1、離體蛙心灌流【目的要求】1、學習斯氏離體蛙心灌流法。2、觀察離子及藥物等對離體心臟活動的影響。【基本原理】 心臟的正常節律性活動需要一個適宜的內環境（如Na，K，Ca2等的濃度及比例、pH值和溫度），內環境的變化直接影響到心臟的正常節律性活動。 將失去神經支配的離體心臟保持于適宜的理化環境中（任氏液Ringer solution），在一定時間內仍能產生自動節律性興奮和收縮。離子對心臟活動的影響離子對心臟活動的影響 改變任氏液的組成成分，離體心臟的活動就會受到影響。 K K+ +參與心肌細胞的復極化和自律細胞的4 4期自動去極化過程，其改變不僅取決于細胞內外K K+ +濃度梯度，還與細胞膜對K

2、K+ +通透性有關，因此其影響是多方面的。 CaCa2+2+對NaNa+ +內流存在競爭抑制作用，稱膜屏障作用，對靜息電位無影響。CaCa2+2+o o ，可使心肌細胞的興奮性降低，傳導減慢，收縮力增強。 在體心臟受交感神經和迷走神經的雙重支配 交感神經末梢釋放去甲腎上腺素，與心肌細胞受體結合，使心肌收縮力加強，傳導速度加快，心率加快；阻斷劑心得安 迷走神經末梢釋放乙酰膽堿，與心肌細胞M受體結合，使心肌收縮力減弱，心肌傳導速度減慢，心率減慢；阻斷劑阿托品【動物、器材與試劑】蟾蜍或蛙、紗布、毀髓針、眼科鑷、手術剪、眼科剪、蛙板、蛙釘、玻璃分針、滴管、細棉線、蛙心夾、鐵支架、萬能滑輪、小燒杯、斯氏

3、蛙心套管、雙凹夾、套管夾、張力換能器、生物信號計算機采集系統任氏液、0.65% NaCl 、2% CaCl2 、1% KCl 、1/10000腎上腺素、1/10000乙酰膽堿、阿托品、300U/ml肝素。【方法與步驟】1、儀器準備2、離體蛙心的制備3、連接實驗裝置4、實驗觀察1、儀器準備打開計算機生物信號采集系統，選擇實驗項目-循環實驗-離體蛙心灌流。熟悉實驗標記的使用。參考：生理模擬實驗軟件-離子和藥物對離體蛙心的影響2、離體蛙心的制備（斯氏蛙心插管法） 在左主動脈下方穿線，靠上端結扎，作插管時牽引用 在主動脈干下方穿線，在動脈圓錐上方打一活結備用（用以結扎和固定插管）。 左手提起左主動脈上

4、方的結扎線，右手用眼科剪在結扎線下方、沿向心方向將動脈管壁剪一斜口（注意要剪破血管內膜，每次心縮時有血自切口涌出，但不要把血管剪斷，剪口位置視套管尖端長度與心臟大小而定）。 選擇大小適宜的斯氏蛙心套管，盛入少量任氏液（內加一滴肝素溶液，套管內23cm高度） 。 左手用眼科鑷提起切口緣，右手將注有任氏液的斯氏套管插入動脈干內，然后左手持左側血管分支上的結扎線向外拉，右手將蛙心套管送入動脈圓錐。 當套管尖端到達動脈圓錐基部時，應將套管稍向后退（因主動脈內有螺旋瓣會阻礙插管前進），并將套管尾端稍向右主動脈方向及腹側面傾斜，使插管尖端向動脈圓錐的背部后下方及心尖方向推進，在心室收縮時經主動脈瓣進入心室

5、。注意插管不可插得過深，插管的斜面應朝向心室腔，以免插管下口被心室壁堵住。此時可見血液沖入套管，并使液面隨心臟搏動而上下移動，表明操作成功（否則需退回并重新插入）用滴管吸去套管中的血液，換新鮮任氏液。 穩定住套管后，輕輕提起備用線，將左、右主動脈連同插入的套管用雙結扎緊（不得翻液），再將結線固定在套管的小玻璃鉤上，然后剪斷結扎線上方的血管。 看清靜脈竇的位置，在心臟的下方繞一線，將左右肺靜脈及前后腔靜脈一起結扎（注意切勿損壞靜脈竇）。輕輕提起套管和心臟，于靜脈竇下方剪斷有牽連的組織，僅保留靜脈竇與心臟的聯系，使心臟離體。 用任氏液反復沖洗心室內余血，使套管內灌流液不再有殘留血液。保持套管內液面

6、高度一致（1.52cm，或在套管的下1/3處結一線作為標志，每次換任氏液時使液面與此線相平），即可進行實驗。其他方法技巧 用蛙心夾提起心尖，使心室與動脈圓錐約呈100-200的鈍角，然后當心室縮緊時把套管平直往心室方向推進。當感覺套管進入心室后再把心尖放平，隨即將套管稍向心室推進，調整合適位置，可見套管內液面隨心跳而升降。3、連接實驗裝置 將套管固定在支架上，用蛙心夾在心舒期夾住少許心尖部肌肉（不要夾多，以免夾破心室而漏液）。 將蛙心夾上的系線繞過一個滑輪與張力傳感器相連。勿使灌流液滴到傳感器上。4、實驗觀察1)記錄正常心搏曲線。2)改用0.65% NaCl溶液灌流，并作好加藥標記，觀察心搏變

