1、TLC（薄層層析色譜）技術原理與應用一、薄層層析（TLC）簡介薄層層析是將吸附劑或者支持劑（有時加入固化劑）均勻地鋪在一塊玻璃上，形成薄層。把欲分離的樣品點在薄層上，然后用適宜的溶劑展開，使混合物得以分離的方法。由于層析在薄層上進行故而得名。薄層層析是一種微量、快速的層析方法。它不僅可以用于純物質的鑒定，也可用于混合物的分離、提純及含量的測定。還可以通過薄層層析來摸索和確定柱層析時的洗脫條件。根據分離的原理不同，薄層層析可以分為兩類：用吸附劑鋪成的薄層所進行的層析為吸附薄層層析，吸附薄層中常用的吸附劑為氧化鋁和硅膠；用纖維素粉、硅膠、硅藻土為支持劑鋪成的薄層，屬于分配薄層層析。 吸附TLC固定

2、相為吸附劑氧化鋁、硅膠。（較多用）TLC 分配TLC固定相為液態（通常為水）固定相吸附在支持劑上。（一）吸附薄層的基本原理：吸附薄層主要是利用吸附劑對樣品中各成分吸附能力不同，及展開劑對它們的解吸附能力的不同，使各成分達到分離。吸附作用主要由于物體表面作用力、氫鍵、絡合、靜電引力、范德華力等產生。吸附強度決定于吸附劑的吸附能力，還受被吸附成分的性質影響，更與展開劑的性質有關。1.吸附薄層層析：在硅膠薄層板上，樣品中的兩成分是兩種結構近似的染料，在展開劑四氯化碳的作用下。在展開劑和薄層板之間不斷地產生吸附、解吸，再吸附，再解吸，。由于對氨基偶氮苯的極性比偶氮苯的極性稍強一些，層析的結果，對氨基偶

3、氮苯受到的吸附作用稍強于偶氮苯，從而將兩者分離。展開結束以后，會在薄層板上形成兩個斑點，混合物中的成分得以分離。中藥中的有效成分復雜多樣，結構近似者不少。特別是對未知結構的成分分析，設計并摸索出合理的層析條件是首要任務。只有先設計出可用的層析條件，再經摸索改進，才可能對未知或者已知成分進行成功地分離。然后才能談得上進一步的分析研究。要設計出合理有效的層析條件，必須熟悉薄層層析條件的選擇的基本要領。下面對薄層層析條件的選擇做一初步介紹。薄層層析的三項基本構成物質是：樣品組分、吸附劑、展開劑。摸索層析條件，實際上是協調上述三者的關系，尋求一種能夠有效分離樣品組分的配合方案及實際操作要領。很明顯，一

4、切層析都是針對分析任務，也就是圍繞待分離的樣品組分來進行調整適應的。可見，層析條件的選擇是以樣品中的各組分為中心，適當調適展開劑的吸附劑的極性來實現的。（二）薄層層析條件的選擇： 1.概述：吸附劑的選擇：薄層層析用的吸附劑與其選擇原則和柱層析相同。主要區別在于薄層層析要求吸附劑（支持劑）的粒度更細，一般應小于250目，并要求粒度均勻。用于薄層層析的吸附劑或預制薄層一般活度不宜過高，以級為宜。而展開距離則隨薄層的粒度粗細而定，薄層粒度越細，展開距離相應縮短，一般不超過10厘米，否則可引起色譜擴散影響分離效果。展開劑的選擇：薄層層析，當吸附劑活度為一定值時（如或級），對多組分的樣品能否獲得滿意的分

5、離，決定于展開劑的選擇。中草藥化學成分在脂溶性成分中，大致可按其極性不同而分為無極性、弱極性、中極性與強極性。基本思路是根據待分離樣品組分的極性來確定吸附劑的極性（類型、活化度）和展開劑的極性（主要溶劑、調節溶劑、輔助溶劑等）。要協調、處理好吸附劑、展開劑、及被分離成分三者之間的關系，才能得到理想的薄層層析結果。2.吸附劑：對吸附劑的基本要求是顆粒細致(薄層層析用的吸附劑與其選擇原則和柱層析相同。主要區別在于薄層層析要求吸附劑/支持劑的粒度更細，一般應小于250目，并要求粒度均勻)、大小均勻（亦即有較大的表面積和適當的吸附活性）；不能與樣品組分、樣品溶劑、展開劑發生化學反應；更不能與溶劑及展開

6、劑發生溶解。（注：實際操作中，可通過選擇不同的活化溫度對吸附劑活性進行調節）。用于薄層層析的吸附劑或預制薄層一般活度不宜過高，以級為宜。而展開距離則隨薄層的粒度粗細而定，薄層粒度越細，展開距離相應縮短，一般不超過10厘米，否則可引起色譜擴散影響分離效果。最常用的吸附劑是和。另外，市場上還有氧化鎂、硅酸鎂、碳酸鎂、硅藻土、活性炭等。其中，只有活性炭是非極性吸附劑，其余均是極性吸附劑。它們對水和極性大的化合物吸附能力強。（1） 氧化鋁：化學式為Al2O3，國產層析用氧化鋁有堿性、中性、酸性三種，以中性氧化鋁應用較廣。氧化鋁的特點：A: 氧化鋁為吸附力較強的極性吸附劑，它適用于中性或者堿性的親脂性化

7、合物的分離。通常氧化鋁的吸附能力與其自身的含水量有關。含水越多，吸附活性越小，吸附能力越小。氧化鋁根據其含水量多少將其活性劃分為五級。 B: 氧化鋁的吸附能力與其自身的含水量有關（2） 硅膠：表達式為SiO2?XH2O。層析用硅膠是一種多孔性物質，它的硅氧環交鏈結構表面上密布極性硅醇基（SiOH），這種極性的硅醇基能和許多化合物形成氫鍵而產生吸附。特點：A：硅膠的吸附能力比氧化鋁稍弱，其吸附活性也與含水量呈負性相關。如對有機酸、揮發油、萜類、皂苷、黃酮、蒽醌、氨基酸等成分的分離適用，不能用于生物堿等堿性物質的分離。B：硅醇基顯較弱的酸性，因而，硅膠只能用于中性、或酸性成分的分離，堿性成分不能用

