1、第九章第九章 酶免疫技術酶免疫技術第一節酶免疫技術的特點第一節酶免疫技術的特點一、酶和酶作用底物一、酶和酶作用底物二、酶標記抗體或抗原二、酶標記抗體或抗原三、固相載體三、固相載體第二節酶免疫技術的分類第二節酶免疫技術的分類一、均相酶免疫測定一、均相酶免疫測定二、非均相酶免疫測定二、非均相酶免疫測定第三節酶聯免疫吸附試驗第三節酶聯免疫吸附試驗一、基本原理一、基本原理二、方法類型及反應原理二、方法類型及反應原理思考題思考題小結小結放射免疫技術放射免疫技術發光免疫技術發光免疫技術酶免疫技術酶免疫技術三大經典標記技術三大經典標記技術三大經典標記技術第一節第一節 酶免疫技術的特點酶免疫技術的特點 主要試

2、劑主要試劑: : 酶標記的抗體或抗原酶標記的抗體或抗原 酶標物特點：酶標物特點： 免疫學活性免疫學活性 酶對底物的催化活性酶對底物的催化活性抗原抗體反應的特異性抗原抗體反應的特異性+酶高效催化反應的專一性酶高效催化反應的專一性原理及特點原理及特點特點：特點：靈敏度高、特異性強、靈敏度高、特異性強、準確性好準確性好酶標記試劑能夠較長時酶標記試劑能夠較長時間保持穩定間保持穩定操作簡便、對環境沒有操作簡便、對環境沒有污染。污染。易與其它技術偶聯易與其它技術偶聯衍生出適用范圍更廣的衍生出適用范圍更廣的新方法新方法。原理：原理：酶標抗體（抗原）與抗原酶標抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應（抗體）的特

3、異性反應酶對底物的顯色反應酶對底物的顯色反應對抗原或抗體進行定位、對抗原或抗體進行定位、定性或定量的測定分析定性或定量的測定分析 原理及特點原理及特點標記酶的要求：標記酶的要求： 活性高活性高 性質穩定性質穩定 專一性強專一性強 酶催化底物的顯色信號易于判斷和測量酶催化底物的顯色信號易于判斷和測量 方法敏感，重復性好，簡單易行方法敏感，重復性好，簡單易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物價廉酶的底物易于配制保存，酶及底物價廉 一、酶和酶作用底物一、酶和酶作用底物辣根過氧化物酶（辣根過氧化物酶（HRPHRP） 糖蛋白（主酶）糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關主酶與酶

4、活性無關 輔基是酶的活性中心輔基是酶的活性中心RZRZ值：值：403nm 403nm （輔基）（輔基）與與275nm275nm（主酶）（主酶） ODOD值之比值之比 RZRZ值與酶活性無關，值與酶活性無關，酶活性單位比酶活性單位比RZRZ值值更為重要更為重要 ELISAELISA中應用最為廣中應用最為廣泛的標記用酶泛的標記用酶 常用酶常用酶酶和酶作用底物酶和酶作用底物堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（APAP） 菌源性菌源性AP AP 腸粘膜腸粘膜APAP 半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-Gal-Gal） 用于均相酶用于均相酶免疫測定免疫測定 常用酶常用酶酶和酶作用底物酶和酶作用底物HRPHRP的底物的底物

5、DHDH2 2+H+H2 2O O2 2 D+2H D+2H2 2O O HRPHRP供氫體供氫體DHDH2 2習慣上被稱為底物，底物有多種習慣上被稱為底物，底物有多種 H H2 2O O2 2為受氫體，為受氫體，HRPHRP對受氫體的專一性很高對受氫體的專一性很高 常用底物常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物HRPHRP的常見底物的常見底物 鄰苯二胺鄰苯二胺 OPDOPD四甲基聯苯胺四甲基聯苯胺 TMBTMB5-5-氨基水楊酸氨基水楊酸5-ASA 5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基- -二二(3-(3-乙基乙基- -苯并噻苯并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)銨鹽銨鹽 ABTSABTS常用底物

