1、子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染河南省人民(rnmn)醫院病理科 孔令非第一頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染病理學新技術(jsh)oFISHo原位雜交o免疫(miny)組織化學o生物傳感器第二頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染o熒光原位雜交熒光原位雜交Fluorescence in situ hybridizationo原理原理利用DNA堿基對的互補性，將直接標記了熒光的單鏈DNA(探針)和與其互補(h b)的目標樣本的DNA(玻片上的標本)雜交,通過觀察熒光信號在染色體上的位置反映相應染色體的情況第三頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染FISH操作(cozu

2、)樣本預處理樣本預處理 脫蠟，脫水及水化，消化，脫蠟，脫水及水化，消化，探針、樣本變性探針、樣本變性 78 78 探針樣本雜交探針樣本雜交 45-5045-50雜交后洗滌雜交后洗滌結果觀察結果觀察第四頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染FISH FISH 探針探針(tn zhn)(tn zhn)種類種類CSP著絲粒探針著絲粒探針(tn zhn)(tn zhn)GLP特異性位點探針特異性位點探針(tn zhn)(tn zhn)染色體整臂探針第五頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染FISHFISH探針探針(tn zhn)(tn zhn)的類型的類型l 全染色體涂抹探針全染色體涂

3、抹探針 （WCPWCP）l 染色體計數染色體計數(j sh)(j sh)（著絲粒）探針（著絲粒）探針（CSPCSP）l 位點特異性探針（位點特異性探針（GLPGLP） l單色特異性探針單色特異性探針l雙色分離重排探針雙色分離重排探針l雙色雙融合易位探針雙色雙融合易位探針 第六頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染IgHBcl2IGH/BCL2探針探針14（灰）號和（灰）號和18號（黑）染色體號（黑）染色體IgH基因基因Bcl-2基因基因雜交雜交正正 常常 異異 常常融合融合基因擴增基因擴增雙色雙融合雙色雙融合(rngh)(rngh)易位探針易位探針( IGH/BCL2( IGH/BCL

4、2）第七頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染 FISHFISH的特點的特點(tdin)(tdin)操作簡單(jindn) 檢測快速 結果易觀察靈敏性和特異性高可檢測樣本種類多 空間定位精確第八頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染FISH檢測(jin c)在臨床中的應用o產前診斷o血液病檢測(jin c)o實體瘤檢測第九頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染端粒，端粒酶及作用(zuyng)o端粒是真核細胞染色體末端的特殊NDA-蛋白結構，其DNA含大量TTAGGG重復序列，在進化中高度保守oDNA酶不能復制線性DNA（端粒是線性DNA）o大多數體細胞的端粒會隨周期性復

5、制而縮短，最終達到一個使染色體完整性喪失的臨界點，細胞增殖停止；許多腫瘤細胞端粒酶活性增高，是腫瘤細胞增殖的關鍵步驟o作用：n保護染色體基因組免受降解或重組n為染色體末端提供一種可消耗(xioho)的非編碼序列，以緩解或取消末端復制所帶來的染色體DNA進行性縮短o生殖細胞具有端粒酶活性，其端粒不隨年齡增加而縮短，故成為永生細胞第十頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染o端粒酶由RNA，DNA及蛋白質組成，本質是一種逆轉錄酶o端粒酶活性決定于端粒酶RNA（human telomerase RNA, hTERChTERC)和端粒酶催化亞單位(human telomerase reverse

6、 transcriptase, hTERThTERT)nhTERC是端粒長度穩定的直接因素o保持端粒穩定、基因組完整、細胞(xbo)長期有活性和潛在的繼續增殖能力o人端粒酶基因位于3q26.3，該基因的擴增可阻止細胞凋亡，導致腫瘤產生 第十一頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染宮頸脫落(tulu)細胞及組織學FISH探針CSP3TERChTERChTERC基因基因(jyn)(jyn)定位于定位于3q26.33q26.3 3 3號染色體著絲粒信號號染色體著絲粒信號(xnho)(xnho)第十二頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染All the three centers ob

7、tained similarly increasing trend of hTERC positive rates according to the severity of cervical lesions, for both cytological results and pathological diagnosis. 第十三頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染中國(zhn u)8350例子宮頸病變TERC擴增TBSTBS分級分級正常正常/ /炎癥炎癥ASCUSASCUSASC-HASC-HLSILLSILHSILHSILTERCTERC基因擴增發生率（基因擴增發生率（% %）4.