8、它分離。由于結構的決定作用，氧化鋁的活化溫度可以很高（150160），而硅膠的活化溫度卻不能太高（105110）。一旦超過500，硅醇基會相互脫水而失活。C：硅膠的活化溫度通常為105110，不能過高。 根據樣品的酸堿性和極性大小確定了吸附劑以后，正確選擇展開劑也是保證層析較好的分離的重要條件。3. 展開劑：展開劑：薄層層析中用來將樣品展開的溶劑。展開：用極性適當的溶劑浸潤已經點了樣品的薄層板一端，憑借毛細作用帶動樣品在薄層板上移動，最終使樣品分離的操作過程。展開劑常是由兩種或者兩種以上的溶劑銨一定的比例組成的溶劑系統。簡稱溶劑系統或展開所用的溶劑。“展開劑”“溶劑系統”“溶劑”；“展開”“展

9、開過程”4. 被分離成分：被分離成分：分析任務所要完成分離的樣品中的有效成分。被分離成分的極性決定于其母核結構類型及官能團極性。如果吸附劑活性和展開劑活性固定不變的條件下，被分離成分的極性越大，吸附劑對其作用越強，展開距離越短；被分離成分極性越弱，吸附劑對其作用越大，展開距離越大。一些基團的極性相對大小順序已經在課本P31列出。當然，具體物質的極性大小判斷時，還要結合分子結構的具體情況進行判斷。總之，選擇層析條件時，必須針樣品中對被分離成分的極性，試行判斷或確定吸附劑種類和活性，再探索配制展開劑。在選擇層析條件時，必須根據樣品、展開劑、被分離物質三方面縮合考慮。歷史上吸附層析出現最早，是由俄國

10、生物學家茨維特用碳酸鈣作為固定相，石油醚作為流動相來分離植物色素的。除了吸附層析之外，另一經典的層析法是以液體作為固定相的液相層析。液體固定相（多為水）被吸附在固態載體物質上，這些載體物質多是一種多孔性物質。這些液態固定相被載體固定在柱中，就成為液液分配柱層析。（三）分配薄層層析：用極性溶劑吸苷在固體支持劑上所形成的混合物，鋪成薄層（或裝柱），然后活化、點樣（或上樣），再用極性較弱的展開劑（或洗脫劑）進行展開。分配層析的一般原理：在展開過程中，各成分在固定相和流動相之間作連續不斷的分配，由于各成分在兩相間的分配系數不同，因而可以達到相互分離的目的。以CS表示某成分在固定相中的濃度，Cm表示某成

11、分在固定相中的濃度。則分配系數：KCS/Cm載體應該具備的基本條件：中性、多孔粉末、無吸附活性、在洗脫劑之中不溶解；所能夠吸收固定相的量，最好能達載體本身重量的50%以上；能使流動相自由的通過載體所吸收的固定相，并且不改變溶劑系統的組成。能夠滿足這些條件的載體是硅膠、硅藻土、纖維素粉等。分配層析所用的固定相一般為水及各種水溶液（酸、堿、鹽與緩沖液）、甲酰胺、低級醇（親水性）等。分配層析所用的流動相選用與水不溶（或微溶）的有機溶劑。如石油醚、苯、鹵代烷類、脂類、酮類（如丁酮）、醇類（丁醇、戊醇）等或者它們的混合物。分配層析對混合物中各成分的分離，主要決定于各成分分配系數的差異，一般說來，對于種類

12、成分均能適用，特別能適用于水溶性、親水性物質而又稍能溶于有機溶劑中者。這樣就恰好彌補了一般吸附層析（如氧化鋁吸附層析適用于親脂性物質）的不足。但是，由于分配柱層析樣品處理量較少，因此，如能用吸附柱層析解決問題時，常優先使用氧化鋁或硅膠吸附柱層析。一般分配層析的條件可以由PC來摸索，再應用于分配柱層析。（四） 薄層的制備：1基板的規格和構成：5×15、5×20、10×10、20×20大小的玻璃板或者不銹鋼板、塑料板。2薄層板的分類：軟板（制板時不加粘合劑）、硬板（制板時加入粘合劑）。3軟板的制備：詳見P32。4硬板的制備：詳細演示、介紹手工鋪板，了解薄層涂

13、鋪器的使用方法。（五） 薄層層析的操作步驟：1點樣：A: 樣品的溶解：將樣品溶于展開劑極性相近、揮發性高的有機溶劑。B: 薄層點樣：用毛細管（0.5mm以下）或用專業點樣器進行點樣。點樣的要求：樣點位置應在距離底邊1-1.5cm處；點樣量適當；樣點直徑小于2-3mm；間隔反復點樣；多個樣點時，間隔為2cm且處于同一條直線上。經驗做法：可先在PC或TLC點上不同量的樣品，并展開、顯色后觀察分離情況，以此確定最佳樣品用量。2展開：當樣點上的溶劑充分揮干后，將薄層放置在密閉容器中，使適當的展開劑從薄層的一端向另一端進行浸潤展開的過程。要求：密閉容器可選用層析缸、標本缸、標本筒等；展開方式有上行法、下

14、行法之分，展開方向有單向、雙向、多次展開等。詳見P33。注意事項：先懸空飽和、再入液展開；樣點不能泡在展開劑中；薄層浸入時不能歪斜進入。3顯色：用適當的方法或者適當的顯色劑處理薄層，使其上可能已經分離的各成分斑點顯示出來，以方便計算各個斑點的比移值，從而提供定性與定量的依據。顯色的基本步驟是：一看、二照、三碘、四顯，熒光背景也常見。詳見P34。4比移值的計算與定性、定量：展開結束后，經過各種顯色操作后，樣品中各個成分的斑點可能出現了不同程度的分離，為了表達各成分的相對位置（極性）通常以比移值作為稱量斑點位置的指標。比移值的符號為Rf：Rf(斑點中心與原始樣點之間的距離)/(溶劑前沿與原始樣點之

