1、副溶血弧菌耐藥現狀及耐藥機制   本文關鍵詞：    本文簡介：摘要：副溶血弧菌是一種重要的食源性疾病致病菌，其引起的感染已成為嚴重的全球性公共衛生問題。水產養殖業和臨床上抗生素使用不規范，會直接導致或加劇副溶血弧菌耐藥。一方面，耐藥菌可通過食物鏈進入人體，給臨床治療副溶血弧菌感染帶來巨大挑戰；另一方面，耐藥菌中的可移動遺傳元件可以將耐藥基因傳遞給其他細菌，從而    本文內容：   摘要：副溶血弧菌是一種重要的食源性疾病致病菌，其引起的感染已成為嚴重的全球性公共衛生問題。水產養殖業和臨床上抗生素使用不規范，會直接

2、導致或加劇副溶血弧菌耐藥。一方面，耐藥菌可通過食物鏈進入人體，給臨床治療副溶血弧菌感染帶來巨大挑戰；另一方面，耐藥菌中的可移動遺傳元件可以將耐藥基因傳遞給其他細菌，從而產生更大的威脅。本文主要概述了副溶血弧菌的耐藥現狀、耐藥機制及相應的耐藥檢測方法，為副溶血弧菌耐藥產生、傳播及控制提供參考。      關鍵詞：副溶血弧菌； 耐藥； 現狀； 機制； 檢測；      副溶血弧菌是一種嗜鹽性的革蘭陰性菌，廣泛存在于水體、水底沉積物和水生動物體內。副溶血弧菌感染者可出現腹痛、腹瀉、嘔吐、發熱等癥狀，嚴重者可出現敗血癥1.

3、副溶血弧菌污染是食用水產品引起食物中毒的主要原因，大部分病例發生于8-10月。副溶血弧菌感染暴發在全球很多國家和地區常有報道，如美國、法國、新西蘭等，也是亞洲一些國家和地區細菌性食源性疾病的首要致病菌2-4.      在中國，自1998年以來，      由于抗生素在水產養殖業、畜牧業和臨床治療中的不規范使用，細菌耐藥問題日益嚴重，多重耐藥菌株的出現使得常規抗生素失去療效，給臨床治療帶來巨大挑戰。據估計，美國每年耐藥菌感染病例超過200萬例，死亡約2.30萬例6.事實上，除了部分嚴重的病例外，大部分副溶血弧菌感染

4、是自限性的，不需要應用抗生素。      本文主要綜述了副溶血弧菌的耐藥現狀、耐藥機制及相關檢測方法，以期為副溶血弧菌耐藥性相關研究的深入開展提供參考資料，促進抗生素在水產養殖業、畜牧業以及臨床治療中的合理使用。         美國自1978年起就發現副溶血弧菌對氨芐西林有很高的耐藥率7,目前，許多國家和地區分離的副溶血弧菌都普遍對氨芐西林耐藥。在環境和食品分離株中多耐藥現象很普遍，這些菌株對-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類等多種抗生素均有不同程度耐藥，但在臨床分離株中多耐藥現象并不嚴重。 &

5、#160;    1.1 環境和食品分離株的耐藥現狀      從全球范圍看，不同地區環境和食品分離的副溶血弧菌耐藥譜存在差異，這與不同地區水產養殖環境和養殖模式等方面的原因相關。此外有研究發現，從水底沉積物分離的菌株抗生素耐藥率明顯高于從潮水和洪水中分離菌株的耐藥率8.在大西洋海岸，美國馬里蘭州沿海海灣分離的副溶血弧菌，對青霉素類抗生素的耐藥率很高，其中青霉素耐藥率68.00%,氨芐西林53.00%,對哌拉西林和鏈霉素的耐藥率較低，為4.00%,有96.0%的分離株對氯霉素中度耐藥9.大西洋東海岸的南非東開普省也有藥敏數據

6、顯示，副溶血弧菌分離株對氨芐西林均耐藥，同時對治療弧菌常用抗生素如鏈霉素、四環素、卡那霉素等也有不同程度的耐藥10.      全世界的水產養殖業主要集中在發展中國家，尤其是亞洲地區。亞洲地區水產品中分離到的副溶血弧菌也經常有多耐藥的報道：印度西南部蝦養殖場中分離到的120株副溶血弧菌均為多耐藥菌株，對常見的-內酰胺類（氨芐西林）、磺胺類（磺胺甲惡唑）、喹諾酮類（恩諾沙星）藥物有不同程度的耐藥11.Letchumanan等人發現馬來西亞的市售貝類 和蝦類分離的副溶血弧菌大部分為多耐藥菌株12-13,對治療弧菌感染常用的二線和三線藥物均耐藥，其中對氨芐西林