6、常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物OPDOPD反應后顯橙黃反應后顯橙黃色，加酸終止反色，加酸終止反應后呈棕黃色，應后呈棕黃色，測定波長測定波長492nm492nm。不穩定，致癌性。不穩定，致癌性。TMBTMB反應后顯藍色反應后顯藍色 ，加酸終止反應后變加酸終止反應后變為黃色為黃色, ,測定波長測定波長450nm 450nm ，穩定，無，穩定，無致癌性，致癌性，ELISAELISA中應中應用最廣泛的底物。用最廣泛的底物。 HRPHRP的常見底物的常見底物 酶和酶作用底物酶和酶作用底物APAP的的底物底物 -Gal-Gal的底物的底物 對對- -硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯（ pNPPpNPP ）4

7、-4-甲基傘酮基甲基傘酮基-D-D半半- -乳糖苷乳糖苷（ 4MUG 4MUG ）經經APAP作用后的產物為黃色對作用后的產物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為硝基酚，最大吸收峰波長為405 nm405 nm。 酶作用后，生成高強度酶作用后，生成高強度熒光物熒光物 ，用熒光計，用熒光計 測測量。量。常用底物常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物酶免疫技術的核心組成部分酶免疫技術的核心組成部分 酶結合物酶結合物（conjugateconjugate）酶標記物酶標記物 通過化學反應或免通過化學反應或免疫學反應，讓酶與疫學反應，讓酶與抗體或抗原形成的抗體或抗原形成的結合物結合物 二、酶標記抗體或抗原二、

8、酶標記抗體或抗原抗原要求純度高，抗原性完整抗原要求純度高，抗原性完整 抗體需要特異性好、效價高、親抗體需要特異性好、效價高、親合力強以及比活性較高，能批量生合力強以及比活性較高，能批量生產，易純化。產，易純化。 制備方法要求制備方法要求酶標記抗體或抗原酶標記抗體或抗原制備方法要求制備方法要求技術方法簡單、產率高，重復性技術方法簡單、產率高，重復性好好標記反應不影響酶和抗原或抗體標記反應不影響酶和抗原或抗體的活性的活性酶標記物穩定酶標記物穩定 ，不形成聚合物，不形成聚合物酶標記抗體或抗原酶標記抗體或抗原制備方法制備方法過碘酸鈉法（直接法）過碘酸鈉法（直接法）常用于常用于HRPHRP標記抗體或抗原

9、標記抗體或抗原 戊二醛交戊二醛交聯法聯法酶標記抗體或抗原酶標記抗體或抗原戊二醛交戊二醛交聯法聯法戊二醛分子中有兩個相同的醛基，可分別戊二醛分子中有兩個相同的醛基，可分別與與HRPHRP和蛋白質分子中的氨基結合。該法和蛋白質分子中的氨基結合。該法有一步法和二步法。二步法標記效率比一有一步法和二步法。二步法標記效率比一步法高，酶標記物質量較均一。步法高，酶標記物質量較均一。 酶標記抗體或抗原酶標記抗體或抗原純化及鑒定純化及鑒定標記完成后應除去反應液中的游離酶、標記完成后應除去反應液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特或抗原聚合

10、物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強度作用而降低特異性染色強度 常用的純化方法：常用的純化方法：葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G-200/G-150G-200/G-150過柱層析純化過柱層析純化50%50%飽和硫酸銨沉淀提純飽和硫酸銨沉淀提純酶標記抗體或抗原酶標記抗體或抗原固相抗體或抗原是非均相酶免技術中將固相抗體或抗原是非均相酶免技術中將游離和結合的酶標記物迅速分離的最常游離和結合的酶標記物迅速分離的最常用方法用方法 固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結合固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結合到固相載體的表面到固相載體的表面 三、固相載體

