光譜以確定化合物的（還可測

8、定試樣的旋光譜以確定化合物的立體化學結構，采用立體化學結構，采用X射線研究化合物的精細結構，如鍵長、射線研究化合物的精細結構，如鍵長、鍵角、和絕對構型）鍵角、和絕對構型）二、測定方法二、測定方法n確定分子式并計算不飽和度確定分子式并計算不飽和度n公式：公式：u=u=-/2+/2+1(-/2+/2+1(u u表示分子的不飽和度；表示分子的不飽和度；表示一價原子的數目；表示一價原子的數目；表示三價原子的數目；表示三價原子的數目； 表示四價原子的數目）表示四價原子的數目）n例如分子式例如分子式C C3030H H4848O O3 3，則該化合物的不飽和度為，則該化合物的不飽和度為3030。n質譜質譜

9、n2、紫外、紫外可見光譜可見光譜n是利用不同的波長（常在是利用不同的波長（常在200700nm)的紫外及可見光的紫外及可見光為光源，依次照射一定濃度的試樣溶液，化合物分子為光源，依次照射一定濃度的試樣溶液，化合物分子因吸收紫外及可見光而產生電子躍遷，在不同的波長因吸收紫外及可見光而產生電子躍遷，在不同的波長處測量物質的吸收度，按吸收強度和吸收波長作圖所處測量物質的吸收度，按吸收強度和吸收波長作圖所得的吸收光譜。得的吸收光譜。n主要提供分子中有無共軛系統及共軛系統的長短；有主要提供分子中有無共軛系統及共軛系統的長短；有無醛、酮、酸、酯）。不是整個分子的特征。無醛、酮、酸、酯）。不是整個分子的特征

10、。n3、紅外光譜、紅外光譜n通常是采用通常是采用2.515m(4000m(4000667cm667cm-1-1) )范圍內不同波長范圍內不同波長的光波為光源，依次照射試樣，化合物分子中化學鍵的光波為光源，依次照射試樣，化合物分子中化學鍵的振動與轉動，將在此區域內引起吸收，記錄試樣的的振動與轉動，將在此區域內引起吸收，記錄試樣的吸收曲線所的吸收光譜。吸收曲線所的吸收光譜。n提供的信息主要是分子中具有哪些特定的官能團。對提供的信息主要是分子中具有哪些特定的官能團。對于已知化合物可與標準圖譜對照，以特征區、指紋區于已知化合物可與標準圖譜對照，以特征區、指紋區與標準圖譜對照。與標準圖譜對照。n特征區（

11、特征區（ 40001250cm-1)，對官能團的定性具有決定，對官能團的定性具有決定性的意義。性的意義。nO-H、N-H伸縮振動區（伸縮振動區（ 37503000cm-1)；C-H伸縮伸縮振動區（振動區（ 33002700cm-1)；三鍵對稱伸縮區是；三鍵對稱伸縮區是（ 24002100cm-1)；羰基的伸縮振動區是；羰基的伸縮振動區是（ 19001650cm-1)；雙鍵的對稱伸縮振動區是；雙鍵的對稱伸縮振動區是（ 16901600cm-1)；C-H彎曲振動區（彎曲振動區（ 1000650cm-1)。n指紋區主要是由原子或原子團間的鍵角變化所引起。此區間的吸收譜線細密、重疊復雜、且大多吸收強度

12、較小，譜帶特征性差，難以解析，但分子結構的細微變化均能在此區域明顯的反應出來，使每一化合物均有各自不同的吸收曲線，如同指紋。n4、質譜n化合物分子經電子流沖擊或其它手段打掉一個電子后，形成正電荷離子，然后裂解成一系列的碎片離子，這些陽離子在電場和磁場綜合作用下，按照離子質量大小依次排列而成的圖譜。nM-eM+n橫坐標是荷質比，縱坐標是相對豐度。n相對豐度：以強度最大的峰（稱為標準峰或基峰）為100，其余的峰按與標準峰的比例加以表示，此種表示方法最為常用。n常見的碎片離子m/z值 離子 可能的結構類型29 CHO、C2H5 醛基、乙基30 CH2NH2 伯胺43 CH3CO、C3H7 乙酰基、丙

13、基45 COOH、CH3CH2O 羧基、乙氧基29、43、57、71 CH2H5、C3H7等 直鏈烴類39、50、51、52、65、77等 芳香化合物的開裂產物 芳香化合物60 CH3COOH 羧酸類、醋酸酯91 C6H5CH2 芐基105 C6H5CO 苯甲酰n5、核磁共振譜（Nuclear Magnetic Resonance)n是在一定強度的磁場作用下，以一定的頻率的無線電波照射分子，引起分子中具有磁矩的原子核（如1H、13C）的能級躍遷，產生強弱不同的信號，記錄吸收信號的強度，對應其吸收頻率所得的波譜。n天然化合物中主要含有C、H原子，所以天然化合物化學成分結構的測定常應用氫核磁共振譜

14、（1H-NMR）和碳核磁共振譜（1C-NMR）。n氫核磁共振譜（1H-NMR）能夠提供分子中不同種類氫原子的相關信息如氫原子的化學環境、不同化學環境下的氫原子的數目及其相鄰基團結構等。n碳核磁共振譜（1C-NMR）化學位移范圍較氫譜廣，分辨率高，所以能提供更多有關分子骨架結構的信息。n（1）、化學位移n化合物分子中的氫核，由于所處化學環境的不同，會在不同的射頻頻率處產生共振，在譜圖中顯示出吸收峰位置的移動，這種因化學環境變化而引起的共振譜線位移的現象稱為化學位移。n其絕對值較難測定，以相對值表示，符號是，國際統一單位是ppm。n不同的化學結構常在不同的特定區域內出現核磁共振譜峰，如下表所示一些

15、不同類型氫核化學位移的大致范圍。化學位移與化學結構的關系質子 分子類型 值范圍 C-H 脂肪族 0.05.0CC H 炔 1.83.0CCH 烯 4.57.5芳香質子 苯環或芳環 6.09.5O CH 醛 9.010.0OH 醇 0.5 5.5 酚 4.8 8.0 酸類 10.0 13.0NH 脂肪胺 0.32.2 芳香胺 2.65.0 酰胺 5.08.5n(2)、偶合常數：磁性核之間的相互作用-自旋偶合會引起核磁共振峰出現裂分現象，表現出不同的多重峰如二重峰、三重峰、四重峰、多重峰等。n裂分的重峰中小峰間的距離為偶合常數，單位是HZ。n對于1H而言，磁不等同的相鄰氫是產生自旋偶合的基本條件。

16、n各等價基團內的1H核間沒有相互作用，不產生自旋裂分，如甲基-CH3中的三個1H核無裂分現象。n裂分后的小峰數符合n+1規律（n為鄰近C上干擾氫原子的數目）。n裂分峰的小峰強度之比以二項示（X+1）n展開后各項前的系數表示。n（3）、峰面積：在氫核磁共振譜中，峰面積以積分曲線高度表示，氫的數目與其面積積分值基本成正比。n舉例乙苯的核磁共振譜。思考題n1、什么叫質譜？n2、什么叫氫譜？n3、什么叫制備型高效液相色譜？n4、簡述薄層層析法、高效液相色譜法在中藥化學中的應用。n5、什么叫Rf值？比較以下幾個化合物在硅膠吸附色譜上Rf值的大小，并說明為什么？OHACHOBCOOHCn6、簡述高效液相色譜分離法的工作原理？什么叫分