15、間的距離)注意事項：薄層層析的Rf 值受多種因素影響，即使嚴格按照實驗要求做了，結果的重現性仍較差。因此，薄層定性時常與標準品一起點樣進行對比分析。二、展開劑的選擇與常見溶劑的極性（一）展開劑的選擇：在吸附薄層中，化合物在吸附薄層上移動的速度與展開劑的極性有關。展開劑的極性越大，化合物移動的速度越快，展開劑的極性越小，化合物的移動速度慢。薄層層析要得到較好的展開效果，必須依據所要分離的樣品來正確選擇層析條件，對樣品的極性進行認真研究，以確定及實驗摸索適宜的吸附劑、展開劑。當吸附劑活度為一定值時（如或級），對多組分的樣品能否獲得滿意的分離，決定于展開劑的選擇。中草藥化學成分在脂溶性成分中，大致可

16、按其極性不同而分為無極性、弱極性、中極性與強極性。但在實際工作中，經常需要利用溶劑的極性大小，對展開劑的極性予以調整。通常先用單一溶劑展開，根據被分離物質在薄層上的分離效果，進一步考慮改變展開劑的極性。Rf值最佳范圍在0.30.5范圍；可用范圍在0.20.9。如果Rf較大可適量加入極性較小的溶劑，以降低展開劑極性。反之，加入極性大的溶劑。（二）展開劑的極性常用展開劑的極性次序可用溶劑的溶劑強度參數0來衡量。溶劑的0越大，極性越強，洗脫能力越強。反之越若。常用溶劑的極性如下：溶劑 沸點 溶劑強度參數0 溶劑強度參數P 選擇性組別異辛烷 99 0.01 0.1正已烷 69 0.01 0.1叔丁基甲

17、醚 56 0.35 2.5 1苯 81 0.32 2.7 7乙醚 2.8 1二氯甲烷 40 0.42 3.1 5正丙醇 97 0.82 4.0 2四氫呋喃 66 0.82 4.0 3乙酸乙酯 77 0.58 4.4 6a氯仿 61 0.40 4.1 8二氧六環 101 0.56 4.8 6a丙酮 0.66 5.1 6a乙醇 0.88 4.3 2醋酸 大 6.0 4乙氰 0.65 5.8 6b甲醇 0.95 5.1 2水 很大 10.2 8Snyder根據溶劑的極性p分成選擇性不同的八組，因此若某一溶劑作展開劑分離效果不好。則選擇同組的另一種溶劑作展開劑就不會對色譜分離有明顯的改變，而選擇溶劑強

18、度相同而選擇性不同的組中的另一種溶劑可能改變色譜分離情況。文獻來源何華，倪坤儀主編，自現代色譜分析，化工版2004.2第一版。 三）應用實例1、藥物及天然產物中的應用根據本人的幾年薄層層析經驗，參考藥典等國家藥品標準和有關文獻，將2000版藥典一部里部分有代表性的對照品的薄層層實例按展開劑極性排序，并對其規律做一些分析。以下的分析和介紹是總體描述性的，目的是快速、簡便地選擇展開劑。如果想了解展開劑選擇的各種理論，請參考其他專著。選擇展開劑，要依據溶劑極性和他們的混溶性，溶劑對被分析物的溶解性，以及被分析物的結構。這里只討論藥典里通常使用的以硅膠為固定相主體的正相薄層，也不考慮板的活性。列出溶劑

19、極性參數表，方便以下比較展開劑。環已烷:-0.2、石油醚（類，3060）、石油醚（類，6090）、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、異丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氫呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈:5.8、乙酸:6.0、水:10.2于溶劑混溶性，一般根據相似相溶原則，需要注意，極性相差大的不混溶，比如正己烷與甲醇。多元展開劑，主體的兩種溶劑不能混溶，就需要通過第三種溶劑來調和。比如：石油醚、正庚烷、正已烷、戊烷、環已烷和甲醇、水之類的。 一般正相色譜，固定相為極性，被分析物質的極性越大，需

20、要極性更大的展開劑。了解被分析物的極性可以通過分析其結構獲得，很難獲得它的極性指數。物質分子化學結構中，通常由較極性部分和非極性部分兩部分。例如下面以苯丙烷為極性小部分，隨著極性基團部分的增加，總體的極性就增加，展開劑極性也增加了。依次為肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、綠原酸。相應展開劑分別為：正己烷乙醚冰醋酸 (5:5:0.1)、苯冰醋酸甲醇(30:1:3)、氯仿甲醇甲酸（9:1: 0.5）、石油醚乙酸乙酯甲酸（3:6: 1）、醋酸丁酯甲酸水(7:2.5:2.5)。（由于薄層板、比移值不同的原因，展開劑極性比較是相對的，并非絕對的后者大于前者）。現在最重要的問題是，不同化合物，怎么定它的極性

21、，又用什么標準來定它對應的展開劑呢？以下分開討論不同化合物極性情況及其對應的展開劑。（1） 極性較小的揮發性物質。比如：冰片：石油醚 (3060)醋酸乙酯(17:3)、厚樸酚：苯醋酸乙酯(9:1.5)、-香附酮：苯醋酯乙酯冰醋酸(92:5:5)、丹皮酚：環己烷醋酸乙酯(3:1)，這類化合物，以石油醚、正構烷和苯為體積百分數比較大的溶劑，通常起溶解和分離化合物的作用，而用醋酸乙酯為調節Rf（比移值）的溶劑。為了減少拖尾之類其他相似相溶原則以外的影響，適當加入添加劑，如有機酸或者有機堿。（2）極性較小的不揮發性物質。比如： -谷甾醇：環己烷醋酸乙酯甲醇(6:2.5:1)或者環己烷丙酮(5:2) 、