7、的耐藥率最高，為80%以上，其次為阿米卡星、卡那霉素等氨基糖苷類抗生素，對三代頭孢菌素也有一定程度的耐藥。另有研究發現不同水產品分離到的副溶血弧菌耐藥狀況也不同，香蕉蝦中分離的副溶血弧菌多耐藥指數明顯高于紅蝦；斑節對蝦中分離的副溶血弧菌耐藥率明顯高于白蝦、凡納濱對蝦、羅氏沼蝦等其他種屬的蝦14 .      在中國，上海市售蝦對氨芐西林的耐藥率高達99%,其次為鏈霉素（45.30%）、利福平（38.30 %）、壯觀霉素（25.50 %），所有菌株均對四環素和氯霉素敏感14.華北地區市售水產品中分離到的副溶血弧菌對鏈霉素的耐藥率最高，為 86.20%,其次

8、為氨芐西林（49.60%）、頭孢唑林（43.50%）、頭孢噻吩（35.90%），對阿奇霉素和氯霉素均敏感；其中從魚樣本中分離到一株副溶血弧菌對7種抗生素（鏈霉素、頭孢噻吩、頭孢唑林、氨芐西林、卡那霉素、復方磺胺甲惡唑、四環素）耐藥15.除了水產品之外，副溶血弧菌在其他肉食（雞肉、牛肉、豬肉）的檢出率也很高16.中國地區市售即食食品中分離到對五種抗生素耐藥多耐藥菌株均來自熟肉食品，分離到的副溶血弧菌耐藥譜顯示：對鏈霉素耐藥率最高，為89.70%,其次是氨芐西林（51.30%）、頭孢唑啉（51.30%）、頭孢噻吩（41.00%）和卡那霉素（41.00%）；沒有發現對阿奇霉素、氯霉素、環丙沙星、萘啶

9、酸、四環素耐藥的菌株17.      1.2 臨床分離株的耐藥現狀      Pazhani等18對印度15家醫院的腹瀉病人進行了為期12年的監測，分離到178株副溶血弧菌藥敏結果顯示：氨芐西林的耐藥率最高，為98.00%;其次是鏈霉素為86.00%.有一株非大流行菌株對復方磺胺甲惡唑、萘啶酸、四環素、氯霉素、氨芐西林、鏈霉素等多種抗生素耐藥；另有三株菌對所有11種抗生素均敏感。2009 -2013年，從中國東南部8家醫院門診急性腹瀉病人的糞便樣本中分離到的501株副溶血弧菌進行藥敏試驗，氨芐西林的耐藥率最高，為8

10、7.10%,其次是頭孢西丁（56.90%）和頭孢唑林（43.70%）；95%以上的菌株對其他9種常用抗生素敏感19.      目前，有一些研究對副溶血弧菌臨床分離株、環境分離株、食品分離株的耐藥情況進行了比較研究。Tai等20 在越南南部多個城市收集433份急性腹瀉患者糞便樣本、233份水樣、85份食品樣本，共分離到130株副溶血弧菌，分離率分別為8.30%、20.10%和40.00%.藥敏結果顯示氨芐西林耐藥率為45.40%,大部分副溶血弧菌對四環素（90.80%）、氯霉素（97.70%）、環丙沙星（100.00%）敏感。Ottaviani等21對意

11、大利地中海的貝類樣本和臨床樣本中分離的副溶血弧菌進行藥敏實驗，研究發現96.30%的菌株為多耐藥，不同來源的菌株多耐藥指數沒有明顯差別；分析發現，臨床菌株對環丙沙星的耐藥率遠高于環境菌株，其它藥物的耐藥率沒有明顯差別，詳見表1.      有研究對中國副溶血弧菌流行株進行系統綜述，共篩出290株臨床和環境株。發現目前中國的大流行株在耐藥譜方面無明顯差異，對氨芐西林的耐藥率較高，對頭孢唑林、阿米卡星、頭孢呋辛等氨基糖苷類抗生素中度耐藥，對其他大部分常用抗生素如美羅培南、四環素、左氧氟沙星等比較敏感，其中未發現多耐藥菌株22.    &#