11、三、固相載體要求要求 結合抗體或抗原的容量大結合抗體或抗原的容量大 抗體或抗原牢固地固定在其表面抗體或抗原牢固地固定在其表面 不影響免疫反應性不影響免疫反應性 利于反應充分進行利于反應充分進行 固相方法簡便易行，快速經濟固相方法簡便易行，快速經濟種類種類塑料制品塑料制品 微顆粒微顆粒膜載體膜載體 固相載體固相載體將抗原或抗體結合于固相載體將抗原或抗體結合于固相載體用用1%1%5%5%的牛血清白蛋白或的牛血清白蛋白或5%5%20%20%小牛血小牛血清消除固相載體表面未結合的位點，消除非清消除固相載體表面未結合的位點，消除非特異性吸附特異性吸附包被包被coatingcoating封閉封閉block

12、ingblocking包被與封閉包被與封閉第二節酶免疫技術分類第二節酶免疫技術分類 酶酶免免疫疫技技術術酶免疫組化酶免疫組化酶免疫測定酶免疫測定均均 相相非均相非均相固相酶免疫測定固相酶免疫測定液相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片或其它標本中抗原的定位組織切片或其它標本中抗原的定位 液體標本中抗原或液體標本中抗原或抗體的定性和定量抗體的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定 酶標記物與相應的抗原或抗體結合后，酶標記物與相應的抗原或抗體結合后，標記酶的活性會發生改變，不用分離結合標記酶的活性會發生改變，不用分離結合和游離酶標記物，通過測定標記酶的活

13、性和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。的改變，而確定抗原或抗體的含量。原理原理一、均相酶免疫測定一、均相酶免疫測定最具代表性的兩種技術最具代表性的兩種技術酶放大免疫測定技術酶放大免疫測定技術EMITEMITenzyme-mutiplied immunoassay technique克隆酶供體免疫分析克隆酶供體免疫分析 CEDIACEDIAcloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫測定均相酶免疫測定EMITEMIT示意圖示意圖CEDIACEDIA示意圖示意圖分類：分類：液相酶免疫測定液相酶免疫測定 固相酶免疫測定固相酶免疫測定 以聚

14、苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯免疫吸以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯免疫吸附試驗（附試驗（ELISAELISA） 是目前最為常用的固相酶免是目前最為常用的固相酶免疫測定疫測定與均相不同與均相不同之處之處需分離游離與結合的酶標記物需分離游離與結合的酶標記物二、非均相酶免疫測定二、非均相酶免疫測定第三節酶聯免疫吸附試驗第三節酶聯免疫吸附試驗 底物顯色底物顯色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反應反應加入待測抗體或加入待測抗體或抗原和酶標抗原抗原和酶標抗原或抗體或抗體洗滌洗滌使結合在固相上使結合在固相上的抗原抗體復合物的抗原抗體復合物與未結合的分離與未結合的分離1234一、基本原理一

15、、基本原理固相的抗原或抗體固相的抗原或抗體 酶標記物（酶結合物酶標記物（酶結合物） 酶反應的底物酶反應的底物 三個必要試劑三個必要試劑 二、方法類型及反應原理二、方法類型及反應原理雙抗體夾心法雙抗體夾心法方法：方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標抗體，加底物顯色標抗體，加底物顯色應用：應用： 二價或二價以上的較大分子抗原測定二價或二價以上的較大分子抗原測定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCGHCG等等ELISAELISA檢測抗原的方法檢測抗原的方法雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原+ +- -E EE EE EE EE

16、EE EE EE EE E競爭法競爭法 方法：方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標抗用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標抗原，酶標抗原與待檢物競爭與包被物結合。加底物顯色原，酶標抗原與待檢物競爭與包被物結合。加底物顯色。 應用：應用：用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）物、激素等）ELISAELISA檢測抗原的方法檢測抗原的方法競爭法測抗原競爭法測抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE E2 2、加待檢物、加待檢物抗原與酶標抗抗原與酶標抗原競爭與抗體原競爭與抗體結合結合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不顯色的底物