22、熊果酸：甲苯醋酸乙酯冰醋酸(12:4:0.5)、齊墩果酸：氯仿甲醇(40:1)、豬去氧膽酸：氯仿乙醚冰醋酸(2:2:1)、大黃素：苯醋酸乙酯甲醇(15:2:0.2)或者苯乙醇 (8:1)、丹參酮A：苯-醋酸乙酯-甲酸(40:25:4) 、穿心蓮內酯：氯仿-無水乙醇(9:1)、靛玉紅、靛藍氯仿乙醇(9:1)或者苯氯仿丙酮(5:4:1)。這類物質展開劑極性比極性較小的揮發性物質洗脫力強一些，因為這類物質極性小的母核大，而極性大的基團通常可以形成氫鍵，比如羧酸、羥基。以上物質，母核分子量減小、母核結構中不飽和健的增加（尤其是出現苯環），極性基團的增加，都使極性增加，展開劑極性也增大。這個范圍內的物質

23、很多，一般展開劑大百分數的溶劑可以從環己烷甲苯二甲苯苯氯仿的順序，按照極性要求選擇。這里注意，異丙醇、正丁醇極性指數也比較小，在這范圍的化合物很少用，因為粘性大、展開慢，造成斑點擴散；另外，羥基的氫鍵作用力也有不利。調節Rf值的溶劑，從醋酸乙酯甲醇丙酮乙醇。揮發性物質也有很多帶羰基、羥基的，但從它的揮發性就可以明白，分子間作用力不強，另外，母核與石油醚、正構烷和苯的結構差異小，估計更容易脫離硅膠吸附，更快進入溶劑中，而不需要通過提高展開劑的極性。（3）皂苷類。人參皂苷：氯仿甲醇水 (65:35:10)10以下放置的下層溶液或正丁醇醋酸乙酯水(4:1:5)的上層溶液或氯仿醋酸乙酯甲醇水(15:4

24、0:22:10)10以下放置的下層溶液、芍藥苷：氯仿醋酸乙酯甲醇甲酸(40:5:10:0.2)、黃芩苷：醋酸乙酯丁酮醋酸水(10:7:5:3)、橙皮苷：苯醋酸乙酯甲酸水(1:12:2.5:3)的上層溶液、葛根素：氯仿甲醇水(14:5:0.5)、蘆丁：醋酸乙酯甲酸水(8:1:1)。這類物質，由于存在糖的多羥基結構，苷元的結構影響變小。展開劑中使用極性大的有機溶劑（氯仿、醋酸乙酯、甲醇、正丁醇）和水。乙酸和甲酸的使用，一方面增大展開劑極性，另外也可以抑制硅膠羥基的作用，減少拖尾。由于混溶性和硅膠耐酸能力的限制，水和酸的使用是有限度的。（4）極性大的小分子有機酸。沒食子酸：氯仿醋酸乙酯甲酸 (5:4

25、:1)、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、綠原酸、異綠原酸。這類物質多數是苯乙烯母核的，這個結構的極性本身比較大，另外有酚羥基和羧酸基團，個別有多羥基配基。皂苷的展開劑差不多，極性大。注意甲酸通常指的是濃度85%左右的，含有水。（5）含氮有機物。鹽酸小檗堿：苯醋酸乙酯甲醇異丙醇濃氨試液(12：6：3：3：0.6)(氨蒸氣飽和) 或正丁醇冰醋酸-水(7:1:2)、麻黃堿：氯仿甲醇濃氨試液(20:5:0.5)或正丁醇冰醋酸水(8:2:1)、甘草酸銨：醋酸乙酯甲酸冰醋酸水(15:1:1:2)。由于NH2硅醇基的作用很強，在強極性展開劑加有機酸、有機堿掃尾。對于極性化合物，使用正丁醇對斑點擴散影響較小，因為化合

26、物和硅膠的作用強。進行薄層分析基本可以根據母核、基團，選擇相似的化合物對號入座。當然，具體的條件優化則需要根據實際情況了。遇到較困難的分離，需要使用到設計優化方法的，已經不屬于本文討論范圍了。2、有機合成中展開劑的選擇做有機合成時走板子是常有的事，展開劑的選擇就至關重要了,選擇適當的展開劑是首要任務.一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概為：石油迷<己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用單一溶劑，往往不能達到很好的分離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個高極性和低級性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區分度的作用，常用的溶

27、劑組合有：Petroleumether/Ethylacetate, petroleumether/Acetone, Petroleumether/Ether, Petroleumether/CH2Cl2, ethylacetate/MeOH, CHCl3/ethylacetate展開劑的比例要靠嘗試.一般根據文獻中報道的該類化合物用什么樣的展開劑，就首先嘗試使用該類展開劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個分離效果好的展開劑。展開劑的選擇條件：對的所需成分有良好的溶解性；可使成分間分開；待測組分的Rf在0.20.8之間，定量測定在0.30.5之間；不與待測組分或吸附劑發生化學反應；沸點適中，黏度較

28、小；展開后組分斑點圓且集中；混合溶劑最好用新鮮配制。一般來說，弱極性溶劑體系的基本兩相由正己烷和水組成，再根據需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯來調節溶劑系統的極性，以達到好的分離效果，適合于生物堿、黃酮、萜類等的分離；中等極性的溶劑體系由氯仿和水基本兩相組成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調節，適合于蒽醌、香豆素，以及一些極性較大的木脂素和萜類的分離；強極性溶劑，由正丁醇和水組成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調節，適合于極性很大的生物堿類化合物的分離。很多時候,展開劑的選擇要靠自己不斷變換展開劑的組成來達到最佳效果。我們在實驗中，為了實現一個配體與其他雜質有效分離，曾經嘗試了很多種的溶劑組合，最后才找