8、64.613.513.528.628.625.225.287.787.7病理分級病理分級正常正常/ /炎癥炎癥CIN 1CIN 1CIN 2CIN 2CIN 3CIN 3浸潤癌浸潤癌TERCTERC基因擴增發生率（基因擴增發生率（% %）4.2-10.64.2-10.626.826.865.465.483.183.193.593.5第十四頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染hTERC檢測(jin c)臨床意義o伴有hTERC基因擴增的癌前病變的病人(bngrn)有52%96%的惡變可能。 o可預測CIN1/CIN2 向CIN3發展的風險因素，其靈敏度是100% ， 特異性是 70%.

9、 oFISH是早期診斷和風險預測的有效手段(AJP April 2005, Vol. 166, No. 4)第十五頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染ohTERChTERC基因檢測在宮頸癌和宮頸癌前病基因檢測在宮頸癌和宮頸癌前病變診斷中有重要價值變診斷中有重要價值n魏麗惠，李亞里，吳瑞芳，陳忠，屠錚，江靜，李靜然o北京大學人民醫院婦科，北京，中國o中國解放軍總醫院婦科，北京，中國o北京大學深圳醫院婦產科，深圳，中國o猶他大學醫學遺傳學科，鹽湖城，美國o該研究顯示，采用FISH技術檢測hTERC基因擴增可在宮頸細胞學玻片上進行，具有無創性和客觀性的特點，敏感度和特異度高，在宮頸癌和宮頸

10、癌前病變的診斷中有重要價值。hTERC基因的異常(ychng)擴增可能成為宮頸病變惡性進展的早期標記物。o北京協和醫院郎景和教授點評：北京協和醫院郎景和教授點評：n在液基細胞學檢查和檢測人乳頭狀瘤病毒篩查宮頸癌的同時，檢測hTERC基因，有望成為協助宮頸癌和宮頸癌前病變診斷及預測癌前病變是否向子宮頸癌(z n jn i)發展的重要指標，而造福廣大婦女。第十六頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染細胞細胞(xbo)癌變癌變阻止細胞阻止細胞(xbo)正常凋亡正常凋亡高危型高危型HPVHPV持續性感染持續性感染人類染色體端粒酶基因人類染色體端粒酶基因(hTERC)(hTERC)擴增擴增致癌基

11、因致癌基因E6/E7E6/E7編碼的原癌蛋白表達編碼的原癌蛋白表達TERC基因的擴增可阻止細胞凋亡，導致腫瘤產生 P16P16表達表達E7結合結合RBE6結合結合p53第十七頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染o隨著宮頸病變級別增加，hTERC的陽性率增加ohTERC陽性率n正常或炎癥組 4.2-10.6%nCIN1組 26.8% nCIN2組 69.23%nCIN3組 83.58%n宮頸癌組 95.65% 正常及正常及CIN1CIN1的的hTERChTERC基因陽性率明顯低于基因陽性率明顯低于CIN2CIN2及以上者，及以上者，P P 0.010.01 ohTERC診斷CIN2或C

12、IN2以上(yshng)病變n敏感度 81.40%n特異度 95.04%n陽性預測值 70.00% n陰性預測值陰性預測值 97.29%97.29% 第十八頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染第十九頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染Human Papilloma Virus(HPV)o環狀雙鏈DNA病毒o超過120種亞型o其中(qzhng)的72種亞型可引起肛門及生殖器疾病oLow risk (LR-HPV): 6,116,11,40,42,44,54,61,70,72,81,40,42,44,54,61,70,72,81oHigh risk (HR-HPV): 16,1

13、8,16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,63,78,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,63,78,8282第二十頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染 HPV的生物學狀態: 游離(yul)或整合o在HPV感染的早期或瞬間感染，HPV基因組以游離的環狀DNA形式存在于宿主細胞核中。 (Condyloma and CIN-1)o持續的HPV感染，使其DNA整合進宿主DNA，標志著惡性( xng)轉化。 (CIN2lesions)第二十一頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染o持續性的HPV感染(gnrn)幾乎總是發生在兩

14、種上皮的交界處（宮頸移行帶、肛門和口咽）oHPV通過宮頸鱗腺交界處感染基底細胞o或HPV通過微創傷直接感染基底細胞第二十二頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染HPV 檢測及預后預測(yc)價值o陰性預測價值(NPV)約 99%nwomen not infected with HR-HPV have 1% chance to have HSIL lesiono陽性預測價值(PPV) 根據患者(hunzh)的年齡:n30: PPV gradually increased with age and persistent HPV infection第二十三頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中

15、HPV感染原為雜交(zjio)法o用標記的HPV探針在組織上或細胞(xbo)上進行原位的雜交，并進行顯色o特異性最強o敏感性高o直觀o可結合組織學或細胞學形態o探針有：6/11, 16/18, 31/33第二十四頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染導流雜交(zjio)法o擴增所取樣本的DNAo放在固定好基因探針的基因芯片上（21種亞型包括(boku)13種高危亞型16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59,68及5種低危亞型6, 11, 42, 43,44和3種中國人群常見的亞型53,66,CP8304型進行雜交o探針標記Biotin