12、160;    2.1固有耐藥      固有耐藥指細菌對某些抗生素的天然不敏感，主要由染色體基因介導，一般比較穩定。固有耐藥的產生主要包括兩個方面，一是細菌缺乏對特定抗生素的易感靶位；二是細胞膜結構不同，導致副溶血弧菌能天然抑制萬古霉素等糖肽類抗生素進入細胞23.      2.2 獲得耐藥      獲得耐藥是細菌耐藥性產生和擴散的主要原因。獲得耐藥指細菌在抗生素作用下產生了自身突變，耐藥基因通過接合、轉導、轉換等方式水平轉移，使細菌捕獲或缺

13、失某些遺傳信息從而產生耐藥性。耐藥基因的轉移和傳播主要由質粒、轉座子、整合子等可移動遺傳元件介導24-25.      副溶血弧菌獲得耐藥產生的生化機制主要概括為以下幾方面：通過增加藥物排出或減少藥物滲入，減少抗生素到達靶細胞；通過基因突變或修飾，改變與抗生素結合的靶位，使抗生素不能發揮作用；通過產生耐藥酶，水解、轉移或滅活抗生素23.      2.2.1 減少抗生素到達靶細胞      2.2.1.1 細胞膜的通透性      細菌

14、的細胞膜是阻礙抗生素進入細胞的天然屏障。革蘭陰性菌的肽聚糖結構通透性較差，因此副溶血弧菌等革蘭陰性菌對萬古霉素等抗生素天然不敏感。      2.2.1.2 外排泵作用      外排泵是一類膜轉運蛋白，能將抗生素等物質有選擇性地或無選擇性地排出到細胞外。主要的藥物外排泵系統包括四類：主要協助蛋白轉運超家族（MFS）、小多耐藥蛋白超家族（SMR）、耐藥結節分化超家族（RND）、 ATP結合盒超家族（ABC）26.所有細菌都攜帶編碼多藥外排泵的基因23,有的位于質粒上，可以在細菌之間轉移。多藥外排泵在細菌多重耐藥性方

15、面發揮了重要作用，是細菌產生多重耐藥性的主要機制27.      從現有的基因組序列獲得的數據估計，副溶血弧菌中含有約50種多藥外排泵，其中最主要的是NorM蛋白，這是一種諾氟沙星外排蛋白，含有許多疏水殘基和12個跨膜區域28,屬于多藥和毒性化合物外排轉運蛋白家族（Multi Antimicrobial Extrusion,MATE）這一新型家族成員，MATE家族可以保護細菌不與藥物及其它毒物結合。研究發現，副溶血弧菌的NorM蛋白是一種Na+驅動的反向轉運的多藥外排泵，該蛋白跨膜區域上的酸性氨基酸殘基Asp32、Glu251和Asp367參與藥物外排的

16、過程，介導了副溶血弧菌對諾氟沙星和卡那霉素的耐藥29 .      2.2.1.3 生物膜系統      生物膜是細菌附著在固體表面生長，并形成由菌體及其分泌的基質包裹在一起的膜狀復合物。生物膜形成后，細菌對環境的適應性、耐藥性及抵抗宿主免疫細胞的吞噬作用明顯增強。細菌生物膜耐藥機制并未完全闡明。大部分觀點認為：一方面，細菌形成的生物膜可以構成一個外部屏障，限制或減緩抗生素的滲入30;另一方面，細菌在生物膜狀態下，類整合酶基因表達上調31,突變率提高，這種相互接觸更為緊密的環境導致菌體間質粒的接合、轉導等頻率也隨之

17、增高，這為菌體間耐藥基因的擴散提供了有利條件。      致病性副溶血弧菌能形成生物膜，從而與載體進行特異性的結合。生物膜的形成與菌濃度、溫度、NaCl濃度、pH值等因素密切相關，Ca2+能促進副溶血弧菌形成生物膜。有研究發現，耐藥較高的弧菌形成生物膜的能力也相對較強32,但關于副溶血弧菌生物膜與耐藥性之間的關系還有待進一步研究。      2.2.2 靶位基因突變      細菌與抗生素結合的靶位基因突變，導致抗生素不能產生作用，這是細菌產生耐藥性的重要原因。目前對該機制研