29、到石油醚EtOAcHCOOH（5.5：3.5：0.1）混合溶劑。一般把兩種溶劑混合時,采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑,如果有分開的跡象,再調整比例（或者加入第三種溶劑）,達到最佳效果；如果沒有分開的跡象（斑點較“拖”），最好是換溶劑。對于在硅膠中這種酸性物質上易分解的物質，在展開劑里往往加一點點三乙胺，氨水，吡啶等堿性物質來中和硅膠的酸性。（選擇所添加的堿性物質，還必須考慮容易從產品中除去，氨水無疑是較好的選擇。）分離效果的好壞和所用硅膠和溶劑的質量很有關系：不同廠家生產的硅膠可能含水量以及顆粒的粗細程度，酸性強弱不同，從而導致產品在某個廠家的硅膠中分離效果很好，但在另一個廠家的

30、就不行。溶劑的含水量和雜質含量對分離效果都有明顯的影響。溫度，濕度對分離效果影響也很明顯，在實驗中我們發現有時同一展開條件，上下午的Rf截然不同展開劑的選擇主要根據樣品的極性、溶解度和吸附劑的活性等因素來考慮在進行薄層層析時，首先應該知道未知化學成分的類型，其極性的大致歸屬，從提取液或從色譜柱的流動相極性可知，另外某樣品里含多種化學成分先按極性不同大致分，然后細分，對于分離未知的化學物質，展開劑的選擇也是一個摸索的過程，不應該僅僅從展開劑考慮，多因素綜合衡量！溶劑：層析過程中溶劑的選擇，對組分分離關系極大。在柱層析時所用的溶劑（單一劑或混合溶劑）習慣上稱洗脫劑，用于薄層或紙層析時常稱展開劑。洗

31、脫劑的選擇，須根據被分離物質與所選用的吸附劑性質這兩者結合起來加以考慮在用極性吸附劑進行層析時，當被分離物質為弱極性物質，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑；被分離物質為強極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對某一極性物質用吸附性較弱的吸附劑（如以硅藻土或滑石粉代替硅膠），則洗脫劑的極性亦須相應降低。在柱層操作時，被分離樣品在加樣時可采用于法，亦可選一適宜的溶劑將樣品溶解后加入。溶解樣品的溶劑應選擇極性較小的，以便被分離的成分可以被吸附。然后漸增大溶劑的極性。這種極性的增大是一個十分緩慢的過程，稱為“梯度洗脫”，使吸附在層析柱上的各個成分逐個被洗脫。如果極性增大過訣（梯度太大），就不能獲得滿意的分

32、離。溶劑的洗脫能力，有時可以用溶劑的介電常數（）來表示。介電常數高，洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅適用于極性吸附劑，如硅膠、氧化鋁。對非極性吸附劑，如活性炭，則正好與上述順序相反，在水或親水住溶劑中所形成的吸附作用，較在脂溶性溶劑中為強。3被分離物質的性質：被分離的物質與吸附劑，洗脫劑共同構成吸附層析中的三個要素，彼此緊密相連。在指定的吸附劑與洗脫劑的條件下，各個成分的分離情況，直接與被分離物質的結構與性質有關。對極性吸附劑而言，成分的極性大，吸附住強。 當然，中草藥成分的整體分子觀是重要的，例如極性基團的數目愈多，被吸附的住能就會更大些，在同系物中碳原子數目少些，被吸附也會強些。總之，只要兩

33、個成分在結構上存在差別，就有可能分離，關鍵在于條件的選擇。要根據被分離物質的性質，吸附劑的吸附強度，與溶劑的性質這三者的相互關系來考慮。首先要考慮被分離物質的極性。如被分離物質極性很小為不含氧的萜烯，或雖含氧但非極性基團，則需選用吸附性較強的吸附劑，并用弱極性溶劑如石油醚或苯進行洗脫。但多數中藥成分的極性較大，則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑（一般級）。采用的洗脫劑極性應由小到大按某一梯度遞增，或可應用薄層層析以判斷被分離物在某種溶劑系統中的分離情況。此外，能否獲得滿意的分離，還與選擇的溶劑梯度有很大關系。現以實例說明吸附層析中吸附劑、洗脫劑與樣品極性之間的關系。如有多組分的混合物，象植物油脂系

34、由烷烴、烯烴、舀醇酯類、甘油三酸醋和脂肪酸等組份。當以硅膠為吸附劑時，使油脂被吸附后選用一系列混合溶劑進行洗脫，油脂中各單一成分即可按其極性大小的不同依次被洗脫。 又如對于C-27甾體皂甙元類成分，能因其分字中羥基數目的多少而獲得分離：將混合皂甙元溶于含有5氯仿的苯中，加于氧化鋁的吸附柱上，采用以下的溶劑進行梯度洗脫。如改用吸附性較弱的硅酸鎂以替代氧化鋁，由于硅酸鎂的吸附性較弱，洗脫劑的極牲需相應降低，亦即采用苯或含5氯仿的苯，即可將一元羥基皂甙元從吸附劑上洗脫下來。這一例子說明，同樣的中草藥成分在不同的吸附劑中層析時，需用不同的溶劑才能達到相同的分離效果，從而說明吸附劑、溶劑和欲分離成分三者

35、的相互關系。3、薄層色譜在中草藥中的應用薄層層析是一種簡便、快速、微量的層析方法。一般將柱層析用的吸附劑撒布到平面如玻璃片上，形成一薄層進行層析時一即稱薄層層析。其原理與柱層析基本相似。 （1）薄層層析的特點：薄層層析在應用與操作方面的特點與柱層析的比較。 （2）吸附劑的選擇：薄層層析用的吸附劑與其選擇原則和柱層析相同。主要區別在于薄層層析要求吸附劑（支持劑）的粒度更細，一般應小于250目，并要求粒度均勻。用于薄層層析的吸附劑或預制薄層一般活度不宜過高，以級為宜。而展開距離則隨薄層的粒度粗細而定，薄層粒度越細，展開距離相應縮短，一般不超過10厘米，否則可引起色譜擴散影響分離效果。 （3）展開劑