7、化。待曲線出現明顯變化時，立即吸去套管中的灌流液，同時做好沖洗標記，并用新鮮任氏液清洗23次，待心搏恢復正常。注意：換液時切勿碰套管，以免影響描記曲線的基線，同時保持灌流液面一致（下同）。 3)向套管內加26滴5% NaCl溶液，作好加藥標記，觀察心搏曲線的頻率及振幅變化。當曲線出現明顯變化時，應立即吸去套管中的灌流液，并做好沖洗標記，迅速用新鮮任氏液清洗23次，待心搏恢復正常。 4)向套管內加12滴2% CaCl2溶液，作好加藥記號，觀察心搏曲線的頻率及振幅變化。標記、沖洗至心搏恢復正常 5) 向套管內加入12滴1% KCl溶液，記錄心搏曲線的變化。當心搏曲線變化時，同法更換灌流液，待心搏恢

8、復正常。 6)同法記錄套管中加入12滴腎上腺素溶液(1/10000)后心搏曲線的變化。 7)同法記錄套管中加入12滴乙酰膽堿溶液(1/10000)后心搏曲線的變化。 8)同法記錄套管中先加入阿托品后再加12滴乙酰膽堿溶液(1/10000)后心搏曲線的變化。【注意事項】 1、制備離體心臟標本時，勿傷及靜脈竇。 2、蛙心夾應在心室舒張期一次性夾住心尖，避免因夾傷心臟而導致漏液。 3、每一觀察項目都應先描記一段正常曲線，然后再加藥并記錄其效應。加藥時應在心跳曲線上予以標記，以便觀察分析。 4、各種滴管應分開，不可混用。 5、在實驗過程中，插管內灌流液面高度應保持恒定；儀器的各種參數一經調好，應不再變

9、動。 6、標本制備好后，若心臟功能狀態不好（不搏動），可向插管內滴加12滴2%CaCl2或1：10000腎上腺素，以促進（起動）心臟搏動。在實驗程序安排上也可考慮促進和抑制心臟搏動的藥物交換使用。 7、給藥后若效果不明顯，可再適量滴加，并密切注意藥物劑量添加后的實驗結果。給藥量必須適度，加藥出現變化后，就應立即更換任氏液，否則會造成不可挽回的后果，尤其是K稍有過量，即可導致難以恢復的心臟停跳。 8、謹防灌流液沿絲線流入張力傳感器內而損壞其電子元件。實驗結果實驗結果CaClCaCl2 2灌流灌流KClKCl灌流灌流1:10000 E1:10000 E灌流灌流4 4期期 If If 、I CaTI

10、 CaT通道通道4 4期自動去極速度期自動去極速度自律性自律性心率心率與心肌與心肌1 1受體結合受體結合CaCa2+2+內流內流肌漿網釋放肌漿網釋放CaCa2+2+興奮興奮- -收縮耦聯收縮耦聯收縮力收縮力cAMPcAMP1:10000 Ach1:10000 Ach灌流灌流與心肌與心肌M M受體結合受體結合K K+ +外流外流, Ca, Ca2+2+內流內流E-CE-C耦聯耦聯收縮力收縮力最大復極電位最大復極電位 4 4期期K K+ +外流外流 自律性自律性心率心率CaCa2+2+ii【思考題】 1、心臟灌流說明心肌的哪些生理特性？ 2、用實驗說明內環境相對恒定的重要意義。 3、試分析任氏液中

11、適量的鈉離子、鈣離子與鉀離子對心肌的作用。 4、為何強調實驗中保持灌流液面的恒定?灌流量對心臟活動會有什么影響？ 5、試想，活的機體在心交感神經興奮或心迷走神經興奮時對心臟會有什么影響？實驗拓展 溫度的影響：把套管內換成4任氏液，同時作好標記，觀察曲線變化，待效應明顯后，即換入室溫任氏液。待曲線恢復正常后，再進行下一項目。同法，換入40的任氏液，如上觀察。或以冰塊、40熱水接觸靜脈竇，效果更明顯。 酸堿等藥物的影響：加2.5%NaHCO31滴，混勻；加3%乳酸1滴，待效應明顯后，再加1滴2.5%NaHCO3，觀察曲線的變化。 用任氏液反復沖洗心室內余血，使套管內灌流液不再有殘留血液。保持套管內液面高度一致（1.52cm，或在套管的下1/3處結一線作為標志，每次換任氏液時使液面與此線相平），即可進行實驗。 6、標本制備好后，若心臟功能狀態不好（不搏動），可向插管內滴加12滴2%CaCl2或1：10000腎上腺素，以促進（起動）心臟搏動。在實驗程序安排上也可考慮促進和抑制心臟搏動的藥物交換使用。 7、給藥后若效果不明顯，可再適量滴加，并密切注意藥物劑量添加后的實驗結果。給藥量必須適度，加藥出現變化后，就應立即更換任氏液，否則會造成不可挽回的后果，尤其是K稍有過量，即可導致難以恢復的心臟停跳。 8、謹防灌流液