18、究最多的是喹諾酮類藥物的靶位基因突變。細菌對喹諾酮類藥物的耐藥主要是由于編碼DNA旋轉酶或拓撲異構酶的基因突變所致33.DNA旋轉酶由GyrA和GyrB亞基組成，分別由gyrA和gyrB基因編碼，拓撲異構酶由ParC和ParE亞基組成，分別由parC和parE基因編碼。細菌對喹諾酮類藥物的耐藥主要與gyrA和parC基因突變有關34 .大部分喹諾酮類耐藥突變發生于gyrA基因序列上67-106位氨基酸殘基之間，稱為喹諾酮耐藥決定區（Quinolone Resistance-Determining Region,QRDR）35.      研究表明，大部分

19、對環丙沙星等喹諾酮類藥物耐藥的副溶血弧菌，其gyrA基因83位氨基酸由絲氨酸突變為異亮氨酸；對于耐藥水平高的菌株，其parC基因也會發生點突變，第85位氨基酸由絲氨酸突變為苯丙氨酸36.      2.2.3 耐藥酶      細菌可以通過產生鈍化酶或滅活酶來破壞或滅活抗生素的活性。細菌產生的耐藥酶主要有-內酰胺酶、氨基糖苷類鈍化酶、氯霉素乙酰轉移酶和大環內酯類-林克霉素類-鏈陽菌素類鈍化酶。      現有研究發現，副溶血弧菌對？內酰胺類（氨芐西林、頭孢菌素）、氨基糖苷類（

20、卡那霉素）及氯霉素類（氯霉素）抗生素的耐藥主要通過-內酰胺酶、氨基糖苷磷酸轉移酶及氯霉素乙酰轉移酶等耐藥酶類介導37.目前對副溶血弧菌該機制研究最多的是其產生的-內酰胺酶。-內酰胺酶能夠特異性地打開分子結構中的-內酰胺環，使-內酰胺類抗生素失去抗菌活性。研究表明，在副溶血弧菌中存在組氨酸激酶/應答調節蛋白-VbrK/VbrR,可以控制-內酰胺酶的表達，介導副溶血弧菌對-內酰胺類抗生素的耐藥38.Ruichao Li等16發現攜帶有編碼-內酰胺酶基因（blaTEM-1、blaPER-1、blaCMY-2、blaVEB-2等）的可結合質粒介導了副溶血弧菌對廣譜頭孢菌素的耐藥。  

21、0;      3.1耐藥表型檢測      細菌耐藥表型檢測的常規方法為藥敏試驗，藥敏試驗的方法主要包括紙片擴散法、肉湯稀釋法、濃度梯度法和自動化檢測系統39.藥敏結果的判定是依據美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）弧菌屬的標準M4540.紙片擴散法不需要特殊的儀器，具有抗生素選擇靈活、成本較低等優點，是副溶血弧菌藥敏試驗中最常采用的一種方法，由于副溶血弧菌是嗜鹽菌，因此進行藥敏試驗的比濁液中應添加適量的NaCl,一般為0.

22、85%.肉湯稀釋法能夠獲得最小抑菌濃度（Minimal Inhibition Concentration,MIC），商品化的藥敏板具有操作方便、可重復性強的優點。濃度梯度法是通過抗生素在瓊脂板上擴散成濃度梯度來定量測量抗生素敏感性，商品化的方法為E-test法，操作方便，可作為副溶血弧菌耐藥模糊結果的確認。臨床常用于檢測副溶血弧菌的自動化儀器系統主要為Vitek系統和BD Phoenix系統，可以全自動地對耐藥結果進行定性和定量的分析，具有簡便、快速的優點。      3.2 耐藥基因檢測      在藥敏試驗的基礎上，如果能知道細菌是否攜帶有耐藥基因，能更好地預測藥物治療的效果，解釋耐藥機制。常用的細菌耐藥基因檢測的方法包括PCR法、DNA探針法、基因芯片技術、飛行時間質譜技術（MALDI-TOF MS）、全基因組測序等41.這些檢測方法具有快速、簡便、靈敏度和特異度高等特點，同時可以結合基因克隆和測序來分析耐藥基因的結構及突變情況。