1、幾種蛋白質含量測定方法的比較【摘要】：蛋白質含量測定方法，是生物化學研究中最常用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法(Biuret)、紫外吸收法、考馬斯亮藍法（Bradford），Folin酚試劑法（Lowry）杜馬斯燃燒法。其中Bradford 法靈敏度頗高，比紫外吸收法靈敏1020 倍,比Biuret法靈敏100 倍以上。凱氏定氮法雖然比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質作為其他方法的標準蛋白質。過去Folin酚試劑法法是應用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現在已可以在本公司訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。測定農產品中全氮的凱氏定氮法在許多

2、國家已被杜馬斯然燒定氮法所代替，杜馬斯燃燒法是基于在高溫下(大約 900 ），通過控制進氧量、氧化消解樣品的原理而進行氮測定的。這6種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質，每種方法都有其優缺點，在選擇方法時應考慮：實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；蛋白質的性質；溶液中存在的干擾物質；測定所要花費的時間【關鍵詞】：凱氏定氮法 雙縮脲法 紫外吸收法 考馬斯亮藍法 Folin酚試劑法 杜馬斯燃燒法 一 、凱氏定氮法1.1 原理 凱氏定氮法測定蛋白質分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定4 個過程。其原理是樣品中含氮有機化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化，含氮有機物分解產生氨,氨又與硫酸作用,變成硫

3、酸銨。然后加堿蒸餾放出氨, 氨用過量的硼酸溶液吸收,再用鹽酸標準溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質含量。1.2 特點 凱氏定氮法是目前分析有機化合物含氮量常用的方法，是測定試樣中總有機氮最準確和最簡單的方法之一，被國際國內作為法定的標準檢驗方法。凱氏定氮法樣品的最佳消化條件為硫酸銅2.50 g, 硫酸鉀0.10 g,濃硫酸4.00 mL；硫酸銅的用量為影響消化時間的主要因素,硫酸鉀和濃硫酸用量為第二和第三主要因素；用此最佳條件做實驗, 消化時間僅為12 min；與其他硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸用量方法對比,該法所需消化時間最短,試劑用量減少,可降低實驗成本,也降低了對環境的污染。 凱氏定氮法適用范圍廣

4、泛，測定結果準確,重現性好，但操作復雜費時,試劑消耗量大。若采用模塊式消化爐代替傳統的消化裝置, 可同時測定幾份樣品，節省時間,提高了工作效率，適用于批量蛋白質的測定,具有準確、快速、簡便、低耗、穩定的優點。二 、雙縮脲法(Biuret )2.1 原理雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個分子脲經180 左右加熱,放出1 個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4 形成紫色絡合物,稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵,或能夠以1 個中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關,故可用來測

5、定蛋白質含量。2.2 特點雙縮脲法中樣品的取用量對測定結果的準確性有顯著影響, 采用0.5 g 樣品,40 mL 雙縮脲試劑的比例具有較高的檢測精度。雙縮脲法對不同的蛋白質產生顏色的深淺相近,不受溫度的影響。可快速測定蛋白質含量，試劑單一,方法簡便，但靈敏度差，測定范圍為120 mg 蛋白質。適用于需要快速,但并不需要十分精確的蛋白質測定，常用于谷物蛋白質含量測定。三 、紫外吸收法3.1 原理蛋白質分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵,使蛋白質具有吸收紫外光的性質,吸收峰在280 nm 處,其吸光度(即光密度值)與蛋白質含量成正比。此外,蛋白質溶液在238 nm 的光吸收值與

6、肽鍵含量成正比。利用一定波長下,蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系,可以進行蛋白質含量的測定。3.2 特點最常用的紫外吸收法是280 nm 的光吸收法，含有核酸的蛋白質溶液使用280 和260 nm 的吸收差法較好。蛋白質的稀溶液采用215 與225 nm 的吸收差法。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定，測定后仍能回收使用。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續檢測,因為此時只需測定蛋白質濃度的變化,而不需知道其絕對值。缺點是測定蛋白質含量的準確度較差,干擾物質較多,在用標準曲線法測定蛋白質含量時,對那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質有一定的誤差,故

7、該法適于用測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質,會出現較大的干擾。核酸在紫外區也有強吸收，但通過校正可以消除。但是因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的,雖然經過校正,測定的結果還是存在一定的誤差。此外,進行紫外吸收法測定時, 由于蛋白質吸收高峰常因pH 的改變而有變化,因此要注意溶液的pH 值,測定樣品時的pH 要與測定標準曲線的pH 相一致。四 、考馬斯亮藍法( Bradford)4.1 原理Bradford 法是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。考馬斯亮藍是一種有機染料，在游離狀態下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質的堿性氨基酸（ 特別是