16、及堿磷酶o用NBT/BCIP進行顯色o結果呈藍紫色第二十五頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染o判定標準判定標準RLU/CutoffRLU/Cutoff 的比值的比值 n 1 = 1 = 陽性陽性, 50, 50以內的數值對病情的嚴重程度并沒有指示性，但以內的數值對病情的嚴重程度并沒有指示性，但5050的的數值對病情的嚴重程度的估計有指導意義。數值對病情的嚴重程度的估計有指導意義。n 1 =1 =陰性，表示未檢出陰性，表示未檢出1313種高危型種高危型HPV DNAHPV DNA序列或標本中不含有高危型序列或標本中不含有高危型HPV HPV DNADNA序列，又或者其濃度水平在測定方

17、法的檢測限度以下序列，又或者其濃度水平在測定方法的檢測限度以下(yxi)(yxi)，不能除外，不能除外潛伏感染；潛伏感染；n如果接近但小于如果接近但小于1.01.0且被懷疑有高危型且被懷疑有高危型HPVHPV感染，應該重新采集標本。感染，應該重新采集標本。 第二十六頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染HC-II的應用(yngyng)條件oHPV test 不適用的情況：n細胞學顯示異型增生時n年齡30歲的女性,細胞學檢查結合HPV test第二十七頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染HPV檢測方法(fngf)的比較原位雜交導流雜交基因捕獲HC-II原理在原位進行HPV DN

18、A的雜交提取DNA進行PCR，進行膜雜交DNA分解，DNA-RNA雜交，抗體捕獲，特點組織學及細胞學涂片上原位顯示分型HPV具體分型顯示HPV,無病毒負荷的提示只顯示高危病毒感染，不具體分型，可提示病毒的負荷敏感性及特異性敏感性+特異性+敏感性+特異性+敏感性+特異性+取材組織或細胞涂片陰道分泌物陰道分泌物第二十八頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染生物(shngw)傳感器技術o24種HPV亞型，其中低危8種（ 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 70 ），高危(o wi)16種（ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56

19、, 58, 59, 66, 68 ,81 ）o可檢測HPV的載量o子宮頸細胞中HPV的情況 單獨感染 混合感染（2、3，6種HPV型）第二十九頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染子宮頸鱗狀上皮病變(bngbin)中HPV感染HPV檢出率1(導流雜交）病毒種類1HR-HPV檢出率2（HC-II)尖銳濕疣92%6,11,31,52低級別CIN89%16,31,18,52,33,6,1174.93%高級別CIN100%16,33,52,1891.72%鱗狀上皮增生33%6,11,16,1843.29%1.北京軍區總醫院病理科2.解放軍總醫院婦產科第三十頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中H

20、PV感染CIN中需注意的問題(wnt)oCIN病變也可表現為鱗狀上皮的表面上皮顯著的不典型增生，而非基底層細胞，是CINI的病理基礎oCIN病變累及腺體n一般：鱗狀上皮CINIII，進一步向下發展延伸至腺體，但未突破基底膜n少數：鱗狀上皮CINII，腺體鱗化也呈CINII，這時為表達腺體的改變，診斷為CINII累及腺體n個別：在腺體鱗化的基礎上出現(chxin)不典型增生，甚至出現(chxin)的不典型增生的程度超過表面鱗狀上皮第三十一頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染絕大多數的HPV感染(gnrn)可回退Cancer第三十二頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染持續性HP

21、V感染(gnrn)導致CIN2-3 oLSIL LSIL 一般由瞬間一般由瞬間HPVHPV感染引起感染引起oHSIL HSIL 發生在那些持續性發生在那些持續性HR-HPVHR-HPV感染感染2 2年以上的年以上的患者患者o大多數年輕大多數年輕(ninqng)(ninqng)的女性的女性(30 yrs)(30 yrs)的的HPVHPV感染感染為暫時性的，將被自體免疫系統清除為暫時性的，將被自體免疫系統清除oHPVHPV持續性感染一般發生在老年女性持續性感染一般發生在老年女性第三十三頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染HPV感染(gnrn)與機體免疫反應o陰道分泌物的粘液抗微生物多肽，

22、抗體，酸性環境及鋅離子等組成第一道防線o子宮頸鱗狀上皮（復層上皮）形成天然屏障，組成第二道防線o內在的非特異性免疫防御系統即炎癥反應，構成第三道防線o局部(jb)的細胞免疫監視，可啟動接觸性級連反應，放大傳遞信號，形成針對殼蛋白L1的特異性細胞免疫反應o大多數的HPV感染細胞將成為HPVL1抗原遞呈細胞；細胞毒T淋巴細胞和輔助T淋巴細胞可識別此細胞，并通過免疫監視和免疫清除殺滅細胞第三十四頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染CytoReacto用敏感的非同位素核酸雜交和免疫組織化學及免疫細胞化學的方法檢測子宮頸細胞中HPV L1 蛋白的存在，可用于細胞學涂片，組織學切片(qi pin

