1、1實驗三實驗三 牛乳中酪蛋白的制備與鑒定牛乳中酪蛋白的制備與鑒定 溫馨提示：請將教室水浴鍋打開，溫度調(diào)至溫馨提示：請將教室水浴鍋打開，溫度調(diào)至40。并將乙酸。并將乙酸-乙酸鈉緩沖液（乙酸鈉緩沖液（1瓶瓶/室）放入水室）放入水浴鍋內(nèi)，預熱至浴鍋內(nèi)，預熱至40。2（1）學習從牛乳中制備酪蛋白的方法。）學習從牛乳中制備酪蛋白的方法。（2）了解從牛奶中制取酪蛋白的原理。）了解從牛奶中制取酪蛋白的原理。（3）驗證蛋白質(zhì)的雙縮脲反應性質(zhì)。）驗證蛋白質(zhì)的雙縮脲反應性質(zhì)。（4）學習和掌握蛋白質(zhì)雙縮脲反應的原理和方法。）學習和掌握蛋白質(zhì)雙縮脲反應的原理和方法。一、實驗目的一、實驗目的二、實驗原理二、實驗原理 牛

2、乳中主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為牛乳中主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電酪蛋白是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電點為點為4.8。利用。利用等電點時溶解度最低等電點時溶解度最低的原理，將牛的原理，將牛乳的乳的pH調(diào)至調(diào)至4.8時，酪蛋白就沉淀出來。用時，酪蛋白就沉淀出來。用乙醇洗乙醇洗滌沉淀物滌沉淀物，乙醚除去脂類雜質(zhì)乙醚除去脂類雜質(zhì)后便可得到純的酪后便可得到純的酪蛋白。蛋白。二、實驗原理二、實驗原理 兩分子尿素加熱到兩分子尿素加熱到180左右時，生成雙縮脲左右時，生成雙縮脲并放出一分子氮，并放出一分子氮，雙縮脲雙縮脲在在堿性環(huán)境堿性環(huán)境中能與中能與Cu

3、2+結(jié)合生成結(jié)合生成紫紅色化合物紫紅色化合物，此反應稱為，此反應稱為雙縮脲反應雙縮脲反應。 二、實驗原理二、實驗原理 蛋白質(zhì)分子中有蛋白質(zhì)分子中有肽鍵肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應，因此該反應可用于蛋白質(zhì)的也能發(fā)生此反應，因此該反應可用于蛋白質(zhì)的定定性性或或定量定量測定。測定。N N 端端C C 端端6三、儀器和試劑三、儀器和試劑1、儀器、儀器： 恒溫水浴鍋、低速離心機、電子天平、酒精燈等。恒溫水浴鍋、低速離心機、電子天平、酒精燈等。2、試劑、試劑： 乙酸乙酸-乙酸鈉緩沖液（乙酸鈉緩沖液（pH4.6）、1%氫氧化鈉、氫氧化鈉、10%乙酸、蒸餾水、無水乙醇、乙酸、蒸

4、餾水、無水乙醇、10%氯化鈉、氯化鈉、0.5%碳碳酸鈉、酸鈉、0.1mol/L氫氧化鈉、氫氧化鈉、0.2%鹽酸、飽和氫氧化鈣、鹽酸、飽和氫氧化鈣、尿素尿素、10%氫氧化鈉、氫氧化鈉、1%硫酸銅。硫酸銅。7四、實驗步驟四、實驗步驟1 1、酪蛋白的制備：、酪蛋白的制備： （1）量取）量取10mL牛奶置于牛奶置于25mL刻度試管中，水浴中加刻度試管中，水浴中加熱至熱至40。在攪拌下慢慢加入。在攪拌下慢慢加入10mL預熱至預熱至40的的乙酸乙酸-乙乙酸鈉緩沖液（酸鈉緩沖液（pH4.6）。用精密試紙調(diào)用精密試紙調(diào)pH值至值至4.8（可選擇（可選擇1%氫氧化鈉氫氧化鈉或或10%乙酸乙酸溶液進行調(diào)整）。溶液