36、的選擇：薄層層析，當吸附劑活度為一定值時（如或級），對多組分的樣品能否獲得滿意的分離，決定于展開劑的選擇。中草藥化學成分在脂溶性成分中，大致可按其極性不同而分為無極性、弱極性、中極性與強極性。但在實際工作中，經常需要利用溶劑的極性大小，對展開劑的極性予以調整。 （4）特殊薄層：針對某些性質特殊的化合物的分離與檢出，有時需采用一些特殊薄層。 熒光薄層：有些化合物本身無色，在紫外燈下也不顯熒光，又無適當的顯色劑時，則可在吸附劑中加入熒光物質制成熒光薄層進行層析。展層后置于紫外光下照射，薄層板本身顯熒光，而樣品斑點處不顯熒光，即可檢出樣品的層析位置。常用的熒光物質多為無機物。其一是在254nm紫外光

37、激發下顯出熒光的，如錳激潔的硅酸鋅。另一種為在365nm紫外光激發下發出熒光的，如銀激化的硫化鋅硫化鎬。 絡合薄層：常用的有硝酸銀薄層，用來分離碳原子數相等而其中C一C雙鍵數目不等的一系列化合物，如不飽和醇、酸等。其主要機理是由于C一C鍵能與硝酸銀形成絡合物，而飽和的C一C鍵則不與硝酸銀絡合。因此在硝酸銀薄層上，化臺物可由于飽和程度不同而獲得分離。層析時飽和化合物由于吸附最弱而Rf最高，含一個雙鍵的較含兩個雙鍵的Rf值高，含一個三鍵的較含一個雙鍵的Rf值高。此外，在一個雙鍵化臺物中，順式的與硝酸銀絡合較反式的易于進行。因此，還可用來分離順反異構體。 酸堿薄層和PH緩沖薄層：為了改變吸附劑原來的

38、酸堿性，可在鋪制薄層時采用稀酸或稀堿以代替水調制薄層。例如硅膠帶微酸性，有時對堿性物質如生物堿的分離不好，如不能展層或拖尾，則可在鋪薄層時，用稀堿溶液0.105NNa0H溶液制成堿性硅膠薄層。例如豬屎豆堿在以硅膠為吸附劑時，以氯仿-丙酮一甲醇（8：2：1）為展開劑Rf01，采用堿性硅膠薄層用上述相同展開劑，Rf值增至04左右。說明豬屎豆堿為-堿性生物堿。 （5）應用：薄層層析法在中草藥化學成分的研究中，主要應用于化學成分的預試、化學成分的鑒定及探索柱層分離的條件。 用薄層層析法進行中草藥化學成分預試，可依據各類成分性質及熟知的條件，有針對性地進行。由于在薄層上展層后，可將一些雜質分離，選擇性高

39、，可使預試結果更為可靠。（6）中草藥中的應用 以薄層層析法進中草藥化學成分鑒定，最好要有標準樣品進行共薄層層析。如用數種溶劑展層后，標準品和鑒定品的Rf值、斑點形狀顏色都完全相同，則可作初步結論是同一化合物。但一般需進行化學反應或紅外光譜等一種儀器分析方法加以核對。 用薄層層析法探索柱層分離條件，是實驗室的常規方法。在進行柱層分離時，首先考慮選用何種吸附劑與洗脫劑。在洗脫過程中各個成分將按何種順序被洗脫，每一洗脫液中是否為單一成分或混合體，均可由薄層的分離得到判斷與檢驗。通過薄層的預分離，還可以了解多組分樣品的組成與相對含量。如在薄層上摸索到比較滿意的分離條件，即可將此條件用于干柱層析。但亦可

40、以將薄層分離條件經適當改變，轉至一般往層所采用洗脫的方式進行制備柱分離。利用薄層的預分離尋找柱層的洗脫條件時,假定在薄層上所測得的Rf值一樣品在柱層中的比移率（R）。這是由于在薄層展開時，薄層固定相中所含的溶劑經過不斷的蒸發，而使薄層上各點位置所含的溶劑量是不等的，靠近起始線的含量高于薄層的前沿部分。但若嚴格控制層析操作條件，則可得到接近真實的Rf值。用薄層進行某一組分的分離，其Rf值范圍，一般情形下為085Rf005。此外，薄層層析法亦應用于中草藥品種、藥材及其制劑真偽的檢查、質量控制和資源調查，對控制化學反應的進程，反應副產品產物的檢查，中間體分析，化學藥品及制劑雜質的檢查，臨床和生化檢驗

41、以及毒物分析等，都是有效的手段。選擇適當的展開劑是首要任務.一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概為：石油迷&lt;己烷&lt;苯&lt;乙醚&lt;THF&lt;乙酸乙酯&lt;丙酮&lt;乙醇&lt;甲醇使用單一溶劑，往往不能達到很好的分離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個高極性和低級性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區分度的作用，常用的溶劑組合有 Petroleumether/Ethylacetate, petroleumether/Acetone, Petroleumether/Ether, Petroleum

42、ether/CH2Cl2, ethylacetate/MeOH, CHCl3/ethylacetate 展開劑的比例要靠嘗試.一般根據文獻中報道的該類化合物用什么樣的展開劑，就首先嘗試使用該類展開劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個分離效果好的展開劑。展開劑的選擇條件：對的所需成分有良好的溶解性；可使成分間分開；待測組分的Rf在0.20.8之間，定量測定在0.30.5之間；不與待測組分或吸附劑發生化學反應；沸點適中，黏度較小；展開后組分斑點圓且集中；混合溶劑最好用新鮮配制。 一般來說，弱極性溶劑體系的基本兩相由正己烷和水組成，再根據需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯來調節溶劑系統的極性，以達到好的分離

43、效果，適合于生物堿、黃酮、萜類等的分離；中等極性的溶劑體系由氯仿和水基本兩相組成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調節，適合于蒽醌、香豆素，以及一些極性較大的木脂素和萜類的分離；強極性溶劑，由正丁醇和水組成，也靠甲醇、乙醇，乙酸乙酯等來調節，適合于極性很大的生物堿類化合物的分離。 很多時候,展開劑的選擇要靠自己不斷變換展開劑的組成來達到最佳效果。 我們在實驗中，為了實現一個配體與其他雜質有效分離，曾經嘗試了很多種的溶劑組合，最后才找到石油醚EtOAcHCOOH（5.5：3.5：0.1）混合溶劑。一般把兩種溶劑混合時,采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑,如果有分開的跡象,再調整比例（或者加入