23、)的檢測。o廣譜的HPV L1抗體可識別大多數的HPV L1蛋白（ 6, 11, 16, 18, 31, 33, 42, 51, 52, 56，58）。 第三十五頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染基本原理特點(tdin)o多聚物微球結合非同位素標記HPVL1DNA探針與多聚酶混合物（固態雜交液）o解鏈及雜交過程與抗原修復過程合并o標記物為堿性磷酸酶，底物為AECo原為雜交與免疫組化反應顏色重疊(chngdi)，提高敏感性20-30倍o可檢測出0.01pgHPV L1蛋白o細胞核陽性表達（核膜及核）第三十六頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染oHPV L1HPV L1的存在

24、表明的存在表明HPVHPV病毒感染處于游離狀病毒感染處于游離狀態或瞬時感染期態或瞬時感染期o在在 HPV(+) HPV(+) 的病人中，的病人中，HPV L1HPV L1的缺失，提示的缺失，提示存在存在HPVHPV的持續感染，并有向高級別的持續感染，并有向高級別CINCIN發展發展的趨勢的趨勢(qsh)(qsh)HPV L1檢測(jin c)的臨床意義 第三十七頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染p16檢測(jin c)的意義op16是cyclin依賴性激酶抑制劑，抑癌基因，可抑制CDK4、CDK6活性，降低RB的磷酸化，增強(zngqing)RB的功能，抑制E2F-1的釋放，從而抑

25、制細胞周期oE7結合RB，釋放E2F-1，促使細胞周期oE2F-1的聚集（RB的磷酸化的結果）導致p16的增加op16的高表達提示HPVE7的存在第三十八頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染小小 結結o臨床常用的HPV檢測方法（HC-II，導流雜交）n陰道小環境的HPV感染狀況n間接代表子宮頸HPV感染狀況n不知HPV的生物學存在狀況o生物傳感儀檢測子宮頸組織和細胞中的HPV類型oTERC基因擴增表明細胞的增殖活性增強，提示病變向惡性發展的原動力存在op16的檢測可提示HR-HPV感染，并整合宿主DNAo子宮頸組織和細胞中HPV L1檢測陽性，提示機體免疫可清除HPV病毒感染細胞，使

26、CIN病變向良性發展第三十九頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染u液基薄層細胞制片技術真空負壓吸引，膜式采集技術重力沉降技術離心沉降技術其他u特點：n標本保存時間長，更完整，結構更清晰n細胞數量更多n細胞平鋪，不重疊n更利于(ly)觀察，不易漏觀察n可重復制片第四十頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染u應用范圍：n子宮頸細胞學檢查n體液細胞學檢查（胸腔積液、腹腔積液、尿液、腦脊液及灌洗液等）n分泌物細胞學檢查（痰液）u優勢：明顯提高陽性細胞檢出率u前提：具備豐富診斷(zhndun)經驗的病理醫師是關鍵國外細胞學醫師需要獲得醫師資格證、病理醫師資格證以后，再經過2-3年的專科

27、培訓才能從事細胞學診斷，并擔負相應法律責任國內正在規范，從事細胞學診斷必須有醫師資格證并注冊到病理診斷第四十一頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染o1988年，美國(mi u)國家癌癥研究所在馬利蘭州的Bethesda召開了病理細胞學會議，提出子宮頸細胞學報告的新分類，即Bethesda報告系統（The Bethesda System,TBS）第四十二頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染The Bethesda system for Reporting Cervical Cytology(TBS)o根據根據20012001年第三屆國際年第三屆國際BethesdaBethes

28、da工作會議要求工作會議要求o由著名細胞病理學家由著名細胞病理學家SolomonSolomon和和NayarNayar編著編著o是目前有關子宮頸細胞學分類和診斷標準中最新，最權威的是目前有關子宮頸細胞學分類和診斷標準中最新，最權威的o該系統的該系統的3 3個基本原則：個基本原則：n在不同病理學家及病理科必須是統一的，可重復的，并富有靈活性在不同病理學家及病理科必須是統一的，可重復的，并富有靈活性n能反映對子宮頸腫瘤的最新認識能反映對子宮頸腫瘤的最新認識(rn shi)(rn shi)n能將病理的有關臨床信息傳遞給患者能將病理的有關臨床信息傳遞給患者第四十三頁，共五十一頁。子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染oTBS的改變是基于臨床的進展(jnzhn)和對宮頸癌生物學行為研究的進展(jnzhn)o廢