8、精氨酸）和芳香族氨基酸殘基結合后變為藍色，其最大吸收波長從465 nm 變為595 nm, 蛋白質在11 000 g 范圍內, 蛋白質色素結合物在595 nm波長下的吸光度與蛋白質含量成正比,故可用于蛋白質的定量測定。4.2 特點考馬斯亮藍G-250 與蛋白質結合反應十分迅速而穩定,2 min 左右即達到平衡,其結合物室溫下1 h內保持穩定，且在520 min 之間,顏色的穩定性最好。該法方法簡便,易于操作,所用試劑較少,顯色劑易于配制。干擾物質少,如糖、緩沖液、還原劑和絡合劑等均不影響顯色。此法的缺點是由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同, 因此Bradford 法用于不同蛋白質

9、測定時有較大的偏差,在制作標準曲線時通常選用- 球蛋白為標準蛋白質,以減少這方面的偏差。標準曲線也有輕微的非線性,因而不能用Beer 定律進行計算,而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。該方法適用于要求靈敏度高、快速定量測定微量蛋白質的測定。五 、Folin酚試劑法（Lowry法）5.1 原理Lowry法蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現在已可以在本公司訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深

10、蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。 Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。5.2 特點Folin酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以后在生物化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的優點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。對雙縮脲反應發生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、

11、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉氫氧化鈉溶液的濃度12倍。六 、杜馬斯燃燒法6.1 原理 Dumas法的基本原理是樣品在9001200高溫下燃燒，燃燒過程中產生混合氣體，其中的干擾成分被一系列適當的吸收劑所吸收， 混合氣體中的氮氧化物被全部還原成分子氮，隨后氮的含量被熱導檢測器檢測。燃燒，杜馬斯燃燒法是基于在高溫下(大

12、約 900 ），通過控制進氧量、氧化消解樣品的原理而進行氮測定的。燃燒生成的氣體被載氣 CO2攜帶直接通過氧化銅作為催化劑） 而被完全氧化。 此外， 化合物中一定量的難氧化部分會被載氣攜帶通過作為催化劑的氧化銅和鉑混合物進一步氧化。還原，燃燒生成的氮氧化物在鎢上還原為分子氮，同時過量的氧也被結合了。一個傳感器用來控制最佳燃燒所需的氧氣量，這可以保證氧氣和鎢的消耗量最少。凈化，一系列的適當的吸收劑將干擾成分如鹵化氫從被檢測氣流中除去。隨后的水冷器確保水蒸氣的去除。由于用CO2作載氣,所以沒必要吸收燃燒生成的CO2。檢測，用一個TCD熱導檢測器來檢測 CO2 載氣流中剩余的氮。N2體積含量引發一種

13、電子測量信號，通過它，再經過物質的獨立校正，被測樣品中的氮含量就自動的計算、打印和存儲起來。6.2 特點用杜馬斯快速定氮儀每個測試只需3至5分鐘,并可以通過自動進樣器連續進樣,不需要人看管;不需要復雜的樣品前處理過程;不產生有毒有害物質；操作簡便。七 、結語種蛋白質測定方法比較如表1所示方法靈敏度時間原理說明凱氏定氮法靈敏度低，適用于0.21.0mg費時，810h將蛋白質轉化為氮，酸吸收后滴定用于標準蛋白質含量的準確測定；干擾少；費時太長雙縮脲法靈敏度低適用于120mg中速，810h多肽鍵+堿性Cu2+形成紫色絡合物用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質顯色相似紫外吸收法較為靈敏快速510min

14、蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基在處的光吸·收用于層析柱流出液的檢測；核酸的吸收可以校正考馬斯亮藍法非常靈敏快速515min考馬斯亮藍燃料與蛋白質結合時，光波由465nm變為595nm干擾物質少；顏色穩定；顏色深淺隨蛋白質不同而變化Folin酚試劑法（Lowry法）非常靈敏費時多肽鍵+堿性Cu2+形成紫色絡合物靈敏度高；費時；專一性較差；干擾物質較多杜馬斯燃燒法靈敏度低最快35min燃燒過程中產生混合氣體，混合氣體中的氮氧化物被全部還原成分子氮，隨后氮的含量被熱導檢測器檢測不產生有毒有害物質；操作簡便可以通過自動進樣器連續進樣廣泛用于農產品中粗蛋白含量的測定參考文獻1 李曉艷. 淺談凱氏定氮法測定食品中蛋白質注意事項J . 計量與測試技術2008年第35卷第8期2 張厚鋒 張淑萍. 雙縮脲法和凱氏定氮法測定飼料中蛋白質含量的比較研究 - 中國飼料料2008(7)3 陳革. 改良雙縮脲法測定飼料蛋白質的應用研究 期刊論文 -飼料工業2003(3)4 王雅 蛋白質測定實驗的研究 期刊論文 -實驗室研究與探索2005(4)5 楊家華.謝占玲.愈芳.趙國珍 考馬斯亮蘭法測定西寧市售主要四種袋裝牛奶的蛋白質