44、第三種溶劑）,達到最佳效果；如果沒有分開的跡象（斑點較“拖”），最好是換溶劑。對于在硅膠中這種酸性物質上易分解的物質，在展開劑里往往加一點點三乙胺，氨水，吡啶等堿性物質來中和硅膠的酸性。（選擇所添加的堿性物質，還必須考慮容易從產品中除去，氨水無疑是較好的選擇。）分離效果的好壞和所用硅膠和溶劑的質量很有關系：不同廠家生產的硅膠可能含水量以及顆粒的粗細程度，酸性強弱不同，從而導致產品在某個廠家的硅膠中分離效果很好，但在另一個廠家的就不行。溶劑的含水量和雜質含量對分離效果都有明顯的影響。溫度，濕度對分離效果影響也很明顯，在實驗中我們發現有時同一展開條件，上下午的Rf截然不同展開劑的選擇主要根據樣品的

45、極性、溶解度和吸附劑的活性等因素來考慮在進行薄層層析時，首先應該知道未知化學成分的類型，其極性的大致歸屬，從提取液或從色譜柱的流動相極性可知，另外某樣品里含多種化學成分先按極性不同大致分，然后細分，對于分離未知的化學物質，展開劑的選擇也是一個摸索的過程，不應該僅僅從展開劑考慮，多因素綜合衡量！ 溶劑：層析過程中溶劑的選擇，對組分分離關系極大。在柱層析時所用的溶劑（單一劑或混合溶劑）習慣上稱洗脫劑，用于薄層或紙層析時常稱展開劑。洗脫劑的選擇，須根據被分離物質與所選用的吸附劑性質這兩者結合起來加以考慮在用極性吸附劑進行層析時，當被分離物質為弱極性物質，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑；被分離物質為強極性

46、成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對某一極性物質用吸附性較弱的吸附劑（如以硅藻土或滑石粉代替硅膠），則洗脫劑的極性亦須相應降低。 在柱層操作時，被分離樣品在加樣時可采用于法，亦可選一適宜的溶劑將樣品溶解后加入。溶解樣品的溶劑應選擇極性較小的，以便被分離的成分可以被吸附。然后漸增大溶劑的極性。這種極性的增大是一個十分緩慢的過程，稱為“梯度洗脫”，使吸附在層析柱上的各個成分逐個被洗脫。如果極性增大過訣（梯度太大），就不能獲得滿意的分離。溶劑的洗脫能力，有時可以用溶劑的介電常數（）來表示。介電常數高，洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅適用于極性吸附劑，如硅膠、氧化鋁。對非極性吸附劑，如活性炭，則正好與

47、上述順序相反，在水或親水住溶劑中所形成的吸附作用，較在脂溶性溶劑中為強。 3被分離物質的性質：被分離的物質與吸附劑，洗脫劑共同構成吸附層析中的三個要素，彼此緊密相連。在指定的吸附劑與洗脫劑的條件下，各個成分的分離情況，直接與被分離物質的結構與性質有關。對極性吸附劑而言，成分的極性大，吸附住強。 當然，中草藥成分的整體分子觀是重要的，例如極性基團的數目愈多，被吸附的住能就會更大些，在同系物中碳原子數目少些，被吸附也會強些。總之，只要兩個成分在結構上存在差別，就有可能分離，關鍵在于條件的選擇。要根據被分離物質的性質，吸附劑的吸附強度，與溶劑的性質這三者的相互關系來考慮。首先要考慮被分離物質的極性。

48、如被分離物質極性很小為不含氧的萜烯，或雖含氧但非極性基團，則需選用吸附性較強的吸附劑，并用弱極性溶劑如石油醚或苯進行洗脫。但多數中藥成分的極性較大，則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑（一般級）。采用的洗脫劑極性應由小到大按某一梯度遞增，或可應用薄層層析以判斷被分離物在某種溶劑系統中的分離情況。此外，能否獲得滿意的分離，還與選擇的溶劑梯度有很大關系。現以實例說明吸附層析中吸附劑、洗脫劑與樣品極性之間的關系。如有多組分的混合物，象植物油脂系由烷烴、烯烴、舀醇酯類、甘油三酸醋和脂肪酸等組份。當以硅膠為吸附劑時，使油脂被吸附后選用一系列混合溶劑進行洗脫，油脂中各單一成分即可按其極性大小的不同依次被洗脫。又

49、如對于C-27甾體皂甙元類成分，能因其分字中羥基數目的多少而獲得分離：將混合皂甙元溶于含有5氯仿的苯中，加于氧化鋁的吸附柱上，采用以下的溶劑進行梯度洗脫。如改用吸附性較弱的硅酸鎂以替代氧化鋁，由于硅酸鎂的吸附性較弱，洗脫劑的極牲需相應降低，亦即采用苯或含5氯仿的苯，即可將一元羥基皂甙元從吸附劑上洗脫下來。這一例子說明，同樣的中草藥成分在不同的吸附劑中層析時，需用不同的溶劑才能達到相同的分離效果，從而說明吸附劑、溶劑和欲分離成分三者的相互關系。三、顯色方法（一）. 概述一看、二照、三碘、四顯，熒光背景也常見A: 首先在日光下觀察，劃出有色物質的斑點位置B: 在紫外燈下觀察有無暗斑或熒光斑點C:

50、大部分有機物會吸附碘可逆的產生棕色或黃色斑點。D: 熒光薄板檢測，觀察熒光薄板中出現的暗斑。E: 既無色又無紫外吸收的物質，可以用顯色劑顯色顯色劑可以分成兩大類：一類是檢查一般有機化合物的通用顯色劑；另一類是根據化合物分類或特殊官能團設計的專屬性顯色劑。（二）通用顯色劑硫酸常用的有四種溶液：硫酸-水(1：1)溶液；硫酸-甲醇或乙醇(1：1)溶液；1.5molL硫酸溶液與0.5-1.5molL硫酸銨溶液，噴后110烤15min，不同有機化合物顯不同顏色。0.5碘的氯仿溶液 對很多化合物顯黃棕色。中性0.05高錳酸鉀溶液 易還原性化合物在淡紅背景上顯黃色。堿性高錳酸鉀試劑 還原性化合物在淡紅色背景