17、不顯色或顯色弱或顯色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物顯色的底物顯色1 1、已知抗體包、已知抗體包被于載體表面被于載體表面1 1、已知抗體包、已知抗體包被于載體表面被于載體表面2 2、加待測物、加待測物和酶標抗原，和酶標抗原，酶標抗原與抗酶標抗原與抗體結合體結合E E間接法間接法方法方法 用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗人用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗人IgGIgG（抗（抗抗體或二抗）加底物顯色。抗體或二抗）加底物顯色。優點優點 一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體應用應用 常用于常用于HCVHCV抗體、抗體、HIVHIV抗體和梅毒

18、螺旋體抗體等的測定抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定ELISAELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法間接法測抗體間接法測抗體- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E雙抗原夾心法雙抗原夾心法原理：原理：類似雙抗體夾心法類似雙抗體夾心法操作步驟操作步驟：類似類似 應用：應用：乙型肝炎表面抗體乙型肝炎表面抗體ELISAELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法競爭法競爭法原理：原理：類似檢測抗原的競爭法類似檢測抗原的競爭法 應用應用：乙型肝炎病毒核心抗體乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb(HBcAb) )和和乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒e e抗體抗體(HBeAb(HBeAb) )的檢測的檢測 E

19、LISAELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法捕獲法捕獲法 應用：應用： 病原體急性感染診斷中的病原體急性感染診斷中的IgMIgM型抗體型抗體 甲型肝炎甲型肝炎HAV-IgMHAV-IgM抗體抗體 乙型肝炎病毒核心乙型肝炎病毒核心HBc-IgMHBc-IgM抗體抗體ELISAELISA檢測抗體的方法檢測抗體的方法捕獲法捕獲法 原理：原理：抗人抗人IgMIgM鏈抗體包被鏈抗體包被捕獲待測標本中捕獲待測標本中IgMIgM類抗體類抗體加入特異性抗原和酶標記特加入特異性抗原和酶標記特異性抗原的抗體異性抗原的抗體 底物顯色底物顯色 捕獲法原理捕獲法原理+ +- -E EE EE EE EE E 1 1、

20、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待測物、加待測物特異性特異性IgMIgM與與非特異性非特異性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM結合結合3 3、加特異性、加特異性抗原，與特異抗原，與特異性抗體結合性抗體結合4 4、加酶標抗體、加酶標抗體與特異性抗原結與特異性抗原結合，加底物顯色合，加底物顯色2 2、加待測物、加待測物只有非特異性只有非特異性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM結合結合3 3、加特異性抗、加特異性抗原，不能與非原，不能與非特異性特異性IgMIgM結合結合4 4、加酶標抗體、加酶標抗體無抗原結合，無抗原結合，加底物不顯色加底物不

21、顯色第第四四節節 酶免疫測定的應用酶免疫測定的應用均相酶免疫測定主要用于藥物和小分均相酶免疫測定主要用于藥物和小分子物質的檢測。非均相免疫測定中的子物質的檢測。非均相免疫測定中的ELISAELISA應用更為廣泛，應用更為廣泛，ELISAELISA廣泛用于廣泛用于傳染病的診斷，病毒如病毒性肝炎傳染病的診斷，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗體、（甲肝抗體、“乙肝三對乙肝三對”、丙肝抗、丙肝抗體、丁肝抗體、戊肝抗體）、風疹病體、丁肝抗體、戊肝抗體）、風疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細菌如毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細菌如結核桿菌、幽門螺桿菌等。也用于一結核桿菌、幽門螺桿菌等。也用于一些蛋白質檢測，如各種免疫球蛋白、些蛋白質檢測，如各種免疫球蛋白、補體、腫瘤標志物（甲胎蛋白、癌胚補體、腫瘤標志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原等）。抗原、前列腺特異性抗原等）。1 1酶免疫技術的要點？酶免疫技術的要點？2 2酶聯免疫吸附試驗的原理（酶聯免疫吸附試驗的原理（ELISAELISA）？）？3 3競爭法在酶聯免疫檢測應用中的原理和應用？競爭法在酶聯免疫檢測應用中的原理和應用？4 4常用的底物有哪幾類？特點？常用的底物有哪幾類？特點？5 5常用的酶有哪幾類？特點？常用的酶有哪