5、進行調(diào)整）。40保溫保溫10min，使沉淀完全。使沉淀完全。 （2）將上述懸浮液冷卻至室溫。）將上述懸浮液冷卻至室溫。2000r/min離心離心5min，棄去上清液。棄去上清液。8四、實驗步驟四、實驗步驟1 1、酪蛋白的制備：、酪蛋白的制備： （3）往沉淀物中加入）往沉淀物中加入5mL蒸餾水，混勻后蒸餾水，混勻后2000r/min離心離心5min， 棄去上清液。棄去上清液。 （4）將洗凈的沉淀物加入）將洗凈的沉淀物加入3mL無水乙醇，混勻后無水乙醇，混勻后2000r/min離心離心5min， 棄去上清液，得棄去上清液，得酪蛋白粗制品。酪蛋白粗制品。 （5）將沉淀物全部攤開在）將沉淀物全部攤開在

6、已稱過重的濾紙已稱過重的濾紙上，置于上，置于25烘箱中烘干。烘箱中烘干。 （6）準確稱重，計算牛乳中酪蛋白含量（）準確稱重，計算牛乳中酪蛋白含量（g/100mL）,并與理論含量為并與理論含量為3.5g/100mL牛乳相比較，求出實際得率。牛乳相比較，求出實際得率。9四、實驗步驟四、實驗步驟2 2、酪蛋白的溶解度鑒定：、酪蛋白的溶解度鑒定： 取取6支試管，分別加入蒸餾水、支試管，分別加入蒸餾水、10%氯化鈉、氯化鈉、0.5%碳碳酸鈉、酸鈉、0.1mol/L氫氧化鈉、氫氧化鈉、0.2%鹽酸及飽和氫氧化鈣各鹽酸及飽和氫氧化鈣各1mL。于每管中加入少量酪蛋白，不斷搖蕩，觀察并記錄。于每管中加入少量酪蛋

7、白，不斷搖蕩，觀察并記錄各管中酪蛋白的溶解度。各管中酪蛋白的溶解度。10四、實驗步驟四、實驗步驟3 3、酪蛋白的顏色反應（雙縮脲反應）：、酪蛋白的顏色反應（雙縮脲反應）： 取少量尿素結(jié)晶，放入干燥的試管，微火加熱使尿素熔取少量尿素結(jié)晶，放入干燥的試管，微火加熱使尿素熔化，熔化的尿素開始硬化時停止加熱，尿素放出氮，形成雙化，熔化的尿素開始硬化時停止加熱，尿素放出氮，形成雙縮脲。冷卻后，加入縮脲。冷卻后，加入1mL 10NaOH溶液，振蕩混勻，再加溶液，振蕩混勻，再加入數(shù)滴入數(shù)滴 1CuSO4溶液，振蕩，觀察實驗現(xiàn)象。（溶液，振蕩，觀察實驗現(xiàn)象。（此步驟由此步驟由教師演示。）教師演示。） 向另一支

8、試管中加入少量酪蛋白溶液，加入向另一支試管中加入少量酪蛋白溶液，加入2mL 10NaOH溶液，搖勻，再加入數(shù)滴溶液，搖勻，再加入數(shù)滴1CuSO4溶液，隨加隨搖，溶液，隨加隨搖，觀察實驗現(xiàn)象。觀察實驗現(xiàn)象。111、酪蛋白含量（、酪蛋白含量（g/mL）=酪蛋白酪蛋白g/10mL 100%2、酪蛋白得率、酪蛋白得率=測定含量測定含量/理論含量理論含量100%3、酪蛋白溶于哪些溶液？、酪蛋白溶于哪些溶液？4、酪蛋白的雙縮脲反應分析。、酪蛋白的雙縮脲反應分析。五、實驗結(jié)果、計算與分析五、實驗結(jié)果、計算與分析 12酪蛋白酪蛋白+蒸餾水蒸餾水+數(shù)滴數(shù)滴1%硫酸銅硫酸銅酪蛋白酪蛋白+10%氯化鈉氯化鈉+數(shù)滴數(shù)滴1%硫酸銅硫酸銅酪蛋白酪蛋白+0.5%碳酸鈉碳酸鈉+數(shù)滴數(shù)滴1%硫酸銅硫酸銅酪蛋白酪蛋白+0.1mol/L氫氧化鈉氫氧化鈉+數(shù)滴數(shù)滴1%硫酸銅硫酸銅酪蛋白酪蛋白+0.2%鹽酸鹽酸+數(shù)滴數(shù)滴1%硫酸銅硫酸銅酪蛋白酪蛋白+飽和氫氧化鈣飽和氫氧化鈣+數(shù)滴數(shù)滴1%硫酸銅硫酸銅酪蛋白酪蛋白+10%氫氧化鈉氫氧化鈉+數(shù)滴數(shù)滴1