51、上顯黃色。溶液I：1高錳酸鉀溶液；溶液：5碳酸鈉溶液；溶液I和溶液等量混合應用。酸性高錳酸鉀試劑 噴1.6高錳酸鉀濃硫酸溶液(溶解時注意防止爆炸)，噴后薄層于180加熱1520min。酸性重鉻酸鉀試劑 噴5重鉻酸鉀濃硫酸溶液，必要時150烤薄層。5磷鉬酸乙醇溶液 噴后120烘烤，還原性化合物顯藍色，再用氨氣薰，則背景變為無色。鐵氰化鉀-三氯化鐵試劑 還原性物質顯藍色，再噴2molL鹽酸溶液，則藍色加深。溶液I：1鐵氰化鉀溶液；溶液：2三氯化鐵溶液；臨用前將溶液I和溶液等量混合。（三）. 專屬性顯色劑由于化合物種類繁多，因此專屬性顯色劑也是很多的，現將在各類化合物中最常用的顯色劑列舉如下： (1

52、)烴類 硝酸銀過氧化氫 檢出物：鹵代烴類。 溶液：硝酸銀O.1g溶于水lml，加2-苯氧基乙醇lOOml，用丙酮稀釋至200ml，再加30過氧化氫1滴。 方法：噴后置未過濾的紫外光下照射； 結果：斑點呈暗黑色。 熒光素溴 檢出物：不飽和烴。 溶液：I熒光素0.1g溶于乙醇lOOml； 5溴的四氯化碳溶液。 方法：先噴(I)，然后置含溴蒸氣容器內，熒光素轉變為四溴熒光素(曙紅)，熒光消失，不飽和烴斑點由于溴的加成，阻止生成曙紅而保留熒光，多數不飽和烴在粉紅色背景上呈黃色。 四氯鄰苯二甲酸酐檢出物：芳香烴。 溶液：2四氯鄰苯二甲酸酐的丙酮與氯代苯(10：1)的溶液。 方法：噴后置紫外光下觀察。 甲

53、醛硫酸 檢出物：多環芳烴。 溶液：37甲醛溶液O.2ml溶于濃硫酸l0ml。 (2)醇類 3，5一二硝基苯酰氯 檢出物：醇類。 溶液：I2本品甲苯溶液； 0.5氫氧化鈉溶液； O.002羅丹明溶液。 方法：先噴(I)，在空氣中干燥過夜，用蒸氣薰2min，將紙或薄層通過試液()30s，噴水洗，趁濕通過()15s，空氣干燥，紫外燈下觀察。硝酸鈰銨檢出物：醇類。溶液：I1硝酸鈰銨的0.2molL硝酸溶液； N,N-二甲基-對苯二胺鹽酸鹽1.5g溶于甲醇、水與乙酸(128m1+25m1+15m1)混合液中，用前將(I)與()等量混合。噴板后于105oC加熱5min。香草醛硫酸檢出物：高級醇、酚、甾類及

54、精油。溶液：香草醛1g溶于硫酸lOOml。方法：噴后于120oC加熱至呈色最深。二苯基苦基偕肼 檢出物：醇類、萜烯、羰基、酯與醚類。溶液：本品15mg溶于氯仿25ml中。方法：噴后于110oC加熱5lOmin。結果：紫色背景呈黃色斑點。(3)醛酮類品紅亞硫酸檢出物：醛基化合物。溶液：I0.01%品紅溶液，通入二氧化硫直至無色； 0.05molL氯化汞溶液； O.05molL硫酸溶液。 方法：將I、以1：1：10混合，用水稀釋至l00m鄰聯茴香胺 檢出物：醛類、酮類。溶液：本品乙酸飽和溶液。2，4-二硝基苯肼檢出物：醛基、酮基及酮糖。溶液：I0.4本品的2molL鹽酸溶液；本品O.1g溶于乙醇l

55、00ml中，加濃鹽酸lml。方法：噴溶液I或后，立即噴鐵氰化鉀的2molL鹽酸溶液。結果：飽和酮立即呈藍色；飽和醛反應慢，呈橄欖綠色；不飽和羰基化合物不顯色。繞丹寧檢出物：類胡蘿卜素醛類。溶液：I1%5%繞丹寧乙醇溶液； 25%氫氧化銨或27%氫氧化鈉溶液。方法：先噴溶液I，再噴溶液，干燥。(4)有機酸類溴甲酚綠檢出物：有機酸類。溶液：溴甲酚綠0.1g溶于乙醇500ml和0.1mol/L氫氧化鈉溶液5ml。方法：浸板。結果：藍色背景產生黃色斑點。高錳酸鉀硫酸檢出物：脂肪酸衍生物。溶液：見通用顯色劑酸性高錳酸鉀。過氧化氫檢出物：芳香酸。溶液：0.3%過氧化氫溶液。方法：噴后置紫外光(365nm)下觀察。結果：呈強藍色熒光。2，6-二氯苯酚-靛酚鈉檢出物：有機酸與酮酸。溶液：0.1%本品的乙醇溶液。方法：噴后微溫。結果：藍色背景呈紅色。(5)酚類Emerson 試劑(4-氨基安替比林鐵氰化鉀()檢出物：酚類、芳香胺類及揮發油。溶液：I4-氨基安替比林1g溶于乙醇100ml； 鐵氰化鉀()4g溶于水50ml，用乙醇稀釋至100ml。方法：先噴溶液I，在熱空氣中干燥5min，再噴溶液，再于熱空氣中干燥5min，然后將板置含有氨蒸氣(25氨溶液)的密